Produktie van ß-interferon met behulp van E. Coli: Hergebruik van hulpstoffen

,lrti

T

U

'

Delft

·

Ff/03/.2.od

2S

-

~j<l9t;

-

~

P..L-8v.

.

3/~ ~

o

o

o

o

o

o

o

o

FVO Nr.

I

3120D

I

Fabrieksvoorontwerp

Vakgroep Bioprocestechnologie

Onderwerp

FABRIEKSVOORONTWERP voor de

PRODUKTIE van ,B-INTERFERON

met behulp van

E. COL!;

Hergebruik van hulpstoffen

AANVULLING

Auteurs

P.H.M. Vrijkorte

Piet Heinstraat 135 2518 CG Den Haag

H. M van Veldhuizen

Zandhofsestraat 78 3572 GJ Utrecht

Keywords

Telefoon

070-3616822

030-718453

#-interferon, oxidatie, reductie,

hulpstoffen, d i t h i o t h r e i t o l , sodiumdodecylsulfaat, ureum

Datum opdracht

Datum verslag

januari

1995

januari

1995

INLEIDING

Voor u ligt een aanvulling op het verslag van het fabrieksvoorontwerp van de produktie van fj-Interferon met behulp van E.coli van december 1994. Het belangrijkste onderdeel van deze aanvulling is de aanvulling op hoofdstuk 5 Apparatuurberekeningen. Voor elk onderdeel van dit hoofdstuk zijn de functies, eisen, in- en uitgaande stromen, aannamen en

berekeningsmeth~dieken op een rijtje gezet. Tevens zijn de literatuurbronnen aangegeven. Verder is er een symbolenliist bijgevoegd, die in het oorspronkelijke verslag ontbrak en is de literatuurlijst in z'n geheel opgenomen, omdat de lijst in het oorspronkelijke verslag een aantal bronnen miste en tevens een aantal niet gebruikte bronnen vermelde. Tenslotte volgt hieronder de inhoud van deze aanvulling in het kort:

Inhoud:

Aanvulling op hoofdstuk 5 Symbolenlij st

/

Aanvulling op hoofdstuk 5.2: de fermentor (RIOl) Functie:

In de Jermentor worden de micro-organisIl!.~n gekweekt, waarin interferon in de vorm van inclusion bodies is opgeslagen. Daarbij moeten omstandigheden en het groei-trajekt dusdanig worden gekozen dat een optimaal proces in de tijd wordt gerealiseerd.

ingaande stromen of hulp stromen: produktstroom: afvalstroom: Eisen: #104; lucht ~ / )

#105; octanol voor beeindigen fermentatie

V

#106; fosfaatbuffer -c

#107; glucose _

#108; medium

#109; hierin bevinden zich alle medium-componenten en de gekweekte cellen

#110; niet omgezet zuurstof en gevormd kooldioxide worden _ ~

3

af gegast

~

~

/

~

- er moet 49.5 kg biomassa worden geproduceerd, in een watervolume van 3.72 m 3 - glucose' wordt ats koolstotbron en energiebron gebruikt en is de limiterende )

component. Glucose wordt fed-batch toegevoerd.

0

(1

3

,

3

Aannamen fermentor:

Bij het ontwerpen van de fermentor is gebruik gemaakt van van 't Riet (1991). Voor de afmetingen van de fermentor wordt gekozen voor een standaard configuratie met een zesbladige turbine-roerder op een afstand D van de bodem en met keerschotten:

H = 2·Ty ,

D = 0.33·Ty,

Hs = 0.2·D,

met = hoogte van de fermentor in m, = diameter van de roerder in m, = diameter van de fermentor in m, = hoogte van het roerderblad in m.

Er wordt t één roerder werkt om de mengtijd zo kort mogelijk te houden. Bij het gebruik van re turbineroerders ontstaat het gevaar van compartiment-vorming, waarbij de-uitwisseling tussen de compartimenten te kort kan schIeten met de mogelijkheid van de vorming van zuurstof-gradiënten. Een ander belangrijk voordeel bij het nemen van één roerder is de relatief eenvoudige modellering van de stofoverdrachtsprocessen om toch een redelijke schatting te krijgen van dit apparaat.

Aannamen rondom het micro-organisme.

Het micro-organisme

Cw...Q...)

waarmee het p-IFN wordt geproduceerd is een genetisch gemanipuleerde E. eoU van de stam K12. Bij de fermentatie zal p-IFN in "inclusion

bodies " ~orden opgeslagen. Op basis van de gegevens van Chiron' is de celconcentratie aan

L

het einde van de fermentatie 13.3

gil

en een cel blijkt dan te bestaan ';lito

1'$,3

~, -I>

Lr-,.

')

!.:::

55 % ovenge eIWItten, .~

40% celwandmateriaal,

5% "inclusion bodies", bestaande uit 40% DNA en endotoxines

+

60% p-IFN. Voor de gemiddelde biomassa samenstelling wordt genomen (van 't Riet 1991):

CHl.770o.49No.22So.004sPo.ooss. De totale reactievergelijking voor de vorming van biomassa, inclusief "inclusion bodies" kan berekend worden door de voor het m.o. belangrijkste nutrienten mee te nemen. Er wordt gekozen voor: glucose, ammonium, sulfaat, diwaterstoffosfaat, biomassa, bicarbonaat, protonen, water en zuurstof. Dit zijn negen stoffen, waarvoor zeven behoudswetten opgesteld kunnen worden. Er blijven twee

vrijheidsgraden over. De yield van biomassa op substraat wordt ruwweg geschat op: Y xs =

0.5. En met deze veronderstelling kan dè reactievergelijking opgelost worden: .

-03~C1-T 0 - 022·NH- - 0.0045·S01

- - 0.0055·Hi'0~ - 0.954-01 +

6"~11" 4 _ 4 .

CH 0 1IT S P + HCO' + 1.2055·H- + 0.458·Hp - 0

1.77 0.49' • 0.12 o.OO4~ O.OO!S 3

'"'\ Een negatieve coëfficiënt geeft aan dat de betreffende stof geconsumeerd wordt; een

( / positieve coëfficiënt dat de stof gevormd

wordt

~

~

~

~,

_

: In dit proces ligt de

overal1-Yield

~

Or

het

verkrij~~

'

400

g p-IFN en een

\

celdichtheid van 1: . I is een v'tSiistQ.H"olume va 3-:- 2 m3 _{nodig, welke' een biomassa-}

n

opbrengst va 49. g-p re' enen via- chatte yield van biomassa ( op substraat enodigde hoevee el · ~ n: 99 ,kg

ooi

de groei. In de

ermen zelf wordt de glucose concentrat~e op 7.5 gil g Jl. Dit geeft op het ei.nd: 27.9 kg ucose. Verder worclt geschat dat ongeveer-5.7 kg glucose wordt gebruikt voor mamt nee, zodat in totaal: 132.6 kg glucose per

b~

nodig is.

