Skład i funkcja biologiczna elementów komórki prokariotycznej

(1)

Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna

Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA

Komórka i jej składniki

1 1

(2)

Najważniejsze rodzaje komórek stosowanych w biotechnologii przemysłowej

Komórki prokariotyczne:

1. Bakterie gramdodatnie i gramujemne producenci kwasów, alkoholi,

aminokwasów, białek - w tym promieniowce producenci antybiotyków

Komórki eukariotyczne

2. Grzyby

drożdże producenci etanolu i białek

grzyby pleśniowe producenci białek i antybiotyków, i niektórych związków prostych 3. Komórki zwierzęce

- komórki owadzie, CHO, BHK producenci białek

(3)

Komórki bakteryjne

Morfologia komórek bakteryjnych

(4)

Prokariotyczna komórka bakteryjna

(5)

Skład i funkcja biologiczna elementów komórki prokariotycznej

Składnik Skład molekularny Funkcja biologiczna

Polisacharydy usieciowane peptydami, otoczone

lipopolisacharydami

Biwarstwa lipidowo (40%) -białkowa (60%); mezosom to wpuklenie błony

Zawiera chromatynę -kompleks DNA i białek

histonowych

Kompleksy RNA (65%) i białek (35%)

Małe cząsteczki, białka rozpuszczalne, enzymy, sole nieorganiczne

Ściana komórkowa, wici i rzęski

Błona komórkowa, mezosom

Obszar jądrowy

Rybosomy

Cytoplazma

Ochrona przed stresem

osmotycznym i mechanicznym, Ruch (wici), adhezja i koniugacja (rzęski)

Selektywnie przepuszczalna bariera umożliwiająca transport składników pokarmowych i metabolitów

Genom. Miejsce przechowywania i powielania informacji genetycznej

Miejsce biosyntezy białek

Miejsce zachodzenia większości reakcji metabolicznych

(6)

Komórki bakteryjne są otoczone ścianą komórkową

Uproszczone struktury osłon zewnętrznych komórek bakteryjnych

(7)

Bakteryjna ściana komórkowa i jej biosynteza to miejsca działania ważnych antybiotyków

Antybiotyki beta-laktamowe

Wankomycyna Peptydoglikan

Liza komórki bakteryjnej

(8)

Promieniowce (Actinomycetales)

(9)

Eukariotyczna komórka zwierzęca

(10)

Eukariotyczna komórka roślinna

(11)

Skład i funkcja biologiczna organeli komórki eukariotycznej

Organela Skład molekularny Funkcja biologiczna

Biwarstwa lipidowo (50%) -białkowa (50%);

Zawiera chromatynę -kompleks DNA i białek histonowych + RNA

Zespoły błon lipidowo-białkowych + rybosomy

j.w. + polisacharydy

Otoczone podwójną błoną, zawierają enzymy, DNA i RNA Pęcherzyki zawierające enzymy hydrolityczne

Pęcherzyki zawierające katalazę i inne enzymy utleniające

Otoczone podwójną błoną, zawierają białka, lipidy, chlorofil, RNA, DNA i rybosomy

Małe cząsteczki, białka rozpuszczalne, enzymy,

sole nieorganiczne, cytoskeleton

Selektywna bariera transportowa;

komunikacja międzykomórkowa Miejsce przechowywania i powielania informacji genetycznej i transkrypcji Miejsce biosyntezy białek

Miejsce wydzielania „odpadów”

komórkowych i obróbki białek

Miejsce części reakcji katabolicznych i syntezy ATP

Metabolizm materiałów pobranych na drodze endocytozy

Miejsce reakcji katabolicznych, w których powstaje H₂O₂

Miejsce fotosyntezy

Miejsce zachodzenia większości reakcji metabolicznych oraz struktura nadająca kształt komórce

Błona komórkowa

Jądro

Siateczka środplazmatyczna z rybosomami

Aparat Golgiego Mitochondria

Lizosomy (zwierzęta) Peroksysomy (zw.) lub glioksysomy (rośliny) Chloroplasty (rośliny)

