Zastosowanie elektroogniskowania do identyfikacji gatunkowej tkanki mięśniowej zwierząt

Z CAŁEGO KRAJU

Zastosowanie elektroogniskowania

do identyfikacji gatunkowej

tkanki mięśniowej zwierząt

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 218

71

Białka należą do związków o bardzo dużych cząsteczkach, charakteryzują się dużym stopniem złożoności i różno­ rodności. Wchodzą one w skład każdej komórki i płynów ustrojowych, cechuje je daleko posunięta swoistość gatunkowa, a nawet osobnicza.

Każda komórka zawiera setkiróżnych białek, przy czym komórki danego typu odznaczają się występowaniem pew­ nych białek charakterystycznych jedynie dla nich. W komórkach roślin i zwierząt występują pewne białka różniące się od białek spotykanych w organizmach wszystkich innych gatunków. Białka or­ ganizmów mniej spokrewnionych wyka­ zują znacznie większe różnice niż białka form ściśle spokrewnionych. Różnorod­ ność białek może przejawiać się w ich właściwościach fizykochemicznych, składzie aminokwasowym, funkcjach biologicznych. Do białek należą enzymy, pewne hormony i wiele ważnych skład­ ników strukturalnych komórki.

Białka są amfolitami, występują w for­ mie jonów obojnaczych, jako kationy i aniony, tworzą sole i wędrują w polu elektrycznym (zjawisko elektroforezy). Przy określonej wartości pH (punkt izoe- lektryczny) białka wykazują równowagę jonową.

Zjawisko wędrówki cząsteczek obda­ rzonych ładunkiem w gradiencie pH, do którego zostało przyłożone pole elektry­ czne nosi nazwę elektroogniskowania i jest podstawą metody rozdziału związ­ ków różniących się punktami izoelektry- cznymi (pl). Takimi związkami są między innymi białka. W procesie elektroogni­ skowania każda cząsteczka jakiegoś białka wędruje w polu elektrycznym do takiego punktu w gradiencie pH, gdzie wartość pH będzie równa pl tego białka. Jeżeli białko znajduje się w środowisku o pH wyższym od jego punktu izoelektry- cznego (pl), jest naładowane ujemnie, a więc w czasie elektroforezy cząsteczka

jego wędruje do anody (+). Natomiast jeżeli białko znajduje się w roztworze o pH niższym od jego pl, jest naładowane dodatnio, i wędruje do katody (-). Gra­ dient pH podłoża w elektroogniskowaniu jest tworzony przez nośniki amfolitów - amfoliny, które charakteryzują się dużą pojemnością buforową, dobrym prze­ wodnictwem prądu w punkcie izoelektry- cznym, dobrą rozpuszczalnością w wo­ dzie, niewielkim ciężarem cząsteczko­ wym, nie wpływają na system detekcji białek (niska absorpcja przy 280 nm), nie denaturują białek inie wchodzą z nimi w reakcje.

Nośniki amfolitów dostępne handlowo są mieszaniną alifatycznych kwasów poliaminopolikarboksylowych z bardzo szerokim zakresem punktów izoelektry- cznych (pH 2,5-11,0). Nośniki amfoli- tów, przy braku pola elektrycznego, mają pH równoważne średniej wartości pH za­ wartej w roztworze. W polu elektrycznym nośniki amfolitów migrują w kierunku określonym przez ich ładunek. Ponie­ waż nośniki charakteryzuje duża poje­ mność buforowa, tworząone liniowy gra­ dient pH, odpowiedni do ich punktów izoelektrycznych.

Kiedy do roztworu amfolin dodana jest mieszanina białek i przyłożone jest na­ pięcie, zarówno nośniki amfolitów, jak i białka migrują do elektrod i zatrzymują się w miejscu, gdzie wartość pH odpo­ wiada ich punktom izoelektrycznym. Podczas migracji ładunek cząsteczki zmniejsza się stopniowo, aż do osiągnię­ cia punktu, gdzie suma ładunków wynosi zero. W miejscu tym następuje zatrzy­ manie i zagęszczenie białka.

Metodę elektroogniskowania wyko­ rzystuje się do celów preparatywnych i analitycznych, do oczyszczania białek i charakterystyki ich struktury.

Białka stanowią 16-20% tkanki mięś­ niowej dorosłych kręgowców. Skład pro­ centowy waha sią w zależności od ga­

tunku. Białka występujące w mięśniach poprzecznieprążkowanychto między in­ nymi białkamiofibryli - miozyna, aktyna, tropomiozyna, tropomina oraz niskoczą-steczkowe białka sarkoplazmy tzw. mio-

geny, głównie typu albumin, mioglobina, enzymy np. kinaza kreatynowa, kinaza adenylowa, AMP - ammohydrolaza i wiele innych. Metodąelektroogniskowa­ nia możnarównież przeprowadzaćroz­ działbiałek tkanki mięśniowej różnych gatunków zwierząt.

