ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW

NAUK ROLNICZYCH

Z e s z y t 587

2016

Wydział Nauk o Żywności

Szkoły Głównej Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie

ZAWARTOŚĆ OGÓLNYCH I ŁATWOEKSTAHOWALNYCH GLOMALIN ORAZ BIAŁEK GLEBOWYCH

SPOKREWNIONYCH Z GLOMALINAMI W RÓŻNYCH TYPACH GLEB POLSKI SPOD UPRAW ŻYTA I PSZENICY Anna Gałązka

Instytut Uprawy Nawożenia i Gleboznawstwa w Puławach Państwowy Instytut Badawczy

Streszczenie. Grzyby endomykoryzowe są obligatoryjnie związane z roślinami, a poprzez wytwarzanie glomalin wpływają na poprawę środowiska wzrostu dla swoich gospodarzy.

Właściwości glomalin, takie jak nierozpuszczalność, kleistość i hydrofobowość, mogą ini- cjować i chronić powstające agregaty glebowe. Białka te występują powszechnie w gle- bach różnych stref klimatycznych i stanowią magazyn węgla, którego źródłem jest atmo- sferyczny CO₂. Celem pracy było określenie zawartości glikoprotein (glomalin ogólnych TG, łatwoekstrahowalnych EEG oraz białek glebowych spokrewnionych z glomalinami GRSP) w próbkach różnych gleb Polski pobranych spod upraw roślin zbożowych. Próbki gleb przechowywano w stanie powietrzno-suchym, a następnie oznaczono w nich skład granulometryczny, zawartość węgla i azotu ogólnego oraz pojemność wodną. Równolegle w próbkach glebowych określono zawartość glomalin (TG, EEG, GRSP). Wyekstrahowane białka oznaczono metodą Bradford. W badanym materiale glebowym stwierdzono obec- ność zarówno glomalin ogólnych, łatwoekstrahowalnych, jak i białek glebowych spokrew- nionych z glomalinami. Obecność glomalin zależna była zarówno od rodzaju gleb oraz rodzaju uprawianej rośliny zbożowej.

Słowa kluczowe: mykoryza, glomalina ogólna, glomalina łatwoekstrahowalna, białko gle- bowe spokrewnione z glomalinami, gleba, żyto, pszenica ozima, pszenica jara

nr 587, 2016, 3–11

agalazka@iung.pulawy.pl

© Copyright by Wydawnictwo SGGW

4 A. Gałązka

Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych WSTĘP

Stabilność struktury gleby istotnie wpływa na charakter i zawartość materii organicz- nej w glebie [Cucci i in. 2015]. Zarówno użytkowanie gruntów, jak i rodzaj uprawianej rośliny ma wpływ na ilość i jakość materii organicznej gleby, a tym samym na jej agrega- cję [Bowles i in. 2014, Brevik i in. 2015].

Grzyby mykoryzowe (AMF – ang. arbuscular mycorrhizal fungi) są jednym z naj- ważniejszych czynników biotycznych warunkujących jakość środowiska glebowego [Wu i in. 2015]. Odgrywają bardzo ważną rolę w ekosystemach agrarnych, a poprzez pro- dukcję glomalin mogą stanowić istotny czynnik pozytywnego oddziaływania na wzrost i zdrowotność roślin w zależności m.in. od typu gleby oraz systemu jej uprawy [Wright i Anderson 2000, Gałązka i Gawryjołek 2015].

Symbioza grzybów AMF jest tworzona m.in. z wieloma trawami, większością roślin użytkowanych rolniczo oraz między niektórymi drzewami i krzewami. Występuje naj- częściej w glebach o pH zbliżonym do naturalnego, zawierających przyswajalny azot mineralny [Rillig 2004, Purin i Rilling 2007]. Zdolność produkcji i magazynowania glomalin (glikoprotein) w strzępkach grzybowych jest charakterystyczna wyłącznie dla arbuskularnych grzybów mykoryzowych należących do rzędu Glomerales skupiające- go rodzinę Glomeraceae z rodzajem Glomus [Wright i in. 1996, Gałązka i Gawryjołek 2015]. Żadne inne grzyby oprócz Glomeromycota nie produkują glomalin w znaczących ilościach [Driver i in. 2005].

Pod względem budowy cząsteczkowej glomalina to glikoproteina z N-końcowym łańcuchem oligosacharydowym, silnie hydrofobowa [Nichols 2004]. To właśnie hydro- fobowe domeny molekuły są odpowiedzialne za trudności w ekstrakcji oraz słabą roz- puszczalność tegoż białka. Glomaliny stanowią blisko 30% zawartości węgla w glebie oraz około 2% ogólnej wagi agregatów glebowych [Rillig i Steinberg 2002, Schindler i in. 2007]. Funkcjonalnie są to białka związane z glebową materią organiczną należące do tzw. białek glebowych spokrewnionych z glomalinami z ang. glomalin-related soil protein [Gillespie i in. 2011, Fokom i in. 2012]. W przypadku oznaczeń glomalin stosuje się oddzielną terminologię w zależności od metody ekstrakcji i metody detekcji białka (tab. 1) [Rillig 2004, Gillespie i in. 2011].

Tabela 1. Terminologia glomalin w zależności od metody ekstrakcji białka [Rillig 2004]

Table 1. Glomalin terminology depending on the method of protein extraction [Rillig 2004]

Skrót Abbreviation

Nazwa Name

Opis Description

TG glomaliny ogólne

total glomalin

frakcja glomalin gleby kilkukrotnie ekstrahowana przy uży- ciu 50 mM buforu cytrynianowego (pH 8,0), w autoklawie w temperaturze 121°C przez 60 minut

EEG glomaliny łatwoekstrahowalne easily extractable glomalin

frakcja glomalin gleb ekstrahowana jednorazowo przy uży- ciu 20 mM buforu cytrynianowego (pH 7,0) w autoklawie w temperaturze 121°C przez 30 minut

GRSP

białko glebowe spokrewnione z glomalinami

glomalin-related soil protein

stanowi łączny udział glomaliny w glebie, ewentualnie zawiera inne białko gleby; jest to frakcja glomalin gleby kilkukrotnie ekstrahowana przy użyciu 20 i 50 mM buforu cytrynianowego

Celem pracy było określenie zawartości ogólnych i łatwoekstrahowalnych glomalin oraz białek glebowych spokrewnionych z glomalinami w próbkach różnych gleb Polski spod upraw roślin zbożowych (żyta, pszenicy ozimej i pszenicy jarej).