Cytoplazma

(12)

Jądro komórkowe

Obraz komórek HeLa z jądrami komórkowymi zaznaczonymi barwnikiem Hoechst

(13)

Mitochondrium

Obraz w mikroskopie elektronowym mitochondriów komórek pęcherzyków płucnych

(14)

Siateczka śródplazmatyczna – retikulum endoplazmatyczne

Obraz w mikroskopie elektronowym retikulum endoplazmatycznego 1- jądro; 2 – por jądrowy;

3 – szorstkie RE; 4 – gładkie RE;

5 – rybosom; 6 – białko transportowane w RE; 7 – pęcherzyk transportowy;

8 – aparat Golgiego (AG); 9 – strona cis AG; 10 – strona trans AG;

11 – cysterna AG

(15)

Struktura rybosomu Katalityczny rdzeń rybosomu zbudowany jest z rRNA

Rybosomy

Rybosomy prokariotyczne: 30S + 50S → 70S Rybosomy eukariotyczne: 40S + 60S → 80S

Wizualizacja struktury rybosomu

(16)

Grzyby w biotechnologii

Grzyby są organizmami heterotroficznymi – pasożyty lub saprofity

Przykłady ról grzybów w środowisku:

- dekompozycja martwej tkanki biologicznej (np. degradacja składników drewna)

- czynniki chorobotwórcze – rośliny (ponad 5 000 chorób), zwierzęta - Mycorrhizae – symbioza z korzeniami roślin

W biotechnologii - procesy fermentacyjne, wytwarzanie antybiotyków

producenci białek terapeutycznych

(17)

Drożdże

Budowa komórki drożdżowej

Obraz komórek

drożdży w skaningowym mikroskopie elektronowym

Morfologia drożdży

(18)

chityna

mannoproteiny

Struktura grzybowej ściany komórkowej

(19)

Przedmiot:Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA

GRZYBY

Mucor racemous

Penicillium chrysogenum Aspergillus fumigatus

Zygomycetes – grzyby pleśniowe, sprzężniaki

Grzybnia zbudowana z niepodzielnego mycelium.

Rozmnażanie płciowe poprzez zarodniki zwane zygosporami lub bezpłciowe poprzez spory w sporangium.

Ascomycetes – workowce

Grzyby jednokomórkowe lub tworzące grzybnię w postaci podzielnych strzępek.

Rozmnażanie płciowe poprzez askospory

lub bezpłciowe przez konidia. Do tej klasy należą m.in. Neurospra, Penicillium.

(20)

Basidomycetes – podstawczaki

Grzyby jednokomórkowe lub rozgałęzione.

Rozmnażanie płciowe poprzez basidospory lub bezpłciowe poprzez konidia. Do tej klasy należą grzyby kapeluszowe.

Deuteromycetes – grzyby niedoskonałe

Grzyby jednokomórkowe lub rozgałęzione.

Cecha charakterystyczna – brak rozmnażania płciowego.

Amanita phalloides

Candida albicans

(21)

Grzyby pleśniowe

Aspergillus nidulans

(22)

Grzyby - rozmnażanie

(23)

Drobnoustroje jako biologiczne źródło nowych potencjalnych leków Drobnoustroje prokariotyczne i eukariotyczne wytwarzają olbrzymią ilość małocząsteczkowych metabolitów wtórnych, z których wiele wykazuje selektywną toksyczność wobec innych drobnoustrojów

(antybiotyki przeciwdrobnoustrojowe), działanie przeciwnowotworowe (antybiotyki przeciwnowotworowe), ale także obniżające ciśnienie,

hamujące biosyntezę cholesterolu, o działaniu przeciwbólowym, immunosupresyjnym i innym.

