SY LW IA BO N IN , W IESŁA W W ZO R EK
DŁUGOTRWAŁA, CIĄGŁA FERMENTACJA WINIARSKA Z DROŻDŻAMI IMMOBILIZOWANYMI NA SZKLE PIANKOWYM
S t r e s z c z e n i e
Celem pracy było przeprowadzenie długotrwałej, ciągłej fermentacji winiarskiej z drożdżam i immo- bilizow anym i na szkle piankowym.
Ferm entację prow adzono przez okres ponad 4,5 miesiąca, w temp. 22°C. Przepływ medium przez 4 szklane kolum ny w ypełnione kostkami szkła piankow ego w ynosił 5 -6 dni. Stwierdzono prawidłowy przebieg fermentacji przez okres ponad 3 miesięcy. Po tym czasie nastąpił nieznaczny spadek otrzym y
wanego alkoholu, a w 5. miesiącu zmiany cech sensorycznych wina. W czasie fermentacji obserwowano obniżanie się liczby kom órek drożdży w kolejnych kolum nach i w m iarę upływ u czasu pracy fermentora, a także w zrost liczby kom órek nieaktywnych życiowo. Obserwacje mikroskopowe wykazały zmiany w kształcie komórek. Stwierdzono, że możliwe jest prowadzenie ciągłej fermentacji winiarskiej z drożdżami im m obilizowanym i na szkle piankow ym przez okres 3-4 miesięcy.
Wstęp
W ostatnich latach, w procesie ciągłej ferm entacji obserw uje się w zrost zaintere
sow ania w ykorzystaniem unieruchom ionych kom órek drożdży [17]. B adania te pro w adzone są głów nie w kierunku produkcji etanolu [13]. N ieliczne prace z zakresu fer
m entacji w iniarskiej donoszą głów nie o w ykorzystaniu drożdży im m obilizow anych m etodą pułapkow ania w różnych rodzajach żeli [2, 3, 5, 8, 11]. „K uleczki” żelu są jed n ak ściśliw e i w ykazują tendencję do osadzania się na dnie zbiorników ferm enta
cyjnych, co utrudnia przepływ m edium . Stw arza to konieczność stosow ania ferm ento- rów z m ieszaniem fluidyzacyjnym lub z zastosow aniem przegród [16]. Ponadto w kw aśnym środow isku w ina, żele tracą swe w łaściw ości m echaniczne, a p rzy dłuższym użyciu m ogą ulec destrukcji. N iektórzy w skazują też na niekorzystny w pływ na w ła
ściw ości sensoryczne otrzym yw anego produktu [5].
M gr Sylwia Bonin, prof, d r hab. W. Wzorek, Zakład Biotechnologii i M ikrobiologii Żywności, Katedra Technologii i Oceny Żywności, SGGW, u l Rakowiecka 26/30, 02-528 Warszawa.
106 Sylwia Bonin, W iesław Wzorek
Stąd też w ydaje się w łaściw e podjęcie prób nad ciągłą ferm entacją w iniarską z drożdżam i unieruchom ionym i na pow ierzchni tw ardego, nieściśliw ego nośnika. D o
św iadczenia nad ciąg łą ferm entacją w iniarską w niskiej tem peraturze z drożdżam i im- m obilizow anym i na pow ierzchni pum eksu (porow atego, w ulkanicznego m inerału za
w ierającego około 70% SO2) przeprow adzili B akoyianis i wsp. [1], W naszym Z akła
dzie w badaniach nad szeryzacją w in ow ocow ych do im m obilizacji kom órek drożdży w ykorzystano białe szkło piankow e [14, 15]. N ośnik ten zastosow ano rów nież do un ie
rucham iania drożdży w ciągłej ferm entacji w iniarskiej trwającej 33 dni [18].
C elem pracy była próba określenia w pływ u długotrw ałej, ciągłej ferm entacji w i
niarskiej z drożdżam i im m obilizow anym i na szkle piankow ym , na cechy otrzym yw a
nego wina.