~.

Na het raadplegen van Atkinson (1991) werden er waarden genomen voor het groei-traject van de bacterie. Deze trajecten zijn weergegeven in tabel 5.1 met de groei-parameters. Er wordt verondersteld dat de groei in de exponentiële en de produkt-fase met Monod-kinetiek kan worden beschreven:

met IJ. = groeisnelheid in lIh,

IJ.max = maximale groeisnelheid in lIh, Ks = Monod-constante in kg/m3_,

S = substraatconcentratie in kg/m3_•

In de "lag phase" zal geen groei plaats vinden.

__

k~t.. tt

,.

"

Tabel 5.2.1. De verschillende kweek-stadia van de gebruikte E. coli.

tijd in [h] Ilmax in [l/h]

"Iag-phase" 5

o

exponentiële-fase 18 0.4

produkt-fase 6 0.1

De overige groei-parameters worden constant genomen gedurende de fermentatie:

Ks

= 6.8.10-2 ms = 0.012 Y_xs = 0.5 mg/l, kg substraat/(kg biomassa·h), kg biomassa/kg substraat.

Uit de patenten (zie literatuuroverzicht) volgen de aanbevelingen voor het bedrijven van de fermentatie bij 37°C onder 2 bar. De substraat-concentratie, glucose, kan het beste liggen

tussen de 5 tot 10 gIl met een opgeloste zuurstof-concentratie van 40

%

van het maximaal

haalbare. Uit de keuze van de batch-grootte volgt dat er elke run 49.5 kg biomassa gemaakt moet worden. Terugrekenen geeft een benodigde ent van 20 g biomassa per batch.

Aannamen rondom de stofoverdrachtsprocessen

Voor de maximale zuurstofconcentratie in zuiver water volgt uit Binas bij 310 K en 1 bar

zuivere zuurstof:

cot

= 35 mg/I. Met behulp van de Henry-coëfficiënt volgt dan de

maximale zuurstofconcentratie in water als functie van de partiaalspanning van de zuurstof in de lucht (=0.4 bar bij 2 bar druk in de fermentor):

Po,

Col =

-H

met H

=

Henry-coëfficiënt, bij 310 K: H

=

2.96.103 _Pa·l/mg.

Verder wordt verondersteld, dat in de fermentor als gevolg van de toevoeging van

voeding stoffen en de aanwezigheid van m.o. maximaal 90% van de maximale

zuurstofconcentratie gehaald kan worden: Col,fermento/ = 12.2 mg/I.

~

--De zuurstofconcentratie in de fermentor wordt op 40 % van de maximaal haalbare

concentratie gehouden: Col = 5.4 mg/I. Verder wordt er vanuit gegaan dat de uitputting van

~

de luchtbellen verwaarloosd mag worden en dat de weerstand voor stof overdracht volledig aan de vloeistofzijde ligt.

Om de celculture glucose gelimiteerd en niet zuurstof gelimiteerd te laten groeien zal de

hoeveelheid zuurstof die met de lucht in de fermentor wordt gebracht gelijk moeten zijn aan

de hoeveelheid zuurstof, die door de m.o. wordt opgenomen: OTR = OUR.

1

ingebrachte vermogen nooit groter mag zijn dan het vermogen ingebracht door de roerder om flooding te voorkomen.

De aan~amen rondom de warmteoverdrachtsprocessen.

Er moet voor gezorgd worden dat de weerstand voor warmteoverdracht aan de kant van de fermentor ligt. Dit geeft eisen voor de snelheid van de koelwater stroom door de

koelspiraal. De temperatuur van de ingaande luchtstroom wordt geschat op 60

oe

met een luchtvochtigheid van 0.05 kg/m3

• De wand van de fermentor is van roestvast staal met een

wamte-overdrachtscoëfficiënt van 80 W /(Km) en een dikte van 5 cm.

Aanvulling op hoofdstuk 5.3: microfiltratie en diafiltratie (FI03) Functie:

Nadat de fermentatie is beeindigd, moeten de verkregen cellen worden geoogst en vervolgens moet de verkregen suspensie worden gewassen. Op deze manier wordt de concentratie van de medium-componenten dusdanig verlaagd dat ze geen invloed meer hebben op verdere opwerkingsstappen. De meest geschikte methode voor concentratie is

het gebruik van cross-flow-microfiltratie. T.o.v. dead-end filtratie biedt dit het voordeel

dat er geen koek-vorming optreedt, waardoor het benodigde drukverschil om een flux op te wekken constant kan worden gehouden. Tevens biedt het gebruik van membranen t.o.v. centrifuges de hoogste garantie om containment te voorkomen Het uitwassen van

medium-componenten gebeurt via diafiltratie. ~ I " <::::::>

I

't~ -"'> ~~ ' "

el

'

ingaande stroom:

~

evat

alle componenten die tijdens fermentatie

/It

~

~~ormd

produktstroom of concentraat: #114; bevat alle cellen, waarin interferon in de vorm

van incfusion bodies is opgeslagen

afvalstroom of permeaat: #116; bevat alle componenten die tijdens fermentatie

zijn gevormd-behalve de cellen

Eisen:

- de oplossing verkregen na de fermentatie moet geconcen~reerd worden t0k-W0 gIl

- deze geconcentreerde oplossing moet voor minimaal 95 % ontdaan worden van de nog

aanwezige zouten en andere laag molekulaire componenten: dit vindt plaats tijdens de

diafiltratie.

Aannamen:

- voor de beschrijving van de flux door het membraan wordt gebruik gemaakt van de concentratie polarisatie theorie [H,anish, 1986 en Flaschel et al., 1983]

- de permeaat-conce,ntratie (= concentratie cellen in permeaat): Cp = O.