- wyizolowano i opisano około 20 000 metabolitów wtórnych;

- połowa z nich działa antybiotycznie lub cytostatycznie - zastosowanie medyczne – około 150

Potencjalne dalsze możliwości:

- z 40 000 gatunków bakterii poznano około 5 000 - z 1,5 mln gatunków grzybów poznano około 70 000

- bardzo słabo poznane: drobnoustroje morskie, ekstremofilne

(24)

Biofarmaceutyki białkowe

Systemy ekspresyjne:

Komórki ludzkie – gen zmodyfikowany w obszarze promotora CHO – Chinese hamster ovary (komórki jajnika chomika

chińskiego)

BHK – baby hamster kidney (komórki nerki chomika) Komórki owadzie, gen włączony w genom baculowirusa Autographa californica

Drożdże – S. cerevisiae, Pichia pastoris Bakterie – E. coli, Bacillus spp.

Transgeniczne rośliny i zwierzęta

(25)

The purpose of micro-organism is....

...to make another micro-organism

Cel procesu biotechnologicznego:

1) jak najwięcej komórek drobnoustrojów w jak najkrótszym czasie...

lub

2) jak najwięcej pożądanego produktu

Przypadek 2) sprzeczny z życiowym celem drobnoustroju

(26)

Metabolizm = anabolizm + katabolizm

Procesy anaboliczne – endoergiczne i redukcyjne Procesy kataboliczne – egzoergiczne i utleniające

(27)

Bilans masowy utleniania glukozy w warunkach tlenowych i beztlenowych

(28)

Metabolizm

kluczowe cząsteczki

A + B + ATP → AB + ADP + P

_i

A + B + ATP → AB + AMP + PP

_i

A + ATP → A-P + ADP

(29)

Etapy katabolizmu

(30)

Katabolizm

Główne szlaki kataboliczne jako źródła prekursorów dla biosyntezy składników biomakromolekuł

(31)

Cykl Corich

Mleczan powstający w pracującym mięśniu ulega w wątrobie przekształceniu w glukozę

W warunkach beztlenowych w mięśniu pirogronian jest przekształcany w mleczan

Obecność dodatkowej reakcji umożliwia regenerację NAD⁺

(32)

Przekształcenie pirogronianu w etanol w komórkach drożdży w warunkach fermentacji alkoholowej

(33)

Produkty metabolizmu beztlenowego w różnych drobnoustrojach

Reakcje prowadzące do odtworzenia NADH są zaznaczone jako R

(34)

Regulacja metabolizmu drobnoustrojów

Zasady podstawowe

1. Równowaga pomiędzy procesami wytwarzającymi i zużywającymi metabolity pośrednie

2. Energetyczne sprzężenie metabolizmu – bilansowanie

zysku reakcji katabolicznych z sumą potrzeb energetycznych

komórki

(35)

Etapy ekspresji genu

(36)

Regulacja ekspresji genu przez białka regulatorowe

(37)

Główne mechanizmy regulacji transkrypcji genów kodujących enzymy metabolizmu podstawowego Katabolizm:

indukcja substratowa

Substrat lub jego metabolit działa jako induktor lub efektor pozytywny aktywatora. Regulacja dotyczy szlaku katabolizmu danego substratu -represja kataboliczna

Łatwiej przyswajalne źródło węgla lub efektor syntezowany w komórce w jego obecności działa jako korepresor lub efektor negatywny aktywatora.

Regulacja dotyczy szlaku katabolizmu trudniej przyswajalnego źródła węgla -represja azotowa

j.w., ale dotyczy szlaku przyswajania źródła azotu. Dotyczy także białek transportowych

Anabolizm:

- represja końcowym produktem szlaku

końcowy produkt szlaku działa jako korepresor lub efektor negatywny aktywatora. Dotyczy szlaku biosyntezy

-atenuacja

mechanizm specyficzny dla drobnoustrojów prokariotycznych

(38)

Diauksja – dwufazowość wzrostu drobnoustrojów w obecności dwóch źródeł węgla

Produkcja penicyliny przez Penicillum chrysogenum

(39)