Materiały i metody badań
Z estaw do prow adzenia ciągłej ferm entacji składał się z 4 szklanych kolum n w y pełnionych kostkam i szkła piankow ego, pom py zasilającej, zbiornika zasilającego i odbieralnika.
N astaw w iniarski przygotow yw ano z soku odtw orzonego z koncentratu jab łk o wego, przy czym zaw artość cukrów ogółem w ynosiła po uzupełnieniu sacharozą ok.
320 g/dm 3. N astaw w zbogacano w pożyw kę azotow ą, a także sulfitow ano do ilości 80 m g/dm 3 S 0 2 w celu przeciw działania rozw ojow i szkodliwej m ikroflory w czasie fer
m entacji.
D o ferm entacji używ ano drożdże z gatunku Saccharom yces cerevisiae, rasy S .o./IA D , adaptow ane do w ysokiego stężenia cukrów i alkoholu, pochodzące z kolek
cji czystych kultur Z akładu B iotechnologii i M ikrobiologii Żyw ności SGGW . D rożdże dodaw ano jednorazow o przed rozpoczęciem ferm entacji, a kolum ny napełniano stop
niow o w odstępach dw udniow ych. Przerw y te um ożliw iały osadzenie się drożdży na pow ierzchni nośnika.
Przed rozpoczęciem ferm entacji przeprow adzano pasażow anie drożdży m ające na celu przyzw yczajenie ich do obecności SO2 w nastaw ie i do w zrastającej zaw artość cukrów.
Ferm entację prow adzono w temp. ok. 22°C przez okres ponad 4,5 m iesiąca od m om entu rozpoczęcia zasilania, przy czym przepływ przez baterię ferm entorów w yno
sił ok. 5 -6 dni.
W trakcie procesu ferm entacji prow adzono analizę chem iczną zgodnie z p o w szechnie stosow aną m etodyką. Przeprow adzano rów nież ocenę sensoryczną w ina w skali pięciopunktow ej o 9 poziom ach jakości w yliczając ocenę og óln ą jak o średnią w ażoną przy w spółczynnikach ważkości: b arw a-1, zapach-2, sm ak-6. O kreślano także liczbę kom órek drożdży w m edium w poszczególnych kolum nach ferm entora m etodą liczenia bezpośredniego w kom orze Thom a oraz m eto d ą płytkow ą. Po zakończeniu
procesu oznaczano w kolejnych kolum nach liczbę kom órek drożdży na pow ierzchni nośnika z uw zględnieniem kom órek nieaktyw nych życiow o.
Wyniki i dyskusja
Ilość otrzym yw anego alkoholu w zrastała w początkow ym okresie pracy ferm en- torów. N ajw yższą ilość alkoholu otrzym ano ok. 2 0 -3 0 dnia ferm entacji i w ynosiła ona 17,4% obj. N astępnie poprzez zw iększenie przepływ u starano się uzyskiw ać ok. 16%
alkoholu, tzn. przepływ przez kolum ny w ynosił w tedy ok. 5 -6 dni. W 4 m iesiącu fer
m entacji nastąpił nieznaczny spadek ilości otrzym yw anego alkoholu i w ynosił on ok.
15%, a w 5 m iesiącu ok.14% (rys. 1). Ferm entację ciągłą należy prow adzić w ten spo
sób, aby w w inie opuszczającym linię pozostało 2 -3 % nie przeferm entow anych cu
krów podtrzym ujących aktyw ność życiow ą drożdży [19]. Stąd nie starano się zm niej
szać przepływ u dla pełnego odferm entow ania cukrów.
R ys. 1. W p ły w c z a s u trw a n ia f e rm e n ta c ji c ią g łe j n a z a w a rto ś ć a lk o h o lu w w in ie . F ig . 1. In flu e n c e o f c o n tin u o u s tim e o f fe rm e n ta tio n on a lc o h o l c o n te n t in w in e .