MATERIAŁY I METODY

Materiał badawczy stanowiło 18 próbek glebowych spod upraw roślin zbożowych z reprezentatywnych doświadczeń polowych z różnych miejsc geograficznych w Pol- sce z Rolniczych Zakładów Doświadczalnych IUNG-PIB w Puławach. Próbki glebowe pobierano na głębokości 0–15 cm, a następnie przesiewano na sicie o 2-milimetrowej średnicy oczek. Próbki gleb przechowywano w stanie powietrzno-suchym, a następnie oznaczono w nich skład granulometryczny, zawartość węgla i azotu ogólnego oraz po- jemność wodną. Całkowitą zawartość węgla w glebie oznaczono według metody Tiurina, z kolei zawartość azotu ogólnego metodą spektrometrii przepływowej, z użyciem mine- ralizacji prób na drodze mokrej. Równolegle w próbkach glebowych określono zawar- tość ogólnych (TG) i łatwoekstrahowalnych glomalin (EEG) oraz białek spokrewnionych z glomalinami (GRSP). Łatwoekstrahowalne frakcje glomalin ekstrahowano jednokrot- nie z gleby 20 mM buforem cytrynianowym pH 7,0 przez 30 minut przy temperaturze 121°C, natomiast ogólną ilość glomalin ekstrahowano kilkukrotnie 50 mM buforem cy- trynianowym pH 8,0 przez 60 minut przy temperaturze 121°C, według metody opisanej przez Wright i Upadhyaya [1996]. Otrzymane supernatanty po ekstrakcji przechowywano do dalszych analiz w temperaturze +4°C. W otrzymanych ekstraktach oznaczono stężenie białka metodą Bradford [1976], polegającą na kolorymetrycznym oznaczaniu ogólnego stężenia białka przy użyciu albuminy wołowej jako standardu, z uwzględnieniem mody- fikacji metody według Wright i Upadhyaya [1999]. Pomiar absorbancji wykonano przy długości fali 590 nm.

W celu oszacowania istotnych różnic pomiędzy średnimi zastosowano test t-Studen- ta dla rozkładów normalnych, przyjęto poziom ufności 0,95. Wyliczono także wartości współczynnika korelacji prostej Pearsona dla p <0,05 dla układów liniowych. Równa- nia regresji przedstawiono na wykresach rozrzutu przy zastosowaniu testu R-kwadrat.

Do analizy wyników zastosowano także jednoczynnikową i dwuczynnikową analizę wariancji ANOVA. Do statystycznej oceny wyników wykorzystano pakiet programów Statistica.pl (7), (Stat. Soft. Inc.).

WYNIKI I DYSKUSJA

Glomaliny to bardzo charakterystyczne pod względem budowy i właściwości biał- ka – nierozpuszczalną w wodzie i odporną na degradację cieplną [Fakom i in. 2012].

Węgiel obecny w białku GRSP stanowi duża pulę w strukturze węgla organicznego [Ni- chols 2004]. Według Rilliga [2004] produkcja i rozkład glomaliny w środowisku glebo- wym wiąże się z wieloma czynnikami zarówno odnoszącymi się do fizykochemicznych właściwości gleby, jak i rośliny oraz gatunku grzyba. Struktura gleby i jej właściwości chemiczne mają istotny wpływ na wzrost grzybni, a tym samym na zawartość glomaliny.

6 A. Gałązka

Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych Zawartości glomalin w próbkach glebowych przedstawiono w tabeli 2. Z kolei korelacje pomiędzy zawartością białek TG, EEG i GRSP a zawartością węgla i azotu w próbce glebowej przedstawiono w tabeli 3.

Tabela 2. Zawartość glomalin ogólnych (TG), łatwoekstrahowalnych (EEG) i białek glebowych związanych z glomalinami (GRSP) w różnych glebach Polski spod upraw zbożowych Table 2. The content of total glomalin (TG), easily extractable glomalin (EEG) and glomalin-rela-

ted soil protein (GRSP) in different soils from Polish cereal crops Miejscowość

Locality

C N

Roślina Plant

TG EEG GRSP

g·kg^–1 mg·g^–1 s.m. gleby

mg·g^–1 d.m. of soil

Jelcz-Laskowice 7,2 0,64 żyto – rye 0,78^a 0,05^a 0,82^a

Jelcz-Laskowice 6,5 0,52 pszenica ozima

winter wheat 0,47^a 0,14^a 0,61^a

Jelcz-Laskowice 8,0 0,65 pszenica jara

spring wheat 0,46^a 0,16^a 0,62^a

Żelisławki 8,4 0,83 żyto – rye 1,57^b 0,75^b 2,32^b

Żelisławki 5,8 0,54 pszenica jara

spring wheat 0,57^a 0,18^a 0,76^a

Błonie-Topola 10,4 0,92 żyto – rye 2,03^c 0,87^b 2,90^c

Błonie-Topola 9,7 0,91 pszenica ozima

winter wheat 1,63^b 0,86^b 2,49^b

Błonie-Topola 6,7 0,66 pszenica jara

spring wheat 1,42^b 0,64^b 2,04^ab

Wierzchno 7,6 0,72 żyto – rye 1,93^b 0,76^b 2,69^b

Wierzchno 5,5 0,42 pszenica ozima

winter wheat 1,68^b 0,22^a 1,89^ab

Baborówko 6,3 0,58 pszenica ozima

winter wheat 1,93^b 0,09^a 2,02^ab

Baborówko 6,2 0,55 pszenica jara

spring wheat 1,64^b 0,06^a 1,70^ab

Borusowa 16,6 1,20 żyto – rye 3,17^c 0,89^b 4,06^c

Borusowa 15,5 1,40 pszenica ozima

winter wheat 1,99^b 0,74^b 2,73^c

Borusowa 9,9 1,05 pszenica jara

spring wheat 1,55^b 0,64^b 2,19^b

Wielichowa 11,0 0,95 żyto – rye 2,37^c 0,87^b 3,24^c

Wielichowa 6,1 0,54 pszenica ozima

winter wheat 1,86^b 0,45^ab 2,31^b

Wielichowa 6,3 0,45 pszenica jara

spring wheat 1,55^b 0,22^a 1,77^ab TG – glomaliny ogólne – total glomalin.