Inne mechanizmy regulacji metabolizmu podstawowego

Regulacja aktywności enzymów

1. Enzymy regulatorowe – regulacja allosteryczna 2. Kowalencyjna modyfikacja enzymów

3. Kompleksy wieloenzymowe

Regulacja transportu metabolitów

1. Transport białek przez błony

2. Regulacja ilości i aktywności białek transportowych (permeaz)

(40)

Grupy specyficznych produktów metabolizmu drobnoustrojów

alkaloidy fenazyny pirydyny

aminocukry flawonoidy pirole

aminoglikozydy fosfoglikolipidy pirony

aminokwasy ftalaldehydy poliacetyleny

antocyjaniny glikozydy polieny

ansamycyny hydroksyloaminy polietery

antrachinony laktony polikwasy

antracykliny makrolidy polipeptydy

chinoliny naftochinony polisacharydy

chinolinony nitryle salicylany

chinony nukleozydy steroidy

depsipeptydy peptydy tetracykliny

(41)

Przedmiot: TECHNOLOGIA CHEMICZNA

Przemiany peryferyjne a przemiany centralne

(42)

Idiolity są syntezowane w idiofazie

(43)

Koncepcje wyjaśniające przyczyny biosyntezy idiolitów

1. Uzyskanie przewagi w danym środowisku

2. Przystosowanie się do zmieniających się warunków

środowiska dzięki dodatkowym szlakom metabolicznym 3. Utrzymanie stanu równowagi ze otoczeniem, gdy normalny

wzrost nie jest możliwy

4. Wynik rozregulowania metabolizmu. Nadprodukcja idiolitów rodzajem „wentyla” dla niezbilansowanych przemian

5. Obszar „wolnej gry” ewolucyjnej poza zakresem ścisłych reguł selekcji eliminujących zmiany niekorzystne dla

organizmu. Niektóre z idiolitów znajdują w końcu zastosowanie w metabolizmie producenta

(44)

Szlaki biosyntezy metabolitów wtórnych

1. Szlak poliketydowy

2. Polimeryzacja jednostek izoprenoidowych 3. Nierybosomalna synteza peptydów

4. Mieszana biosynteza poliketydów i peptydów

5. Biosynteza aminoglikozydów oraz amino- i peptydylonukleozydów

Fazy biosyntezy metabolitów wtórnych

1. Biosynteza i aktywacja prekursorów 2. Oligomeryzacja

3. Modyfikacja

4. Kondensacja składników 5. Modyfikacje końcowe 6. Ukierunkowany eksport

(45)

Szlak poliketydowy – biogeneza niektórych antybiotyków

(46)

Regulacja biosyntezy idiolitów

MECHANIZMY KONTROLI BIOSYNTEZY IDIOLITÓW - indukcja substratowa;

- indukcja powodowana przez regulatory metaboliczne;

- represja i hamowanie kataboliczne;

- regulacja związkami azotu;

- regulacja fosforanowa i energetyczna;

- hamowanie w sprzężeniu zwrotnym – zarówno przez metabolity podstawowe jak i specyficzne;

- regulacja z udziałem pierwiastków śladowych;

- regulacja tlenowa;

- regulacja innymi czynnikami, takimi jak temperatura lub pH

(47)

Regulacja biosyntezy idiolitów

Indukcja substratowa 1. Biosynteza cefalosporyny C

w C. acremonium – obecność w podłożu DL-cysteiny

lub DL-norleucyny

2. Biosynteza alkaloidów sporyszu przez grzyby Clavicepsis

– DL-tryptofan

Warunek – induktor dodawany

w fazie wzrostu, a nie w fazie produkcji

(48)

Regulacja biosyntezy idiolitów

Regulacja fosforanowa

Zasada ogólna – niskie stężenie fosforanu stymuluje biosyntezę idiolitów

(49)

Inżynieria metaboliczna szczepów przemysłowych Producenci metabolitów pierwotnych:

- wprowadzenie zmian umożliwiających nadprodukcję - maksymalizacja nadprodukcji

- zmiany umożliwiające pozakomórkowe wydzielanie produktu Producenci metabolitów wtórnych:

- maksymalizacja wydajności produktu

- możliwość wytwarzania produktów innych niż naturalny

(50)

Cechy szczepu wysokowydajnego

maksymalna wydajność pożądanego produktu

minimalizacja wytwarzania niepożądanych produktów ubocznych

stabilność genetyczna

odporność na zakażenia wirusowe

(51)

Klasyczne metody otrzymywania i hodowli szczepów wysokowydajnych

nieukierunkowane zmiany genetyczne - mutageneza

wytwarzanie, fuzja i odnawianie protoplastów

optymalizacja warunków wzrostu

(52)

Mutanty szczególnie przydatne dla otrzymywania wysokowydajnych producentów metabolitów pierwotnych

MUTANTY AUKSOTROFICZNE (ŻYWIENIOWE)

Komórki pozbawione aktywności co najmniej jednego enzymu katalizującego reakcję szlaku biosyntetycznego

MUTANTY REGULATOROWE

-mutacja w genie regulatorowym lub w obszarze promotorowym powodująca stałą derepresję biosyntezy;

-mutacja w genie strukturalnym, w efekcie której produkt genu ma niezmienioną aktywność katalityczną, ale traci wrażliwość na działanie inhibitora allosterycznego

(53)

Możliwość osiągnięcia celu:

Mutant auksotroficzny wobec związku F Cel – uzyskanie nadprodukcji

związku G

(54)

Biosynteza kwasu cytrynowego

Cykl Krebsa

(55)

Nadprodukcja kwasu cytrynowego w Aspergillus niger

Aktywność fosfofruktokinazy I,

kluczowego enzymu regulatorowego glikolizy jest hamowana przez ATP i cytrynian

Efekt Pasteura

U drobnoustrojów względnie anaerobowych,

wydajność biomasy jest dużo większa w obecności tlenu, który hamuje fermentację alkoholową.

Mechanizm: hamowanie glikolizy przez ATP i cytrynian Efekt Crabtree

W hodowlach tlenowych następuje częściowe hamowanie oddychania przy bardzo dużych stężeniach glukozy

(56)

Nadprodukcja kwasu cytrynowego w Aspergillus niger

Droga alternatywna funkcjonuje w warunkach niskiego stężenia fosforanów I silnego napowietrzania

(57)

Jakie warunki należy spełnić, aby możliwa była wysoko wydajna produkcja kwasu cytrynowego?

1. Wysoko wydajny szczep Aspergillus niger

- obecność alternatywnego łańcucha oddechowego

- mutant regulatorowy – PFK-I niewrażliwa na hamowanie przez cytrynian

2. Odpowiednie warunki hodowli

- skład pożywki: wysokie stężenie cukru; niskie stężenie jonów Fe(II) i Mn(II; niskie pH, około 2);

niskie stężenie fosforanów

- bardzo intensywne napowietrzanie

(58)

Hybrydyzacja – fuzja protoplastów

Przykłady zastosowania:

• Praktycznie wszystkie szczepy przemysłowe używane do produkcji

antybiotyków w wiodących firmach farmaceutycznych są rekombinantami otrzymanymi w wyniku fuzji protoplastów;

• Szczepy zawierające wiele kopii genów odpowiedzialnych za biosyntezę antybiotyku (np. Penicillium chrysogenum zaw. 20 zestawów genów

kodujących wytwarzanie penicyliny G);

• Fuzja protoplastów dwóch szczepów Cephalosporium acremonium

wytwarzających cefalosporynę C: wysokowydajnego, ale wolno rosnącego i nie wytwarzającego spor oraz drugiego o cechach odwrotnych.

Rekombinant posiadał kombinację cech korzystnych; wydajność o 40% lepsza niż wydajniejszy ze szczepów rodzicielskich.