- de gel-concentratie (concentratie cellen aan het membraan): C_g=500 kg/m3

•

- de stroming in een membraanfiber moet turbulent zijn: op grond hiervan worden de dimensies van een fiber gekozen

"

- de viscositeit van de celsuspensie is concentratie-afhankelijk [Advanced Course on

Downstream Processing, 1994, deel I, 2.17]

Voor de berekeningen zijn de volgende vergelijkingen nodig [BPS BioProcess Simulator, release 3.2, Us er Guide Volume 11, chapter 8: Membrane Filter]:

beschrijving flux: zie foqnule (5.18)

stofoverdrachts coëfficiënt: zie fommie (5.21), uit Us er Guide axiale drukval: zIe formule (5.22), uit User Guide

aanname turbulente stroming: zie formule (5.23) [perry]

viscositeit als functie van de celconcentratie: zie fornmle (5.24)

volume van het concentraat en de celconcentratie wordt berekend volgens: dV • -A.J dt op t=O geldt:

v

=

V_o

=

3.9 m3 Cb = CbO = 13.3 kg/m3 en op t = 't concentreren: '"'\-l---....-w-_c-_on-_c-:...= C_bO /Cbconc *V_o C b = Cbconc = 100 kg/m3 (5.25a) (5.25b)

N adat de suspensie is geconcentreerd tot 100 kg/m3

, wordt er gewassen. Het volume dat

nodig is voor het verwijderen van zouten met een bepaalde fraktie kan m.b.v. formule (5.26) worden berekend. Deze relatie is gebaseerd op het concentratie-verloop in een continue ideaal geroerde tank reaktor.

De temperatuurstijging tijdens micro- en diafiltratie kan berekend worden met formule (5.34).

Het aantal fibers en het debiet volgt uit het gekozen membraanoppervlak, A, en de gemiddelde stroomsnelheid, u, volgens (5.29) t/m (5.32).

---

-

-,--Aanvulling op hoofdstuk 5.4: De homogenizer (M20!) Functie:

Het d,oel van deze stap is dat door afschuifspanningen de E.coli celwand wordt

kapotgeslagen, zodat de inc1usion bodies, die 60% p-IFN bevatten, vrijkomen.

Eisen:

- de yield die moet worden bereikt bedraagt 87 %

- het aantal passes bedraagt 3

Aannamen:

- het percentage cellen dat wordt kapot geslagen kan bepaald worden volgens formule (5.35) [Sauer, 1989]

- de drukval over de homogenizer kan dusdanig gekozen worden dat wordt voldaan aan

de yield van 87 %

Berekeningsmethodiek:

Voor de disruptie van de E-Coli cellen zal gebruik worden gemaakt van een APV

-Gaulin-homogenizer. De mate van disruptie in zo'n apparaat is afhankelijk van druk, aantal passes

en de concentratie van de drooggewicht cellen. '

De ingangsconcentratie van de drooggewicht cellen wordt bepaald door de vorige unit

operation, nl. micro filtratie en diafiltratie, en is gelijk aan 100 (kg/m3

)..

In de volgende tabel zijn zowel de yield van de gedisrupteerde cellen als de

temperatuurstijging per pass weergegeven als functie van de drukval en het aantal passes:

6P (bar) yield (3passes) yield (2passes) 6T (K per pass)

100 22.0 16.6 2.4 300 68.9 57.5 7.1 400 82.7 72.3 _{9.5 "} 450 87.0 base-case 77.6 10.7 600 95.5 89.7 14.3 700 97.9 94.1 16.6

I

I·

1

Aanvulling op hoofdstuk 5.5: de centrifuge (C201 en

C3

'éV '

Functie:

De centrifuge is in de eerste plaats (C201) bedoeld om de inclusion bodies, die na het homogenizer proces vrijgekomen zijn uit de cellen, op te vangen en te scheiden van andere celingrediënten. Op deze manier vindt al een redelijk grote opzuiveringsstap plaats. Er wordt sucrose toegevoegd om een betere scheiding te bewerkstelligen.

In de tweede plaats dient deze centrifuge (C302) voor het terugwinnen van het precipitaat na de precipitatie in R302'

Eisen:

- Om een vergelijk te maken met de 'base case' dient de centrifuge van het "tubular bowl" type te zijn. De procestijd dient geminimaliseerd te worden en de recovery yield zou 100% moeten zijn. In de praktijk blijkt de scneiding niet optimaal te verlopen daarom is een

recovery yield van 90% gesteld.

p

~

.

- De gegeven afmetrngen zijn standaardafmetingen genome . /

Stromen: C201

ingaande stroom: #203; de voedingstroom die als belangrijke componenten p-IFN (in inclusion bodies) en sucrose bevat.

produktstroom: #209; deze stroom is eigenlijk een hoeveelheid vaste stof die hoofdzakelijk uit inclusion bodies bestaat.

afvalstroom: #206

C302

ingaande stroo.m: produktstroom: Afvalstroom:

#314; de voedingstroom die het precipitaat bevat.

#323; deze stroom is een hoeveelheid vaste stof die hoofdzakelijk uit precipitaat bestaat.

-

9(!12..

.

#324

[

->

J?

Aannamen:

rn

C201: inclusion body recovery

- Het dichtheidsverschil tussen

-

debris en inc1nc_{ion bodies is 220 kg/m3.}

~

-- Hele cellen worden met de fde effiency afgescheiden als de inclusion bodies

z)\;;~l:lkan beschreven worden met 'Richardson en Zaki':!.·' _ _ _ ~

'~~~~~fàiP.JJjr,em,~~ies = OAe-6 m, deel debris = 0.4e-6 3.deelle = 1e-6 m, Peellen= '1100 kg/m3.

C302: precipitaatterugweinning

-;-?., 0

-=--

1!:ëO

~/4-~

- Er hoeft geen rekening gehouden te worden met hindering

- Het dichtheidsverschil tussen p!,ecipitat en de butanologlossing is 300 kg/m3.

Valsnelheid in een zwerm kan beschreven worden met 'Ric dson en z~

200 kg/m ,Pmediu - 90? kg

/

i9

~

Berekeningsmethodiek

De gegeven afmetingen zijn standaardafmetingen genomen uit Perry.

Fonnule 5.37, 5.38 en 5.39 zijn afkomstig uit de Cursus-map van de Advanced Course on Downstream processing, bijdrage 15 van 1. Krijgsman, Solid liquid separation.

I

J

Aanvulling op hoofdstuk 5.6.1: het oplossen en reduceren (R301 en R40l/R402) Functie:

In oplos/reduktie-stap R301 wordt de produktstroom uit de ,ce t· ges (#209)

behandeld. Daarbij worden de condities dusdanig gekozen dat e eiwitten in oplossing

gaan en zich ontvo~wen. Dit is 0 19 om de extraktie-sta 1t Er

wordt dus gekozen voor reducerende omstan 19 ede

_.

_\ TT)

oplosmiddel (SDS-oplossing).