EEG – łatwoekstrahowalne glomaliny – easily extractable glomalin.

GRSP – białka glebowe spokrewnione z glomalinami – glomalin related soil protein.

Wartości średnie dla n = 5 – Mean values for n = 5.

Wartości oznaczone literami a, b, c różnią się między sobą istotnie statystycznie w grupie (p <0,05) – Values signed with different letters are significantly differ (p <0.05).

Tabela 3. Wartości współczynnika korelacji prostej Pearsona dla p <0,05 dla układów liniowych Table 3. The values of the coeffi cient of Pearson linear correlation p <0.05

× TG EEG GRSP %C %N

TG 1,000 0,633* 0,860* 0,433 0,494

EEG 0,633* 1,000 0,902* 0,716* 0,714*

GRSP 0,860* 0,902* 1,000 0,701* 0,760*

%C 0,433 0,716* 0,701* 1,000 0,936*

%N 0,494 0,714* 0,760* 0,936* 1,000

Wartości oznaczone (*) różnią się istotnie statystycznie (p <0,05) – Values signed with (*) are significantly differ. Oznaczenia – patrz tab. 2 – numer of soil samples – see Table 2.

Glomaliny występują powszechnie w różnych typach gleb [Wright i Anderson 2000]. Ich zawartość stwierdzono w glebach uprawianych rolniczo, glebach leśnych i łąkowych oraz nieużytkach rolnych [Nichols 2004, Gałązka 2013]. Zawartość gloma- lin w badanych glebach zależała zarówno od typu gleby, jak i uprawianej rośliny. Naj- większe zawartości glomalin ogólnych i łatwoekstrahowalnych stwierdzono w glebach pod uprawą żyta a następnie pszenicy ozimej i jarej (tab. 2). Zależności te potwierdzo- no, stosując test LSD (tab. 4), gdzie wykazano statystycznie istotne różnice zawartości białka GRSP w zależności od uprawianej rośliny.

Tabela 4. Test LSD dla porównania różnic pomiędzy zawartością białek GRSP a uprawiana rośliną, p <0,05

Table 4. The LSD test to compare differences between the protein content GRSP a cultivated plant, p <0.05

Roślina Plant

Żyto Rye

Pszenica ozima Winter wheat

Pszenica jara Spring wheat

Żyto – rye 0,197 0,032*

Pszenica ozima

Winter wheat 0,197 0,331

Pszenica jara

Spring wheat 0,032* 0,331

Wartości oznaczone (*) różnią się istotnie statystycznie (p <0,05) – Values signed with (*) are significantly differ (p <0.05).

Grzyby mykoryzowe znacznie częściej wchodzą w symbiozę z roślinami, które wydzielają poprzez system korzeniowy do środowiska znaczne ilości substancji wzro- stowych i hormonów [Schindler i in. 2007]. Stąd też uprawa żyta może wiązać się z efektywniejszym nawiązywaniem symbiozy w porównaniu do pszenicy jarej i ozimej.

Zarówno czynniki biotyczne jak i abiotyczne mają decydujący wpływ na ilość wy- produkowanej przez grzyby AMF glomaliny. Podstawowym czynnikiem wpływającym na znaczną produkcję glomaliny są optymalne warunki do rozwoju grzybów AMF, wynikiem czego jest aktywna symbioza pomiędzy rośliną a grzybem [Rillig 2004].

Stopień zasiedlenia korzeni roślin przez grzyby AMF może być regulowany dodatko- wo przez podatność (mykotroficzność) rośliny na infekcję, jak i poprzez aktywność

8 A. Gałązka

Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych infekcyjną spor tych grzybów występujących w glebie, na której uprawiana jest dana roślina [Koide i Peoples 2013]. Liczebność i aktywność symbiotyczna grzybów AMF, a tym samym wzrost produkcji glomaliny, może być zwiększona zarówno poprzez modyfikację warunków glebowych sprzyjających namnażaniu i aktywności spor, jak i przez wprowadzanie do ryzosfery wyselekcjonowanych drobnoustrojów wspomaga- jących proces mykoryzy (MHB – ang. mycorrhiza helper bacteria) [Guo i in. 2012].

Głównymi wyznacznikami produkcji glomalin są zarówno gatunek grzyba tworzące- go symbiozę, jak i rodzaj rośliny. Większość zasymilowanego węgla jest dostarczana do rośliny (ok. 85% węgla), pozostała część jest wykorzystywana m.in. na produkcję glomaliny [Wright i in. 1996, Driver i in. 2005]. Analiza regresji prostej potwierdziła zależność zawartości węgla ogólnego (%C) od zawartości białka GRSP na poziomie współczynnika determinacji 49% (rys).

zawartość węgla ogólnego [μg·g^–1 s.m. gleby]

total carbon [μg·g^–1 d.m. of soil]

GRSP [mg·g–1 s.m. gleby] total carbon [mg·g–1 d.m. of soil]

4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5

0,00,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8

węgiel: GRSP: y = 0,314 + 2,051*x; r = 0,7008; p = 0,0012;

r² = 0,4922

Rys. Analiza regresji p <0,05. GRSP – białka glebowe spokrewnione z glomalinami -glomalin related soil protein [mg·g^–1 s.m. gleby], C – węgiel ogólny [μg·g^–1 s.m. gleby]

Fig. Analysis of regresion p <0.05. GRSP – glomalin related soil protein [mg·g^–1 d.m. of soil], C – total carbon [μg·g^–1 d.m. of soil]

Do czynników ograniczających prawidłowe funkcjonowanie mykoryzy arbuskular- nej należą m.in.: uprawa mechaniczna, stosowanie środków ochrony roślin, intensywne nawożenie oraz niektóre rotacje (np. wprowadzanie roślin nie tworzących mykoryz) [Wright i Upadhyaya 1996]. Właściwości fizykochemiczne gleb oraz stosowany sy- stem uprawy ma istotny wpływ na zawartość glomaliny w glebie [Gałązka 2013, Wang i in. 2015]. Stąd też wysokie stężenie glomalin zaznacza się głównie w niezakłóconym, bez uprawowym systemie, co jest wynikiem formowania oraz utrzymywania trwałości agregatów glebowych, w porównaniu do konwencjonalnego systemu uprawy gleby, gdzie następuje rozbicie agregatów glebowych oraz inwazyjne rozerwanie filamentów grzybowych, czego konsekwencją jest mała zawartość glomalin w glebie [Wright i An- derson 2000].