Jakość m łodych win była dobra (bez dodatkowej obróbki) i na w yrów nanym p o ziom ie przez okres ponad 3 m iesięcy trw ania ferm entacji. Pod koniec 4 m iesiąca nie
przerw anej ferm entacji jakość win uległa niew ielkiem u obniżeniu. Pojaw ił się specy
ficzny posm ak i zapach, co praw dopodobnie wiązało się z procesem autolizy drożdży, a ocena ogólna uległa obniżeniu do 3,7 punktu (tab. 1). Pow yższe dane w skazują na znaczną stabilność w procesie ferm entacji w ciągu ponad trzech m iesięcy jeg o trwania.
B akoyianis i wsp. [1] prow adzili ciągłą ferm entację w iniarską przez okres 75 dni obni
żając stopniow o tem peraturę z 27 do 5°C. N atom iast O gbonna i wsp. [12] prow adzili
108 Sylwia Bonin, Wiesław Wzorek
proces ferm entacji ciągłej przez 42 dni używ ając drożdży im m obilizow anych w postaci m em brany w alginianie w apnia na szklanych biow kładach. D allm ann i wsp. [2] prze
prow adzili trw ającą 15 dni ciągłą ferm entację soku jabłkow ego z użyciem drożdży pułapkow anych w alginianie wapnia. O trwającej 5 m iesięcy ferm entacji z drożdżam i im m obilizow anym i rów nież w alginianie w apnia donoszą N agashim a i wsp. [10]. Jed
nak badania te prow adzone były w kierunku otrzym yw ania alkoholu z trzciny cukro
wej.
T a b e l a 1
W pływ czasu trw ania fermentacji ciągłej na oceną sensoryczną w in (skala 5-punktowa).
Influence o f continuous fermentation time on organoleptic assessm ent o f wines (5 point score).
W yróżnik / Q uality factor Czas pracy fermentora (dni) / W ork time o f fermentor (days)
30 50 100 135
Barw a / Colour 3,9 3,4 4,4 4,4
Zapach / Aroma 4,1 4,4 4,0 3,3
Smak / Taste 4,2 4,0 4,0 3,7
O cena ogólna / Total assessm ent 4,1 4,0 4,1 3,7
Rys. 2. Liczba kom órek drożdży w kolum nach w zależności od czasu pracy fermentora.
Fig. 2. N um ber o f yeast cells in columns depending on work time o f fermentor.
W m iarę upływ u czasu ferm entacji obserw ow ano obniżanie się liczby kom órek drożdży w 1 m l ferm entow anego m edium oraz w kolejnych kolum nach. N a rys. 2.
przedstaw iono dane otrzym ane m etodą liczenia bezpośredniego. Szczególnie niew ielką liczbą kom órek zaobserw ow ano w IV kolum nie. Liczba ta w ynosiła 2,5-107 kom órek w pierw szym m iesiącu ferm entacji, a w trzecim m iesiącu obniżyła się o połow ę do
1,1-107, co je st spow odow ane praw dopodobnie znaczną koncentracją alkoholu. O bni
żanie się liczby kom órek w kolejnych kadziach ferm entacyjnych stw ierdzili Lipiec i K raw czyk [7], prow adząc próby nad ciągłą ferm entacją w iniarską w skali technicznej.
B ezpośrednio po zakończeniu procesu ferm entacji określano liczbą kom órek drożdży na 1 cm 2 pow ierzchni nośnika (rys. 3). Stw ierdzono spadek liczby drożdży w kolejnych kolum nach ferm entora. Jednocześnie liczba kom órek otrzym ana m etodą posiew u była niższa niż uzyskana drogą liczenia bezpośredniego, z uw zględnieniem kom órek nie barw iących się błękitem m etylenow ym . P rzyczyną m oże być tw orzenie przez drożdże aglom eratów , łańcuszków 3 -4 kom órkow ych. O bniżanie się liczby k o m órek na pow ierzchni nośnika je st zgodne ze stw ierdzonym wcześniej spadkiem ilości drożdży w m edium w kolejnych kolum nach ferm entora.
Rys. 3. Liczba kom órek drożdży w kolum nach po zakończeniu fermentacji.
Fig. 3. N um ber o f yeast cells in colum ns after fermentation.