...

'

V~

o~~

ingaande stroom: produktstroom:

#209; afkomstig van centrifuges voor afscheiden inclusion bodies tl~

er is geen produktstroom, omdat dezelfde reaktor ook gebruikt

ie..

11.

wordt voor de extraktie met butanol "f

hulp stromen: #302; SDS, DTT en EDTA worden toegevoegd zodat condities

ideaal zijn voor het oplossen en reduceren van de inclusion bodies.

afvalstroom: geen

---_...-- --_. - ---_. ---_.-

-_

..

_--In de oplosstap R4Ql wordt het afgescheiden precipitaat (#323) in oplossing gebracl;1t en

in reduktiestap R402 worden de in oplossing zijnde eiwitten ontvouwen. .

". . .,;;:::,= -ingaande stroom R401: R402: produktstroom R401 : R402: hulpstroom R401 : R402: Afvalstroom Eisen:

#323; afkomstig van de centrifuge voor afscheiden precipitaat

#407; afkomstig uit het dead-end filter waar de niet opgeloste stoffen worden verwijderd

#405 #421

#403; ureum, EDT A en fosfaat worden toegevoegd om het precipitaat op te lossen

#412; DTT wordt toegevoegd om de eiwitten te ontvouwen (reduceren). Tevens wordt met natronloog de pH geregeld. geen

- 95

%

van de inclusion bodies moet oplossen

~

Aannamen:

- het oplossen van de inclusion bodies gaat relatief snel (geen kinetiek limitaties): korter

dan 1 uur.

- op grond van de extraktie (vindt in hetzelfde vat plaats) wordt de dimensionering van R301 uitgevoerd. De dimensionering van R401 en R402 verloop identiek.

- SDS concentratie is 2 gew%. In de reduktie/oplos stap R402 wordt i.p.v. SDS een 8 M

-ureum oplossing gebruikt, echter dezelfde condities blijven gelden.

- DTT concentratie is-~

- èfvind@n femperatul!f)regeling plaats

- optimale procescon 1 les zijn: ongeveer ~inuten reaktietijd bij een temperatuur van

50 C, daarna afkoelen tot 25 een eH-correctie tot pH 7.0

De dimensionering staat beschreven in hoofdstuk 5.6.1. Echter de functie, de eisen en de aannnamen van de extraktie-stap zijn nog niet vermeld. ~

Q....

'?

~(/~"l..-

.

Functie. extraktie-stap (R301):

De extraktie-stap is bedoeld om het opgeloste inte~feron specifiek in de butanol-fase te krijgen. Voordeel van een extraktie met butanol is dat interferon een gunstIge partItie coefficient heeft t. o. v. van de overige eiwitten. Indien SDS wordt gebruikt is dit effekt

nog sterker.

ingaande stroom: de oplossing die verkregen is na het oplossen van de inclusion bodies, wordt gebruikt als 'voeding' voor de extraktie

hulpstroom: #307; butanol wordt gebruikt voor de extraktie

#308; zouten worden toegevoegd voor het uitzouten van interfe-ron en voor het verlagen van de oplosbaarheid van butanol in water produktstroom: afvalstroom: #312 geen Eisen extraktie-stap:;..--_

- de extraktie _, ...

Qét

word~ voerd in een 1-evenwichtsstap, waarbij de volume-verhoudin water/butanol 1 is.

Aannamen extraktie-stap:

- oplosbaarheid van butanol in water is 10 gew %

- in het verslag staat vanaf pagiI'l:a 5.16 duidelijk beschreven welke methode is gebruikt voor het berekenen van de extraktietijd [diktaat Scheidingsprocessen 11:

vloeistof/vloeistof extractie, R. Stikkelman, TU Delft 1994] en [Wesselingh, J.A., Kleizen, H. H., Scheidingsprocessen, 1990, Delftse Uitgevers Maatschappij: 1990, Delft]. Belangrijke aannamen daarbij zijn:

- bolvormige deeltjes voor de disperse fase

- de Kolmogorov-Hinze vergelijking is geldig (5.41) - aanname Sauter-diameter (5.42) ,

- druppels hebben een constant volume en oppervlak

~.

- afschatting voor druppeldiameter '(belangrijk voor afschatten diffusiecoefficienten via de gemodificeerde Stokes-Einstein relatie)

- uit de gestelde eis volgt dat de yield voor de 1-traps evenwichtsextraktie 53 %

bedraagt [Lin, L.S., Yamamoto, R., Drummond,R.J., (1986), in Methods in Enzymology, vol. 119, Pestka, S. (ed.), first edition, Academic Press Inc., London, 183-192]

Aanvulling op hoofdstuk 5.6.2: de chemische oxidatie of refolding (R501)

.

Functie:

Nadat DTT verwijderd is moeten de verbroken zwavel verbindingen intramolekulair worden hersteld. Per molekuul moet 1 zwavelverbinding gevormd worden. Op deze wijze wordt interferon weer in de aktieve vorm gebracht.

ingaande stroom: produktstroom: hulpstromen:

Eisen:

#501; de stroom uit de size exclusion kolom K401

#504; de produktstroom wordt naar ultrafiltratie-unit F501 gepompt

#506 (ureum, IBA en EDTA), tevens wordt d.m. v. ijsazijn en natronloog de pH geregeld

- de refolding-reaktie moet in een reaktor van 1 m3 _plaatsvinden

-- de conversie van gedenatureerd interferon naar geaggregeerd en aktief interferon moet 100 % bedragen

- in de base case ~oet een yield voor de vorming van aktief interferon worden gehaald van 91 %

- de refolding in de base case wordt batch-gewijs ,uitgevoerd

- de refolding in dit verslag vindt fed-batch plaats; het toevoerdebiet moet zo gekozen worden dat er een maximale yield voor de vorming van aktief interferon wordt bereikt, waarbij bovendien de benodigde tijd niet limiterend is

Aannamen:

- de vorming van aktief interferon is een eerste orde proces met kt =0.01 1/s [Kiefhaber, T., Rudolph, R., KohIer, H.-H., Buchner, J., (1991), Bio/Technology, vol. 9, 825] - de vorming van geaggregeerd interferon is een tweede orde proces; met de gegevens van de base case wordt berekend: K₂=95 1/(M.s)

- overige eiwitten hebben geen storende invloed op de vorming van aktief en geaggre-geerd interferon

- mole~ul gewicht interferon is 25000 gram/mol

- omstandigheden in de reaktor zijn zo gekozen dat de kinetiek de tijds~epalende faktor is; er is sprake van ideale menging

Voor de berekeningen zijn de volgende vergelijkingen nodig: base-case (batch):

dit verslag (fed-batch):

vergelijkingen (5.56), (5.57) en (5.58); met V

=

constant

=

1 m3

, en kt en K₂ gegeven

Aanvulling hoofdstuk 5.7: de vloeistof-vloeistof centrifuge (C301) Functie:

In deze centrifuge worden de w~terfase (zware fase) en de butanol fase (lichte fase) van elkaar gescheiden, nadat in de extractietank (R301) (3-IFN uit water geextraheerd wordt

met 2-butanol. _, . ,

Eisen:

Hier is gebruik gemaakt van een tubular bowl centrifuge, omdat het dichtheidsverschil zodanig is (± 200 kg/m3

) dat een titbular bowl voldoet en geen disc stack nodig is. In

Bijlage 5.4 is een tubular bowl voor continue vloeistof-vloeistof scheiding weergegeven.