WNIOSKI

1. W badanych próbkach glebowych stwierdzono zawartość zarówno ogólnych, jak i łatwoekstrahowalnych glomalin oraz białek glebowych spokrewnionych z glo- malinami.

2. Obecność glomalin zależna była zarówno od rodzaju gleb oraz rodzaju uprawia- nej rośliny zbożowej.

3. Największe zawartości glomalin stwierdzono w glebie spod uprawy żyta.

Podziękowania

Badania wykonano w ramach realizacji tematu z działalności statutowej IUNG-PIB nr 1.16 oraz zadania 1.4. Ocena i kształtowanie bioróżnorodności środowiska glebowego oraz aktywności mikrobiologicznej gleb z uwzględnieniem różnych warunków siedlisko- wych i systemów gospodarowania. Program Wieloletni IUNG-PIB na lata 2016–2020.

LITERATURA

Bowles T.M., Acosta-Martínez V., Calderón F., Jackson L.E., 2014. Soil enzyme activities, micro- bial communities, and carbon and nitrogen availability in organic agroecosystems across an intensively-managed agricultural landscape. Soil Biol. Biochem. 68, 252–262.

Bradford M.M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248–254.

Brevik E.C., Cerdà A., Mataix-Solera J., Pereg L., Quinton J.N., Six J., Van Oost K., 2015. The interdisciplinary nature of SOIL. SOIL 1, 117–129. doi:10.5194/soil-1-117-2015 Cucci G., Lacolla G., Pagliai M., Vignozzi N., 2015. Effect of reclamation on the structure of silty-

-clay soils irrigated with saline-sodic waters. Int. Agrophys. 29, 23–30.

Driver J.D., Holben W.E., Rillig M.C., 2005. Characterization of glomalin as a hyphal wall compo- nent of arbuscular mycorrhizal fungi. Soil Biol. Biochem. 37, 101–106.

Fokom R., Adamou S., Teugwa M.C., Begoude Boyogueno A.D., Nana W.L., Ngonkeu M.E.L., Tchameni N.S., Nwaga D., Tsala Ndzomo G., Amvam Zollo P.H., 2012. Glomalin related soil protein, carbon, nitrogen and soil aggregate stability as affected by land use variation in the humid forest zone of south Cameroon. Soil Till. Res. 120, 69–75.

Gałązka A., 2013. Charakterystyka glomalin i oddziaływania różnych systemów uprawy na ich zawartość w glebie. Polish J. Agron. 15, 75–82.

Gałązka A., Gawryjołek K., 2015. Glomalina – glikoproteina produkowana przez grzyby mykoryzy arbuskularnej. Postep Mikrobiol. 54 (3), 331–343.

Gillespie A.W., Farrell R.E., Walley F.L., Ross A.R.S., Leinweber P., Eckhardt K.U., Regier T.Z., Blyth R.I.R., 2011. Glomalin-related soil protein contains non-mycorrhizal-related heat- -stable proteins, lipids and humic materials. Soil Biol. Biochem., 43, 766–777.

Guo H., He X.L., Li Y.P., 2012. Spatial distribution of arbuscular mycorrhiza and glomalin in the rhizosphere of Caragana korshinskii Kom. in the Otindag sandy land, China. Afr.

J. Microbio. Res. 6, 5745–5753.

Koide R.T., Peoples M.S., 2013. Behavior of Bradford-reactive substances is consistent with pre- dictions for glomalin. Appl. Soil Ecol. 63, 8–14.

Nichols K.A., 2004. Characterization of glomalin a glycoprotein produced by arbuscular mycor- rhizal fungi. Agriculture, Soil Sci. 81, 123–129.

10 A. Gałązka

Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych Purin S., Rillig M.C., 2007. The arbuscular mycorrhizal fungal protein glomalin: Limitations,

progress, and a new hypothesis for its function. Pedobiologia 51, 123–130.

Rillig M.C., 2004. Arbuscular mycorrhizae and terrestrial ecosystem processes. Ecol. Lett. 7, 740–754.

Rillig M.C., Steinberg P.D., 2002. Glomalin production by an arbuscular mycorrhizal fungus:

a mechanism of habitat modification? Soil Biol. Biochem. 34, 1371–1374.

Schindler F.V., Mercer E.J., Rice J.A., 2007. Chemical characteristics of glomalin-related soil pro- tein (GRSP) extracted from soils of varying organic matter content. Soil Biol. Biochem.

39, 320–329.

Wang S., Wu Q.-S., He X.-H., 2015. Exogenous easily extractable glomalin-related soil protein promotes soil aggregation, relevant soil enzyme activities and plant growth in trifoliate orange. Plant Soil Environ. 61, 2, 66–71.

Wright S.F., Anderson R.L., 2000. Aggregate stability and glomalin in alternative crop rotations for the central Great Plains. Biol. Fert. Soils 31, 249–253.

Wright S.F., Franke-Synder M., Morton J.B., Upadhyaya A., 1996. Time course study and partial characterization of a protein on hyphae of arbuscular mycorrhizal fungi during active colonization of roots. Plant Soil 181, 193–203.

Wright S.F., Upadhyaya A., 1996. Extraction of an abundant and unusual protein from soil and com- parison with hyphal protein from arbuscular mycorrhizal fungi. Soil Sci. 161, 575–586.

Wu Q.S., Li Y., Zou Y.N., He X.H., 2015. Arbuscular mycorrhiza mediates glomalin-related soil protein production and soil enzyme activities in the rhizosphere of trifoliate orange grown under different P levels. Mycorrhiza 25, 121–130.