Po zakończeniu ferm entacji określano także procent kom órek nieaktyw nych ży
ciowo na pow ierzchni nośnika w poszczególnych kolum nach (rys. 4). Stw ierdzono w zrost liczby kom órek nieaktyw nych życiow o w kolejnych kolum nach. Z aobserw o
w ano także nieznaczne zw iększenie się udziału tych kom órek w dolnych partiach
110 Sylwia Bonin, Wiesław Wzorek
trzech kolum n, licząc od początku zestawu. W zrost liczby kom órek barw iących się błękitem m etylenow ym w kolejnych kadziach stw ierdzili Lipiec i K raw czyk [7], Jed
nak ta ciągła ferm entacja trw ała 92 dni i prow adzona była m etodą tradycyjną.
Rys. 4. Udział kom órek nieaktyw nych życiowo na różnych poziom ach kolum n po 4,5 miesiącach pracy fermentora.
Fig. 4. C ontent o f non-viable yeast cells on different levels o f columns after 4,5 m onth w ork o f fer- mentor.
W m iarę upływ u czasu pracy ferm entora obserw ow ano zm iany w kształcie kom ó
rek drożdży. Z w iększał się udział kom órek w ydłużonych i buław kow atych, co udoku
m entow ano na zdjęciach z m ikroskopu św ietlnego (fot. 1-3). Zm iany w kształcie ko
m órek od eliptycznych do podłużnych podczas ferm entacji ciągłej zaobserw ow ali Hill i R obinson [4], Stw ierdzili oni, że im bardziej przepływ ające podłoże je st rozcieńczo
ne, tym kom órki są bardziej wydłużone. R ów nież Lipiec [6] zaobserw ow ała w ydłuża
nie się kom órek drożdży w kolejnych kadziach ferm entacyjnych. Stw ierdzone przez nas kształty buław kow ate m ogą w iązać się z faktem , że przy znacznej i długotrwałej koncentracji alkoholu w środow isku m oże następow ać w yciek zaw artości kom órek w w yniku uszkodzenia błony kom órkow ej [9], Planow ane są dalsze badania w tym kie
runku.
Fot. 1. Komórki „matki drożdżow ej” (pow. x600).
Fot. 2. Drożdże po ponad 4,5 miesiącach fermentacji w yizolowane z nośnika (pow. x600).
Fot. 3. K omórki drożdży w yizolow ane z nośnika po 4,5 m iesiącach fermentacji (pow. x600).
112 Sylwia Bonin, Wiesław Wzorek
Podsumowanie
M ożliw e je st prow adzenie ciągłej ferm entacji w iniarskiej z drożdżam i im m obili- zow anym i na szkle piankow ym , przez okres ok. 3 -4 m iesięcy, w tem p. ok. 22°C, bez negatyw nego w pływ u na jakość otrzym yw anego produktu.
B iałe szkło piankow e w ydaje się być odpow iednim nośnikiem drożdży w ciągłej ferm entacji w iniarskiej.
L IT E R A T U R A
[1] Bakoyianis V., K anellaki M ., K aliafas A., Koutinas A.A..: Low-temperature wine making by immo
bilized cells on m ineral kissiris. J. Agric. Food Chem., 40, 1992, 1293.
[2] D allm ann K., B uzas Zs., Szajani B.: Continuous fermentation o f apple juice by im mobilized yeast cells. Biotech. Lett., 9, 1987, 577.
[3] D ivies Ch., Cachon R., Cavin J. F., Prevost H.: Im mobilized cell technology in wine production.
Critical Reviews in Biotechnology, 14, 1994, 135.
[4] H ill G.A., Robinson C.W.: M orphological behaviour o f Saccharom yces cerevisiae during continuous fermentation. Biotech. Lett., 10, 1988, 815.
[5] Krasny S., M alik F., K ozankova J., N ahalka J., M inarik E.: Im m obilisierte Hefen im GärungsprozeP von Apfelmost. Mitt. Klostemeuburg, 43,1993, 139.
[6] Lipiec M.: D obór ras drożdży winiarskich do fermentacji ciągłej. Prace Inst. Lab. Bad. Przem. Spoż., 19, 1969, 445.