+ Stromen: Stroom in: Produktstroom: Waterfase: Aannamen:

#313 De voedingstroom bestaande uit een water en een butanolfase #310 De butanolfase, die (3-IFN met een zuiverheid van 60% bevat gaat

naar de precipitatie (R302).

#315 Deze stroom, die nog 47% van het (3-IFN bevat wordt gedeeltelijk hergebruikt.

- De (radiale) valsnelheid u is constant.

- Het langzaamste en dus kleinste druppeltje heeft een diameter van 0.1 mm Berekeningsmethodiek:

De gegeven afmetingen zijn standaardafmetingen uit Perry.

Formule 5.70 en 5.71 zijn afkomstig uit McCabe et al. (1993), formule 5.70 is formule 2.17 uit McCabe en formule 5.71 is formule 7.34,

Formule 5.73 is afkomstig uit de Cursus map van de Advanced Course Dowstream

Processing. ~.

Formule 5.74 is incorrect en moet als vo~gt zijn: -~

Re·"

<1>. • "'·1t·D ( (5.74)

P,..

"----Aanvulling op hoofdstuk 5.8: precipitatie (R302) Functie:

De butanol-fase die wordt afgescheiden in cent~ifuge C301, bevat opgelost interferon. Voor verdere opwerkingsstappen is het noodzakelijk het interferon

te

predpiterep en de butanol-fase af te scheiden. Een geschikte me'thode is zuur-precipitatie. Er wordt eerst een hoeveelheid fosfaatbuffer toegevoegd en vervolgens wordt de 'pH met behulp van ijsazijn op 5 gebracht. ingaande stroom: produktstroom: hulpstromen: afvalstroom: Eisen:

#310; butanol-fase, die afkomstig is uit C301, waarin interferon is opgelost

#309/#314; na de precipitatie moet het precipitaat gescheiden nworden van de butanol-fase

#305; fosfaatbuffer

#306; ijsazijn voor pH-regeling geen

- de vlokdiameter moet minimaal zijn in verband met de centrifugale afscheiding

r

- de vlok moet voldoeride sterk zijn tegen uiteen,:allen in nageschakelde pomp en

centrifuge .

- er moet een goede bulk-menging heersen (Re> 5000 enlof À=~articJe)

- de batch-tijd moet beperkt zijn

«

4 uur) Aannamen:

-er wordt orthokinetische groei verondersteJd (hoge shear-rates en grote vlokdiameters)

.

- vanaf een een bepaald tijdstip zijn de dynamische processen van de groei gelijk aan de shear break-up, de zogenaamde fase van 'aging'

- de gemiddelde deeltjesdiameter bedraagt ~

Literatuur: - Bell, D.J., Dunnil, P., 1982, Biotechnol. Bioeng., 24, 1271-1285 - Advanced Course on Downstream Processing 1994, Delft, hoofdstuk 11

- - - r

Aanvulling op hoofdstuk 5.9: Size exclusion chromatografie (K401, K601, K602)

;

Functie:

Het $cheidingsprincipe van de size exclusion kolommen is gebaseerd op het verschil in grootte van de te scheiden molekulen.

Het doel van deze stap is het verwijderen van DIT (K401), aggregaten (K601) en zouten (K602). Eisen: K401: K601: K602: Stromen

moet 99% van d ® i e in stroom #421 zit verwijderen, zodat de

concentratie DTT in stroom #426 kleiner is dan 2 mMo Yield voor interferon moet 95% bedragen.

moet ongeveer 95% van d aggregate verwijderen uit stroom #507 terwijl

-tevens eert zuiverheid van 980

0 worçlt bereikt. De yield op inter~eron moet,!@.

bedragen. ~

deze kolom moet zorgen voor het verwijderen v zouten n andere laag-molekulaire stoffen die nog in stroom #609 zitten. e yleld op eiwitten moet 97% bedragen .

.:::::::

K401 K601 K602 ingaande stroom #421 #507 #609 hulpstroom (=eluent) #425 #603 #612 produktstroom #426 #604 #615 afvalstroom #420 (a) #406 #606

(a): deze stroom gaat naar ultrafiltratie unit F402 Aannamen:

De berekeningen zijn uitgevoerd m.b.v. Aspen. Hiervoor werden de volgende aannames gemaakt:

Het mol~cht van ~-IFN blijft constant gedurende de unit operation nI. ~. Het molgewicht van het ligande is gesteld oE. 40.000. ' "

De vi~teit van het medium is gelijk verondersteld aan de viscositeit van water. Er wordt steeds geëlueerd met 1.5* het kolomvolume en er is aangenomen dat er geen overlap tussen pieken van opeenvolgende "sample shots" optreedt.

De berekening in Aspen wordt geoptimaliseerd op sam Ie volume en lineaire snelheid. De voedingstroom van de kolom zoals die in Aspen wordt ingevoerd bestaat uit de volgende komponenten: Water (Mw 18), ~-IFN (Mw 20000) enlllJ (Mw 154). De

kolom wordt steeds gevoed met 1 sample volume, Aspen rekent dan met dit sample volume en de opgegeven lineaire snelheid de cycle tijd uit. Om de totale batchtijd te berekenen wordt deze cycle tijd vermenigvuldigd met een factor ((totaal te processen

volume)/(n*sample volume)). De 'n' in deze fonnule volgt uit het gebruik van n kolommen.

De produktstroom die Aspen uitrekent wordt vennenigvuldigd met een factor 1.5. Dit is meer in overeenstemming met de praktijk.