THE CONTENTS OF TOTAL AND EASILY EXTRACTABLE

GLOMALIN-RELATED SOIL PROTEIN IN DIFFERENT TYPES OF SOIL FROM THE POLISH CROP OF RYE AND WHEAT

Summary. It is now established that universal and ubiquitous symbiotic arbuscular mycorrhizal fungi (AMF), belonging to Glomales, form symbiotic relationships with roots of 80–90% land plants in natural and agricultural ecosystems. Glomalin is thermostable, water-insoluble glycoprotein abundantly produced by AMF fungi and tends to accumulate in the soil. These are proteins with a very unique physicochemical properties performing a fundamental role in making soil structure. Glomalin glues soil aggregates and thus stabi- lizes the soil structure. The content of glomalin in soil particles is significantly correlated with their stability (water resistance). There is a hypothesis that mycorrhizal fungi produce large quantities of glomalin to improve the environment for growth of plants. It is possible that glomalin is involved in the formation of hydrophobic properties of soil, improving water and air relations in soil. The properties of glomalin such as insolubility, viscosity and hydrophobicity can initiate formation of aggregates and protect the already existing soil aggregates. The mycelium of AMF, in addition to its crucial role in enhancing nutrition of host plant, also plays a role in soil particle aggregation and soil stability. Studies show that glomalin are commonly found in soil and provide a depot for carbon which is a source of atmospheric CO₂. Glomalin are recently included to soil organic matter. They are common in soil, also in Polish agricultural soils.

The aim of the study was to determine the content of total glomalin TG and easily extract- able glomalin EEG and glomalin-related soil protein GRSP in samples of different soils from the Polish cereal crops (rye, winter and spring wheats).

The 18 soil samples from the cultivation of cereal with representative field trials in dif- ferent geographic locations in Poland were studied. Soil samples collected at a depth of 0–15 cm, and then sieved on a sieve with a mesh diameter of 2 mm. Soil samples were stored in air-dry state, and then the carbon and nitrogen content and water capacity were studied. Simultaneously in soil samples were determined contents of total glomalin TG and easily extractable glomalin EEG and glomalin-related soil protein GRSP. The protein concentration was measured according to Bradford method. The highest content of total and easily extractable glomalin were found in the soils under cultivation of rye. Glomalines content in soils depends both on the type of soil and cultivated plants. Mycorrhizal fungi more often enter into symbiosis with plants, which emit through the root system into the environment a significant amount of growth substances and hormones. The cultivation of rye may be associated with more efficient in establishing the symbiosis compared to the winter and spring wheat.

Key words: mycorrhiza, total glomalin, easily extractable glomalin, glomalin-related soil protein, soil, rye, winter and spring wheat

nr 587, 2016, 13–21

CZY BIAŁKO MOŻE BYĆ OBECNE W GLEBIE

NAWET 20 LAT? OCENA ZAWARTOŚCI OGÓLNYCH I ŁATWOEKSTRAHOWALNYCH GLOMALIN

W ARCHIWALNYCH PRÓBACH GLEBOWYCH Anna Gałązka

, Karolina Gawryjołek

Instytut Uprawy Nawożenia i Gleboznawstwa w Puławach Państwowy Instytut Badawczy

Streszczenie. Glomaliny to glikorpoteiny grzybowe, które są wyjątkowo odporne na degra- dację (obecne w glebie nawet od 10 do 30 lat) oraz trudno rozpuszczalne w wodzie. Celem niniejszej pracy była ocena zawartości ogólnych i łatwoekstrahowalnych glomalin w ar- chiwalnych próbkach glebowych. Do badań wybrano 15 próbek glebowych z doświadczeń polowych z 1994 roku dotyczących uprawy jęczmienia jarego. Badane gleby pochodziły z różnych regionów Polski oraz reprezentowały różne typy gleb. Gleby charakteryzowały się także dużym zróżnicowaniem właściwości fizykochemicznych i biologicznych. Prze- prowadzone w niniejszej pracy badania wykazały obecność glomalin we wszystkich prób- kach glebowych. Stężenie ogólnych i łatwoekstrahowalnych glomalin zależało głównie od typu gleby. Obecność glomalin w badanych glebach potwierdza hipotezę, iż białka te są szczególnie odporne na degradację i mogą pozostać w niezmienionej formie w glebie przez wiele lat.

Słowa kluczowe: glomalina, glomalina ogólna, glomalina łatwoekstrahowalna, białko gle- bowe spokrewnione z glomalinami, gleba, mykoryza

WSTĘP

Glomalina jest glikoproteiną glebową produkowana przez grzyby mykoryzy arbu- skularnej (AMF). Białko to zostało po raz pierwszy opisane w 1996 roku przez Sarę Wright [Wright i Upadhyaya 1996]. Grzyby endomykoryzowe są obligatoryjnie związane

agalazka@iung.pulawy.pl

© Copyright by Wydawnictwo SGGW

14 A. Gałązka, K. Gawryjołek

Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych z większością roślin, a poprzez m.in. produkcję glomalin są zdolne do poprawy środowi- ska wzrostu roślin – swoich gospodarzy. Właściwości fizykochemiczne glomaliny takie jak nierozpuszczalność, kleistość i hydrofobowość mogą inicjować i chronić powstające agregaty glebowe oraz poprawiać właściwości hydrofobowe cząstek gleby pozwalają- cych na przenikanie powietrza i przepływ wody [Wright i Anderson 2000]. Glomaliny wytwarzane przez grzyby AMF okrywają strzępki grzybni, utrzymując wodę i składniki odżywcze przed ich utratą w drodze do i z rośliny [Fakom i in. 2012]. Funkcjonalnie są to białka związane z glebową materią organiczną należące do tzw. białek glebowych spokrewnionych z glomalinami z ang. glomalin-related soil protein (GRSP) [Schindler i in. 2007].

Glomalina zlokalizowana jest głównie na powierzchni strzępek i spor grzybów AMF.

Głównym zadaniem tej hydrofobowej cząsteczki okrywającej grzybnie jest jej ochrona przed degradacją przez inne mikroorganizmy, a także zwiększenie sztywność i trwałość struktur ścian komórkowych tych grzybów, co ułatwia ich rozprzestrzenianie się w glebie.