[7] Lipiec M ., K raw czyk W.: D obór ras drożdży w iniarskich do fermentacji ciągłej. Próby techniczne.
Prace Inst. Lab. Bad. Przem. Spoż., 21, 1971, 53.
[8] M alik F., Pach L., H alam a D., Bales V.: Zur Charakterisierung einiger Eigenschaften im mobilisierter W einhefen, 1. M itteilung: M echanische Eigenschaften im m obilisierter Zellen. Mitt. K lostem euburg, 40, 1990, 205 .
[9] N agashim a M.: Progress in ethanol production with yeasts, in: Y est - biotechnology and biocatalysis, New York and Basel, 57, 1990.
[10] N agashim a M., A zum a M., N oguchi S., Inuzuka K., Samejima H.: Continuous ethanol fermentation using im mobilized yeast cells. Biotech, and Bioeng., 26, 1984, 992.
[11] Ogbonna J.C., Am ano Y., N akamura K.: Elucidation o f optimum conditions for im mobilization o f viable cells by using calcium alginate. J. Ferment. Bioeng., 67, 1989, 92.
[12] Ogbonna J.C., Am ano Y., N akam ura K., Yokotsuka K., Shimazu Y., W atanabe M., Hara S.: A m ulti
stage bioreactor w ith replaceable bioplastes for continuous wine fermentation. A m erican J. Enol.
V iticul., 40, 1989, 292.
[13] O lejnik A., C zaczyk K.: Zastosowanie komórek im mobilizowanych w przem yśle spożywczym, Cz.
1. Ferm entacja etanolowa, Przem. Spoż, 52, 1998, 39.
[14] Rostkow ska-Dem ner E.: W pływ w ybranych m etod oksydacji biologicznej na skład i jakość win owocowych. Praca doktorska, SGGW , W arszawa, 1996.
[15] R ostkow ska-D em ner E., W zorek W.: Próby zastosow ania szkła piankow ego jako nośnika drożdży w oksydacji biologicznej w in owocowych. Żywność, 3 (20), 1999, 121.
[16] Sroka W ., Rzędowski W.: Rodzaje fermentorów stosowanych w procesach fermentacji z unierucho
m ionym i kom órkam i drobnoustrojów. Przem. Ferment, i O woc.-W arz., 35, 1991, 13.
[17] Sroka W ., Rzędow ski W.: Unierucham ianie drobnoustrojów - metody, rodzaje nośników oraz ich w pływ na w łaściwości komórek. Przem. F e rm e n t. i Owoc.-W arz., 35, 1991, 8.
[18] W zorek W ., B ugajew ska A., M ateusiak S., B onin S.: W ykorzystanie drożdży im m obilizowanych na szkle piankow ym w ciągłej fermentacji winiarskiej. Żywność, 1 (21), 2000, 102.
[19] W zorek W., Pogorzelski E.: Technologia winiarstw a gronowego i owocowego. SIGM A-ΝΟΤ, W ar
szawa, 1995-1998.
LONG-LASTING, CONTINUOUS FERMENTATION BY YEST CELLS IMMOBILIZED ON FOAM GLASS
S u m m a r y
Long-lasting, continuous wine fermentation by yeast cells im mobilized on foam glass w as investi
gated. The ferm entation w as carried out for more than 4,5 months at 22°C. The m edium w as passed thrugh 4 glass columns w ith the cubes o f foam glass at a rate o f 5 -6 days. The steady state w as m aintained for more than 3 months and insignificant decrease o f alcohol content was observed after this period. The negative changes in the sensoric quality o f wine occured in the 5th m onth o f investigation. The decrease in the num ber o f yeast cells per m l o f medium in the columns and at the w ork time o f ferm entor was stated. The increase in num ber o f non-viable yeast cells in the columns w as observed too. M icroscopic observation shows morphological changes o f yeast cells after fermentation. This research has shown that process o f continuous wine ferm entation w ith yeast immobilized on foam glass can be conducted for 3 -4 months. ^