Berekeningsmethodiek

Allereerst is aan de hand van literatuuronderzoek een idee verkregen over de

scheidingstechniek en de verschillende variabelen en parameters die van belang zijn voor het ontwerp van een gelchromatograaf. Verder zijn o.a. met behulp van Ganetsos et al. (1992) een aantalontwerpregels bepaald die in de industriele praktijk gelden voor gelchromatografie.

Mede op basis hiervan is een gedeelte van de tabel op paffipa 5.31 tot stand gekomen D.m.v.

een simulatie aan de hand van deze parameters en de te processen stromen resulteert in de rest

van deze tabel. ...

Aanvulling op hoofdstuk 5.10: de ultrafiltratie units (F:402, ES01 en F601)

CÇ" ~

ë:

Functie:

In de. ultrafiltratie-units dient de stroo et 0 elost eiwit geconcentreerd te worden ten

behoeve van volumereductie van d roductstroom. Als uitgangspunt wordt een concentreringfot !,O

~ëaZ

'

·

welke in 6M ureum goed haalbaar is. .

In deze processtappen Orden de relatief grote eiwitmoleculen (MW

~

20.000 Da) gescheiden van de kleine componenten, zoals water (18 Da), ureum (60 Da) en DTT (288 Da). In deze batch unitoperation wordt uitgegaan van een tank, waarin de te concentreren vloeistof zich bevindt onder een bepaalde werkdruk middels de stikstof-utility . De vloeistof wordt middels een centrifugaalpomp bij constant debiet, door middel van smoren in een bypass, door de holle fibers van een ultrafiltratie-membraan geperst, waarbij het concentraat weer in de tank terugstroomt. Om eventueel aangekoekt eiwit in het membraan ook te verkrijgen wordt eerst ingedikt tot 20 gil eiwit, waarbij met

naspoelen met een gelijk volume permeaat, bij gesloten permeaatklep, het merendeel van de aangekoekte eiwitten in de productstroom verkregen kan worden.

~romen: F402 #413 #406/#422 #411/#415 F501 #508 #507/#510 #511 ingaande stroom produktstroomlconcentraat afvalstroomlpermeaat . . _ _ _ _ _ t . . . _ _ _ --. . . _ _ . _ . . . _ • • • ---""'-'~-

-ro--

--.-

---F601 #611 #609 #614 - - a ...

- de eiwit-oplossing moet geconcentreerd worden tot 20 gil. Daarbij moet het verlies aan eiwitten zo beperkt mogelijk gehouden worden.

Aannamen:

- Omdat bij eiwit-ultrafiltratie de flux vanaf een bepaalde transmembraandruk van 200 [kPa] niet noemenswaardig meer toeneemt (Oers, 1994) wordt gekozen voor minimale transmembraandruk van 200 [kPa].

- Door de maxiamale axiale drukval vast te leggen op 50 [kPa] zal bij e-.r.n werkdruk van 300 [kPa] de transmembraandrukvalliggen tussen minimaal 200 [kPa] (einde fiber) en maximaal 250 [kPa] (begin fiber). Door deze maximaal toegestane axiale drukval worden al te hoge transmembraandrukken, en dus verstoppingen door eiwitten voorkomen.

- Er wordt aangenomen dat binnen de concentratiegrenzen (P-IFN 20 gil en 6M ureum) geen sprake is van gelvorming aan de binnenkant van het membraan.

- De flux door het membraan (mis) wordt voornamelijk bepaald door de opgebouwde polarisatielaag van eiwitten, waarbij wordt aangenomen dat de eiwitconcentratie aan het membraanoppervlak (Cwall) gelijk is aan de gelconcentratie van het eiwit (Oers, 1994).

- De viscositeit van de oplossing heeft grote invloed op de overdrachtscoefficient ~ en is een functie van de concentraties van verschillende opgeloste componenten. Bij het benaderen van de viscositeit wordt uitgegaan van opgetelde bijdragen van de verschillende componenten aan de specifieke viscositeit van de oplossing.

wordt uitgegaan van een eerste orde fit van experimentele data uit Pandit (1989). - Alle aanwezige eiwitten worden gezamenlijk beschouwd als een eiwit-component. - Een pH van 7 (lEPp_1FN=8.9) en een 6 M ureum-oplossing garanderen een goed

opgelost eiwit gedurende de gehele concentreringstap .

- Om (niet experimenteel bepaalde) flux-afname door 'protein-fouling' toch in rekening te nemen, wordt uitgegaan van een lineair (tov eiwitconcentratie) foulingmodel met 50% fluxvermindering bij een eiwitconcentratie van 20 [gil].

- De overall-yield van de ultra filtratie wordt bepaald door de retentie van het eiwit en door verlies in leidingen en unit. Door deze extra verliezen wordt in de filtratie-units F501 en F601 uitgegaan van een opbrengst van 94% in plaats van de met PSI-c berekende waarden welke boven de 98 % liggen.

Aangenomen parameters:

P

=

1000 [kg/m3], Cgel.eiwit

=

210 [kg/m3] (Perry), Reiwit

=

0.99, RMw <3oo

=

0, RMw >2ooo

=1. "

Beschrijvende vergelijkingen:

Via de retentie Ri van component i geldt voor de permeaat- en bulkconcentraties:

C""_J ~ C""IIrJ • (l-R)

Via de flux als gedefinieerd in §5.lOA geldt voor de component water in de tank de volgende 'accumulatie': met _P M V J A Fpermeaat

-L

dM

dV P'-=-=-J'A=-F dt dt

,.,.-de dichtheid van ,.,.-de vloeistof de totale watermassa in de tank het totale tankvolume

de membraanflux het membraanoppervlak het permeaatdebiet Voor de opgeloste component i in de tank geldt:

met Ci,tank Ci,concentr. Vtankt F C -C ~ F. I~" llri V,ril

de tankconcentratie van component i concentratie van i in het concentraat totale tankvolume op tijdstip t totale circulatie-debiet '-, [kg/m3 ] [kg] [m3 ] [mis] [m2 ] [m3_/s] [kg/m3 ] [kg/m3 ] [m3_] [m3_/s]

Terwijl .bij de term

ei

,concentraat het permeaatdebiet (F_p) niet verwaarloosd kan worden:

e

_1~0tII

.

F-e

IJ",};

-

F , . . . _

·e

, ' ' ' ' _

F-F

,...-Door middel van het oplossen van de accumulatievergelijkingen voor water en voor de andere aanwezige componenten worden de concentratieprofielen voor de batch-operatie verkregen.