Według Rilliga i Steinberga [2002] produkcja i rozkład glomaliny w środowisku glebo- wym wiąże się z wieloma czynnikami zarówno odnoszącymi się do fizykochemicznych właściwości gleby, jak i rośliny oraz gatunku grzyba. Struktura gleby i jej właściwości chemiczne mają istotny wpływ na wzrost grzybni, a tym samym na zawartość glomaliny [Nichols 2004]. Glomalina jest bardzo odporna na rozkład. W miarę starzenia się strzę- pek pozakorzeniowych oraz korzeni roślin, biomasa grzybni ulega degradacji – ale nie glomalina [Driver i in. 2005]. Białko to w niezmienionej formie jest w stanie przetrwać w glebie nawet kilkadziesiąt lat. Glomaliny występują powszechnie w różnych typach gleb. Ich obecność potwierdzono także w glebach uprawnych naszego kraju [Gałązka 2013]. Węgiel obecny w białku GRSP stanowi dużą pulę w strukturze węgla organiczne- go [Wright i Anderson 2000, Nichols 2004].

Udowodniono, iż glomaliny są produkowane i magazynowane nie tylko podczas in- tensywnego wzrostu strzępki, ale również są przekazywane do gleby po obumarciu grzy- ba na skutek rozkładu grzybni [Driver i in. 2005]. Glomaliny są glikoproteinami wyjątko- wo odpornymi na degradację. Trudno rozpuszczają się w wodzie, z kolei bardzo dobrze rozpuszczają się w wysokiej temperaturze (121°C) w buforze cytrynianowym o odczynie neutralnym lub alkalicznym [Wright i Upadhyaya 1996].

Celem pracy było określenie zawartości ogólnych i łatwoekstrahowalnych glomalin w archiwalnych próbkach glebowych pochodzących z kolekcji gleb Zakładu Mikrobiolo- gii Rolniczej IUNG-PIB pobranych w 1994 roku spod uprawy jęczmienia jarego.

MATERIAŁY I METODY

Do badań wykorzystano 15 archiwalnych próbek glebowych pochodzących z doświadczeń polowych dotyczących uprawy jęczmienia. Próbki glebowe pobrano do badań na głębokości 0–15 cm w 1994 roku a po przesianiu na sicie o średnicy oczek 2 mm i wysuszeniu zarchiwizowano i przechowywano w temperaturze pokojo- wej. Próbki gleb przechowywano w stanie powietrzno-suchym. Charakterystykę gleb z uwzględnieniem składu granulometrycznego oraz miejsca poboru prób przedstawio- no w tabeli 1 na podstawie archiwalnych danych źródłowych – dane z 1994 roku [Król

1997]. W tabeli 2 podano podstawowe właściwości fizykochemiczne badanych gleb:

węgiel ogólny oznaczony metodą Tiurina, azot ogólny oznaczony metoda spektrometrii przepływowej, mineralizacja prób na drodze mokrej, odczyn gleby (pH_H2O) metoda potencjometryczna oraz kwasowość hydrolityczna – metoda alkacymetryczna, fosfor przyswajalny (P₂O₅) znaczony metodą kolorymetryczną wg Egnera-Riehma, potas przyswajalny (K₂O) oznaczony metodą spektrometrii emisji płomieniowej wg Egnera- -Riehma.

W powietrznie-suchych próbkach glebowych oznaczono aktualnie zawartość ogól- nych (TG) i łatwoekstrahowalnych glomalin (EEG) oraz białek spokrewnionych z glo- malinami (GRSP). Otrzymane wyniki skorelowano z fizykochemicznymi właściwościa- mi tych gleb. Łatwoekstrahowalne frakcje glomalin ekstrahowano jednokrotnie z gleby 20 mM buforem cytrynianowym pH 7,0 przez 30 minut przy temperaturze 121°C, z ko- lei ogólną ilość glomalin ekstrahowano kilkukrotnie 50 mM buforem cytrynianowym pH 8,0 przez 60 minut przy temperaturze 121°C, według metody opisanej przez Wright i Upadhyaya [1996]. Otrzymane supernatanty po ekstrakcji przechowywano w tempera- turze +4°C do dalszych analiz. W otrzymanych ekstraktach oznaczono stężenie białka z uwzględnieniem modyfikacji metody Wright i innych [1996] oraz Bradford [1976].

Pomiar absorbancji wykonano przy długości fali 590 nm.

Tabela 1. Charakterystyka gleb pobranych w 1994 roku spod uprawy jęczmienia [Król 1997]

Table 1. The characteristic of soil collected in 1994 from barley [Król 1997]

Miejscowość – Place

Procentowa zawartość frakcji mechanicznych*

Textural classifi cation [mm]

1,0–0,1 0,1–0,02 0,02–0,002 <0,002

Gnojno/Chmielnik 56 24 20 7

Kłoda/Połaniec 49 33 18 3

Kazimierza Wielka 7 42 51 21

Osiny/Iłża 47 34 19 3

Kiełczany/Bogucin 11 62 27 5

Rudniki/Połaniec 86 7 7 2

Busko Zdrój 71 5 24 16

Nowy Dwór Gdański 11 25 64 25

Las Stocki/Wąwolnica 1 62 37 6

Stara Wieś/Frampol 67 22 11 3

Ostaszewo/Toruń 40 36 24 5

Hrubieszów 2 47 51 18

Młynary/Braniewo 17 37 46 16

Nakło/Noteć n.b. n.b. n.b. n.b.

Kończyce/Chełmża 35 44 21 4

n.b. – brak danych.

* Skład granulometryczny, procentowa zawartość frakcji mechanicznych skład granulometryczny – metoda Casagrande’a w modyfikacji Prószyńskiego według normy [PN-R-04032:1998] – Textural classification – Ca- sagrande method modified by Prószyński [PN-R-04032:1998].

16 A. Gałązka, K. Gawryjołek

Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych W celu oszacowania istotnych różnic pomiędzy średnimi zastosowano test t-Studenta, przyjęto poziom ufności 0,95. Wyliczono także wartości współczynnika korelacji prostej Pearsona dla p <0,05. Równania regresji przedstawiono na wykresach rozrzutu przy za- stosowaniu testu R-kwadrat. Do analizy wyników zastosowano także jednoczynnikową i dwuczynnikową analizę wariancji ANOVA. Do statystycznej oceny wyników wykorzy- stano pakiet programów Statistica.pl (7), (Stat. Soft. Inc.).