Do Laboratorium Kryminalistycznego KWP w Gdańsku przysłano 20 próbek

mięsa w celu przeprowadzenia badań biologicznych, a konkretnie udzielenia odpowiedzinapytanie, do jakichgatun­ ków zwierząt leśnychnależązabezpie­ czone wycinki mięsa (ekspertyzaHLBS - 900/96 dotycząca kłusownictwa leśne­ go). Badaniem rutynowo wykonywanym, przy określaniu przynależności gatunko­ wejbiałek, jest metoda elektroimmuno- precypitacji wzbuforowanymżelu aga­ rowym wykorzystująca zjawisko immu-nodyfuzji zachodzące w polu elektrycz­

nym prądu stałego,z zastosowaniem su­ rowic precypitujących białka określo­ nych gatunków zwierząt. Przysłane do badań próbkimięsa oznaczone nr 1 - 20 badano metodą elektroimmunoprecypi-tacji z zastosowaniem surowicprecypi­ tujących białko: świni,łosia, jelenia i sar­ ny, a ponadtoprzeprowadzono elektro- ogniskowanie wodnych wyciągów pró­ bek mięs nadesłanych do badań oraz wodnych wyciągów ztkanki mięśniowej znanych gatunków. Materiałem porów­ nawczym było: mięsowieprzowe, woło­ we,mięso kurczaka, indyka, dzika,sarny i jelenia, aponadto mięsoz dorsza.

Elektroogniskowanie przeprowadzo­ no w żelupoliakrylamidowym,ogradien­ cie pH 3,5-10, w temp. 4°C.

Użyte elektrolity. - Anolit- DL -treonina,

Z CAŁEGO KRAJU

śz Joanna Biedrzycka BIBLIOGRAFIA SUMMARY

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 218

72

dzik). W dwóch badanychpróbkach,za­ wierających bardzo dużo tłuszczu, nie uzyskano rozdziału białek (ryc. 1a-c).

Wyniki otrzymane metodą elektroogniskowania były zgodnez wynikami uzyskany­

mi metodą elektroimmuno- precypitacji z zastosowaniem

surowic precypitującychbiałka łosia, jelenia,sarny i świni.

Przeprowadzone badania

wskazują, iż metoda elektro­ ogniskowania wykorzystywana do celów preparatywnych i

analitycznych, do oczyszcza­ nia białek i charakterystyki ich

struktury, w badaniach krymi­ nalistycznych stosowana rów­

nież do oznaczania układów enzymatycznych np. fosfo- glukomutazy(PGMi), kwaśnej

fosfatazy (AcP), esterazy D

(EsD), może służyć także do

identyfikacji gatunkowej tkanki mięśniowej zwierząt.

7"

Odległość między elektroda­

mi -9 cm.

Przygotowanie próbek. 100 g mięsa zalano 20 pl wo­ dy, a następnie zmacerowano. Próbki przygotowano około 1 godz. przed elektroogniskowa-niem. Do przygotowania użyto mięsaświeżego imrożonego.

Warunki prądowe. Preogniskowanie: napięcie-1200 V, natężenie - 20 mA, moc-15W, czas -30 min.

Próbki o poj. około 10 pi na­ noszono wodległości ok. 1 cm od anody nabibułki „IEF Sample Appl Piece". Ogniskowanie: napięcie - 1200V natężenie -20 mA moc- 15 W czas - 90min. Po zakończeniu elektroogni­ skowania żel poddano fiksacji przez 90 min w mieszaninie: metanol, 20% kwas trójchlo- rooctowy, woda (2:1:2.5), a na­ stępnie przeprowadzono bar­ wienie w 0,2% roztworze Serva Blue. Czas barwienia - 10 mi­ nut. Po barwieniu płytkę żelu płukano kilkakrotnie w wodzie destylowanej i mieszaninie: me­ tanol, woda, kwas octowy (4,5:4,5:1). Uzyskany obraz prążków w badanych próbkach wskazuje naróżnorodność bia­ łek występujących w tkance mięśniowej różnych gatunków zwierząt. Obrazprążków białko­ wych z tkankimięśniowejgatun­ ków bliskospokrewnionych jest podobny. W próbkach mięs oz­ naczonych nr 1-20 nadesła­ nych do badań w celu ichiden­ tyfikacji gatunkowej uzyskano obraz prążków wskazujący, iż siedemnaście badanych próbek mięsa pochodzi od zwierzęcia z rodziny jeleniowatych (przed­ stawiciele występujący w Pol­ sce: jeleń szlachetny, sarna, łoś), jedna próbka mięsa pochodziod zwierzęciaz rodzinyświniowatych (Świnia domowa,

The article presents the ap- plication of electrofocusing method for examination of animal musculartissue.The afore mentioned method is also used formarking some ofthe enzyme systems,e.g. phosphoglucomutase, acid phosphatase,etherase,as wellas for species identification of muscular tissue inanimals.

1.MinakowskiW.: Biochemia krę­

gowców, PWN, Warszawa 1981. 2.Wille C.A.:Biologia,PWRiL,War­

szawa 1990.

3.MurchR.S.: Zastosowanie

izoe-lektrycznego ogniskowaniaw są­ dowej serologii, „Journal of Fe­

rensie Sciences”, 31 (3), 869-880

(1986).

4. Rubach K., Krichnott E., Bryer Ch.:

Dunnschicht-Elektrofokus-sierunginPolyacrylamid zur

Be-stimmung derTieratdurch

Prote-indifferezierung. Institut fur Re- bensmittelchemie der Techni-schen Universitat Berlin 1978. LKB.

________

f dzik

»M*****

:—

próbka.badana .. . ^dana

s—•

Iw*

R

'

• p/óbka badana

7—....

.'■1

.-•g-g

wui wieprzowina Jurczak wieprzowina PJ^bka: badana sarna indyk

fil

Ryc. 1 a, b, c. Różnorodnośćbiałek występujących w tkancemięśniowej różnych zwierząt uzyskana metodą elektroimmunoprecypitacji Fig. la,b,c.Variety of prołeiuspresentin muscular tissue of different animals. The proteins obtained by electroimmunoprecipitation method