Aanvulling op hoofdstuk 5.11: dead-end filtratie Functie:

Nadat het precipitaat is opgelost moeten de niet opgeloste delen in de verkregen oplossing worden verwijderd. Omdat de concentratie niet opgeloste stoffen relatief gering is kan met een.eenvoudig kaars filter gewerkt worden. 'Bijkomend voordeel is dat het filter senvoudig te reiniger} is en eventueel aanwezige micro-organismen eveneens worden verwijderd. '

ingaande stroom: produktstroom: afvalstroom:

Eisen:

#405; afkomstig van het oplossen van het precipitaat

#407; deze stroom is ontdaan van niet opgeloste eiwitten etc. #402; deze stroom bevat voornamelijk de niet opgeloste stoffen

- niet opgeloste stoffen moeten voor bijna 100

%

worden afgefilterd - het filter moet gemakkelijk schoon te maken zijn'

Aannamen:

- het filter heeft een yield voor interferon (opgelost) van 98 %

-het filter vangt de niet opgeloste stoffen voor 'meer dan 9~ % af

-de dikte van de cake is dusdanig klein dat een kleine drukval (0.35 bar) nodig is om een voldoende volumestroom te garanderen

P

- - ---~

SYMBOLENLIJST

A A Ab Ac Adwars Af

Am

a a C

C

b

CD

Cgel Cg Col· Col Cp Cp Cwall D D Db Dmobiele Dst Dv d d do dp d_w F Fg f f f_l g H H He Hh Hs Hv Hv HETP h hl

= buitenoppervlak van de buizen [m2 ]

= dwarsdoorsnede van de fermentor [m2]

= het aangestroomde oppervlak [m2]

= oppervlak van de koelspiraal [m2] = dwarsoppervlak [m2

]

= wandoppervlak van de fermentor [m2]

= het membraan-oppervlak [m2]

= straal van de cel [m]

= factor in het economische model [-]

= constante [-]

= gemiddelde bulk concentratie retentaat [kg/m3] = weerstandscoëfficiënt [-]

= gelconcentratie in [kg/m3 ]

= gel concentratie aan membraan oppervlak [kg/m3]

= verzadigingsconcentratie van zuurstof in de vloeistof [kg/m3]

= zuurstofconcentratie in de vloeistofbulk [kg/m3] = permeaat concentratie [kg/m3]

= warmtecapaciteit [J/(kgK)]

= concentratie aan het membraanoppervlak [kg/m3] = diameter van de roerder [m]

= diffusiecoëfficient [m2/s]

= bundel diameter [m]

= diffusiecoefficient de mobiele fase [m2/s] = diameter roerder oplos-extractie vat [m]

= diameter oplos-extractie vat [m] = diameter [m]

= factor in het economische model [-]

= buitendiameter van de tubes [m]

= diameter deeltje [m]

= dikte van de fermentorwand [m]

= debiet [m3/s]

= molenstroom [moVs]

= fanning-frictie coëfficiënt [-]

= factor in het economische model [-]

= 'Lang-factor' [Mfl]

= valversnelling = 9.81 [rnIs2]

= Henry-coëfficiënt [Pa 'Vmg]

= hoogte van de fermentor [m]

= over te dragen warmte van de fermentor naar het koelmediurn

= uitgewisselde warmte [W] = hoogte van het roerderblad [m]

= verdampingswarmte [J/kg]

= hoogte oplos-extractie vat [m]

= de hoogte van een theoretische schotel [m]

= warmteoverdrachtscoëfficiënt in de fermentor [W/(m2K)] warmteoverdrachtscoëff. in vloeistof [W/(m2K)]

~ ~O ~i hw

Ia

Ia

I

f

IH

IL

Iw

J

KA

Kav

KI

KL

KI

Ka

Kp

Ks

KT

k k k,A ks L L L Mw m ms N N N Np Nt n n n n n nl

I

OTR

_OUR

t

~P ~P Pg i P pomp Pst Ps/V, = totale warmteoverdrachtscoëfficiënt [W/(m2K)]

= waterdampconcentratie bovenin de fermentor [kg/m3]

= waterdampconcentratie van de ingaande lucht [kg/m3]

= warmteoverdrachtscoëfficiënt [W/(m2K)]

= totale apparaatkosten [Mfl]

= investeringen in de proceseenheden inclusief de indirecte bouwkosten [Mfl]

= "fixed capitai" [Mfl]

= investeringen in de hulpapparatuur en de indirecte kosten daarvan [Mfl]

=

investeringen in niet tastbare zaken [Mfl]

= werkkapitaal, voorraden, cash, terreinen [Mfl]

= volumetrische flux [m3

/m2_-s]

= algemene kosten [Mfl]

= volumetrische distributie coëfficiënt [-]

= investeringsafhankelijke kosten [Mfl]

= semi-variabele kosten [Mfl]

= constante behorende bij de berekening van de warmtewisselaar [-]

= indirecte fabricage kosten oftewel "plant overhead" [Mfl]

= produktie-volume afhankelijke kosten [Mfl]

= Monod-constante [kg/m3

]

= totale kosten [Mfl]

= stofoverdrachts coëfficient [mis]

= disruptiesnelheidsconstante [Mpaa]

= volumetrische stofoverdrachtscoëfficiënt [1 /s]

= stofoverdrachtscoefficient in de fiber [mis]

= lengte membraan kanaal [m]

= lengte van de kolom [m]

= totale loonkosten [Mfl]

= molekuulgewicht [g/mol]

= massa van het waterdruppeltje [kg]

= maintenance constante [kg substraat/(kg biomassa·h)]

= aantal schotels in een kolom [-]

= toerental van de roerder [1/s]

= aantal discrete passes [-]

= roerderkental [-]

= aantal tubes [-]

= aantal fibers in de ultrafiltratie [-]

= constante [-]

=

Richardson-Zaki-exponent

=

3.5 [-]

= exponent factor in de economische berekening [-]

= aantal afschijvingsjaren [-]

= constante behorende bij de berekening van de warmtewisselaar [-]

= "oxygen transfer rate" [kg/(m3·s)]

= "oxygen up-take rate" [kg/(m3_·s)]

= drukval over de homogenizer [Mpa]

= axiale drukval [Pa]

= door het gas ingebrachte vermogen [W]

= door de pomp afgegeven vermogen [W]

= asvermogen roerder oplos-extractie vat [kW]

= door de roerder ingebracht vermogen per vloeistof-volume [W/m3

Pa Pgem Ps Q

Q

Qc R R R R Re

R

p04 Rs

Rurf

r r_HG r_HM r_HS rHV r_HW S Sc S ..1Tlm T TI

T

2 T_ci Tco Tgj Th' ,I Tho TI TI Tv U V

V

e

V

g VI

V

o W X Yxs Z

= druk bovenin de fermentor [Pa]