WYNIKI I DYSKUSJA

Glomaliny występują powszechnie w różnych typach gleb [Guo i in. 2012, Gałązka i Gawryjołek 2015]. Ich zawartość stwierdzono zarówno w glebach uprawianych rol- niczo, glebach leśnych, łąkowych oraz nieużytkach rolnych [Rillig 2004, Purin i Rillig 2007]. Najwyższe stężenie tego białka odnotowano w tropikalnych glebach leśnych na Hawajach (ponad 100 mg·g^–1 gleby), z kolei najniższe stężenie glomaliny (poni- żej 1 mg·g^–1 gleby) stwierdzono w glebach pustynnych [Wright i Upadhyaya 1996, Wang i in. 2015]. Gleby lasów tropikalnych, ze względu na wysoką temperaturę i dużą wilgotność, charakteryzują się niskim stężeniem glomaliny 0,7–1,5 mg·g^–1 w prze- ciwieństwie do gleb z klimatu umiarkowanego i podzwrotnikowego, gdzie zaznacza się wysokie stężenie glomaliny nawet do 100 mg·g^–1 gleby, co tłumaczy się szybkimi zmianami klimatu, wysokim stężeniem żelaza w glebie oraz wysokim poziomem dwu- tlenku węgla w atmosferze stymulującym wzrost grzybów AMF [Wang i in. 2015].

Na rysunku przedstawiono zawartość glomalin ogólnych i łatwoekstarhowalnych oraz białek glebowych spokrewnionych z glomalinami. Największe zawartości glomalin stwierdzono w glebie murszowej (próbka nr 14). Otrzymane wyniki zawartości gloma- lin w próbkach archiwalnych porównano z podstawowymi właściwościami chemicz- nymi gleb (tab. 2).

Zawartość glomalin ogólnych i łatwoekstrahowalnych oraz białek glebowych spo- krewnionych z glomalinami nie korelowała z odczynem gleby oraz zawartością węgla ogólnego (tab. 3). Brak istotnych korelacji pomiędzy stężeniem glomalin a zawarto ścią węgla ogólnego potwierdza hipotezę, iż glomaliny stanowią odmienną pulę węgla orga- nicznego w glebie. Podobne rezultaty uzyskano w badaniach obecności glomalin w świe- żych glebach uprawnych w różnych systemach uprawy zbóż [Gałązka 2013, Koide i Peoples 2013]. Statystycznie istotną korelację dodatnią uzyskano pomiędzy stężeniem glomalin ogólnych i łatwoekstrahowalnych.

Na produkcję glomalin może mieć wpływ wiele czynników zarówno środowisko- wych, glebowych, jak i klimatycznych. Podstawowy czynnikiem ograniczającym pro- dukcję glomaliny są niekorzystne warunki do rozwoju grzybów AMF, wynikiem cze- go jest nieaktywna symbioza pomiędzy rośliną a grzybem [Wright i Anderson 2000].

Stopień zasiedlenia korzeni roślin przez grzyby AMF może być regulowany dodatkowo przez podatność (mykotroficzność) rośliny na infekcję i poprzez aktywność infekcyjną spor tych grzybów występujących w glebie, na której uprawiana jest dana roślina [Gille- spie i in. 2011, Gałązka i Gawryjołek 2015].

0 5 10 15 20

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Zawartość glomalin [mg·g–1 s.m. gleby] Concentration of glomalin [mg·g–1 d.m. of soil]

numer próbki glebowej – number of soil samples

TG EEG GRSP Liniowy (GRSP)

Rys. Zawartość glomalin w archiwalnych próbkach glebowych Fig. The content of glomalins in the archives of soil samples

Tabela 2. Zawartość glomalin ogólnych (TG), łatwoekstrahowalnych (EEG) i białek glebowych związanych z glomalinami (GRSP) oraz podstawowe właściwości chemiczne w różnych glebach Polski spod uprawy jęczmienia

Table 2. The content of total glomalin (TG), easily extractable glomalin (EEG) and glomalin- -related soil protein (GRSP) and basic phisico-chemical properties in different soils from Polish barley’s crops

TG EEG GRSP

C_og

[%] pH

Hh [cmol⁽⁺⁾·

·kg^–1]

P₂O₅ K₂O Mg

mg·g^–1 s.m. gleby mg·g^–1 d.m. of soil

mg·100 g^–1 gleby mg·100 g^–1 of soil

2,49^b 2,07^b 4,57^b 1,64 7,6 1,05 18,9 12,7 2,8

2,98^b 2,21^b 5,19^b 2,43 5,4 3,53 2,5 4,6 6

4,08^b 2,04^b 6,12^b 3,8 7,3 0,9 5,8 8,6 20

1,06^c 0,92^c 1,99^c 1,1 6,8 1,35 4,6 13,3 1,8

2,55^b 2,44^b 5,00^b 1,84 5,5 4,05 5,6 3,1 6,6

3,80^b 3,01^b 6,81^b 2,85 4,6 4,73 5 11,7 4,4

1,82^c 1,35^c 3,17^c 2 7 0,68 46,8 18,2 4,2

9,13^a 5,01^a 14,15^a 3,65 5,9 4,35 6,5 7,7 22

1,77^c 1,24^c 3,02^c 0,89 6,2 1,88 7 8,6 3,2

2,44^b 1,57^c 4,01^b 1,05 5,8 2,7 8 11,1 4,8

4,24^b 3,06^b 7,30^a 1,95 5 4,05 7,2 13,3 6,2

2,96^b 2,62^b 5,59^b 2,9 6,8 0,98 14,5 5,2 17,4

6,28^a 3,47^b 9,76^a 2,59 6,8 1,58 15,4 13,3 22,8

16,65^a 4,45^a 21,11^a – 6,8 1,73 15,9 3,4 17,4

1,86^c 1,36^c 3,22^b 1,48 7,4 0,83 39 23,5 4,8

TG – glomaliny ogólne – total glomalin.

EEG – łatwoekstrahowalne glomaliny – easily extractable glomalin.

GRSP – białka glebowe spokrewnione z glomalinami – glomalin related soil protein.

Wartości średnie dla n = 5 – Mean values for n = 5.

Wartości oznaczone innymi literami różnią się między sobą istotnie statystycznie w grupie (p <0,05) – Values signed with different letters are significantly differ (p <0.05).