= gemiddelde druk in de fermentor [Pa]

= druk ter hoogte van de beluchter [Pa]

= warmte [1]

= luchtdebiet [m3/s]

= debiet van het koelmedium [m3/s]

= gasconstante, 8.3144 [J/(moIK)]

= fractie gedisrupteerde cellen [-]

= retentie [-]

= afstand [m]

= Reynolds getal [-]

= straal waarop de fosfaatfase-uitlaat zich bevindt [m]

= resolutie [-]

= straal waarop het faseoppervlak zich bevindt [m]

= relatieve snelheidsconstante [-]

= toegevoerde warmte door ingaande gas [W]

= warmte-produktie door het m.o. [W]

= warmte-produktie door de roerder [W]

= afgevoerde warmte door verdamping [W]

= afgevoerde warmte door de wand [W]

= substraatconcentratie [kg/m3]

=

Schmidt getal

=

T}/(pD) [-]

= restwaarde van de plant [Mfl]

= logaritmisch gemiddelde temperatuurverschil [K]

= temperatuur [K]

= inlaat temperatuur van de koelstroom [K] = uitlaat temperatuur van de koelstroom [K]

= ingaande temperatuur van het koelmedium [K]

= uitgaande temperatuur van het koelmedium [K]

= temperatuur van het ingaande gas [0C]

= ingangstermperatuur van verwarmingsvloeistof [0C]

= uitgangstermperatuur van verwarmingsvloeistof [0C]

= temperatuur van oplosvloeistof [0C]

= temperatuur van de omgevingslucht [K]

= diameter van de fermentor [m]

= overall warmte-overdrachtscoëfficiënt [W/(m2_.oC)]

= volume [m3] = elutievolume [m3] = gelvolume [m3 ] = vloeistof volume [m3] = vrije volume [m3] = winst [Mfl] = drooggewicht cellen [kg/m3]

= yield van biomassa op substraat [kg biomassa/kg substraat]

= constante [-]

Pg = dichtheid van het gas [kg/m3]

cr; = volumeratio [-]

cr; = drukexponent [-]

cr; ,

p

= specifieke materiaal parameters [-]

p

= "pass" -exponent [-]

Y = wand "shear" snelheid [1/s]

Ys = obstructiefactor voor diffusie in stationaire fase [-]

€ = fractie vaste stof [-]

€ = de holdup [-]

11 = viscositeit vloeistof [pa.s]

11 gem = de gemiddelde viscositeit [mPa·s]

11 pomp = rendement van de pomp [-]

11spec. = de specifieke viscositeit [Pa's]

À = de bedpakkingsfactor [-]

À = warmtegeleidingscoëfficiënt [W/(m·K)]

ÀI = warmtegeleidingscoëfficiënt in vloeistof [W/(m·oC)]

Àw = warmtegeleidingscoëfficiënt [W/(m'K)]

cl>v = volumedebiet [m3/s]

~k = het volumedebiet van de koelwaterstroom [m3_/sec]

~m = het massadebiet van de proces stroom [kg/sec]

~w = de warmtestroom [W]

àp = het dichtheidsverschil [kg/m3_]

Pgem = de gemiddelde dichtheid van de emulsie [kg/m3]

PI = dichtheid vloeistof [kg/m3]

Pp = dichtheid deeltje [kg/m3]

f.I, = groeisnelheid [1/h]

f.l,max = maximale groeisnelheid [1/h]

v = kinematische viscositeit van de fermentorvloeistof [m2_/s]

VI = de kinematische viscositeit [m2/s]

w

= de hoeksnelheid [rad/sec]

a = de standaarddeviatie van een gausiaanse kurve [sJ

't = de batchtijd _[sJ

't = de diafiltratie-tijd [uur]

Literatuur McCabe, W.L., Smith, J.C., Harriott, P., Unit Operations ofChemical Engineering, fifth edition {t993)

Montfoort, A.G., (1991) De chemische farbiek, deel 2: Cost engineering en Economische aspekten, Faculteit der Scheikundige Technologie en der Materiaalkunde, vakgroep Chemi-sche Procestechnologie, T.U. Delft.

Oers, C. van, Solute rejection in multicomponent systems during ultrafiltration, PhD Thesis, TU Eindhoven, 1994

Perry's Chemical Engineers' Handbook, 50th _{ed. (1984)}

Riet, K. van 't, Tramper, J., Basic Bioreactor Design, Marcel Dekker lnc., New York (1991)

Stikkelman, R., diktaat Scheidingsprocessen II: vloeistof/vloeistof extraktie, Delft, (1994) Webci en Wubo, 'Prijzenboekje' , 14th

edition, Dutch Association of Co st Engineers, Leidsendam (1991)

Wesselingh, J.A., Kleizen, H.H., Scheidingsprocessen, Delftse Uitgevers Maatschappij bv, Delft (1990)

de volgende literatuurverwijzingen zijn meer algemeen gebruikt:

Albertsson, P.A., Johansson, G., Tjerneld, F., Aqueous Two-Phase Seperations, Editor: Asenjo, J.A., in Seperation Processes in Biotechnology, Marcel Dekker lnc., New York, pp 287-327 (1990).

~.

Creighton, T.E., Biochem. J., 270, 1-16 (1990)

Datar, R., Rosen, C.G., Centrifugal separation in the recovery of intracellular protein from E. coli, The Chemical Engineering Journal, 34, B49 (1987)

Marston, F.A.O., Biochem. J., 240,1-12, (1986)

Menge, U., Purification of human fibroblast interferon by extraction in aqueous two-phase systems, Journalof applied biochemistry, 5, 75090 (1983)

Pandit, A., Rheological properties of Dextran, Polyethylene Glycol, Bovine Serum Albumi-ne and their mixtures, Biotechnology Techniques Vol 3, 2, 125-130 (1989)

ï

Literatuur

Sheldon, J .M., The fine structure of ultrafiltration membranes II. Protein fouled

membra-nes,

JO

,

urnal of Membrane Science,

62, 87-102 (1991)

Weast, R.C. (ed.), Handbook of Chemistry and Physics, 64th _{edition (1983-1984),}

CRC-press Florida PATENTEN: WO 83/03103 WO 89/02750 WO 89/05158 US Patent no. 4,262,090 US Patent no. 4,450,103 US Patent no. 4,894,330 ~.