18 A. Gałązka, K. Gawryjołek

Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych Tabela 3. Wartości współczynnika korelacji prostej Pearsona dla p <0,05 dla układów liniowych Table 3. The values of the coeffi cient of Pearson linear correlation p <0.05

× TG EEG GRSP P₂O₅ K₂O Mg pH C_og Hh

TG 1,000 0,932* 0,992* –0,053 –0,378 0,815* –0,257 0,442 0,405

EEG 0,932* 1,000 0,951* –0,010 –0,391 0,742* –0,360 0,392 0,522*

GRSP 0,992* 0,957* 1,000 –0,028 –0,365 0,799* –0,277 0,442 0,423 P₂O₅ –0,05 –0,010 –0,028 1,000 0,430 0,001 0,636* –0,242 –0,604*

K₂O –0,378 –0,391 –0,365 0,430 1,000 –0,404 0,358 –0,069 –0,429

Mg 0,815* 0,742* 0,799* 0,001 –0,404 1,000 –0,097 0,533* 0,155

pH –0,257 –0,360 –0,277 0,636* 0,358 –0,097 1,000 –0,081 –0,896*

C_og 0,442 0,392 0,442 –0,242 –0,069 0,533* –0,081 1,000 0,058

Hh 0,405 0,523* 0,423 –0,604* –0,429 0,155 –0,896* 0,058 1,000

Wartości oznaczone (*) różnią się istotnie statystycznie (p <0,05) – Values signed with (*) are significantly differ (p <0.05).

Oznaczenia – patrz tabela 1 – numer of soil samples – see Table 1.

Analiza regresji prostej potwierdziła zależność stężenia glomalin ogólnych (TG) od stężenia glomalin łatwoekstrahowalnych (EEG) na poziomie współczynnika deter- minacji 68% oraz białek EEG od białek glebowych spokrewnionych z glomalinami (GRSP) na poziomie 80% (rys. 2).

Liczebność i aktywność symbiotyczna grzybów AMF a tym samym wzrost produkcji glomaliny może być zwiększona zarówno poprzez modyfikację warunków glebowych sprzyjających namnażaniu i aktywności spor, jak i przez wprowadzanie do ryzosfery wyselekcjonowanych drobnoustrojów wspomagających proces mykoryzy. Głównymi wyznacznikami produkcji glomalin są zarówno gatunek grzyba tworzącego symbiozę, jak i rodzaj rośliny oraz właściwości biologiczne i fizyczne gleby [Cucci i in. 2015, Wu i in. 2015]. Większość zasymilowanego przez grzyby węgla jest dostarczana do rośliny (ok. 85%), pozostała część jest wykorzystywana m.in. na produkcję glomaliny.

WNIOSKI

1. W archiwalnych próbkach glebowych stwierdzono obecność glomalin ogól- nych, łatwoekstrahowalnych oraz białek glebowych spokrewnionych z glomalinami.

2. Wysokie stężenia glomalin w badanych glebach potwierdzają przyjęta hipo- tezę, iż białka te nie ulegają całkowitej degradacji i pozostają w glebie nawet przez kilkanaście lat.

3. Stwierdzono zależność stężenia glomalin ogólnych (TG) od stężenia gloma- lin łatwoekstrahowalnych (EEG) na poziomie współczynnika determinacji 68% oraz białek EEG od białek glebowych spokrewnionych z glomalinami (GRSP) na pozio- mie 80%.

a

EEG [mg·g^–1 s.m. gleby]

EEG [mg·g^–1 d.m. of soil]

b TG [mg·g–1 s.m. gleby] TG [mg·g–1 d.m. of soil]

EEG:TG: y = –2,5723 + 2,7857*x;

r = 0,8275; p = 0,0001; r² = 0,6847 18

16 14 12 10 8 6 4 2

00,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5

Rys. 2. Analiza regresji p <0,05. TG – glomaliny ogólne, EEG – łatwoekstrahowalne glomaliny, GRSP – białka glebowe spokrewnione z glomalinami [mg·g^–1 s.m. gleby]

Fig. 2. Analysis of regresion p <0.05. TG – total glomalin, EEG – easily extractable glomalin, GRSP – glomalin related soil protein [mg·g^–1 d.m. of soil]

EEG [mg·g^–1 s.m. gleby]

EEG [mg·g^–1 d.m. of soil]

0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5

GRSP [mg·g–1 s.m. gleby] GRSP [mg·g–1 d.m. of soil]

EEG:GRSP: y = –2,572 + 3,7857*x;

r = 0,8947; p = 0,00001; r² = 0,8004 18

16 14 12 10 8 6 4 2 0 20 22

20 A. Gałązka, K. Gawryjołek

Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych Podziękowania

Badania wykonano w ramach realizacji tematu z działalności statutowej IUNG-PIB 1.16 oraz zadania 1.4. Ocena i kształtowanie bioróżnorodności środowiska glebowego oraz aktywności mikrobiologicznej gleb z uwzględnieniem różnych warunków siedlisko- wych i systemów gospodarowania. Program Wieloletni IUNG-PIB na lata 2016–2020.

LITERATURA

Bradford M.M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248–254.

Cucci G., Lacolla G., Pagliai M., Vignozzi N., 2015. Effect of reclamation on the structure of silty- -clay soils irrigated with saline-sodic waters. Int. Agrophys. 29, 23-30.

Driver J.D., Holben W.E., Rillig M.C., 2005. Characterization of glomalin as a hyphal wall compo- nent of arbuscular mycorrhizal fungi. Soil Biol. Biochem. 37, 101–106.

Fakom R., Adamou S., Teugwa M.C., Begoude Boyogueno A.D., Nana W.L., Ngonkeu M.E.L., Tchameni N.S., Nwaga D., Tsala Ndzomo G., Amvam Zollo P.H., 2012. Glomalin related soil protein, carbon, nitrogen and soil aggregate stability as affected by land use variation in the humid forest zone of south Cameroon. Soil Till. Res. 120, 69–75.

Gałązka A., 2013. Charakterystyka glomalin i oddziaływania różnych systemów uprawy na ich zawartość w glebie. Polish J. Agronom. 15, 75–82.

Gałązka A., Gawryjołek K., 2015. Glomalina – glikoproteina produkowana przez grzyby mykoryzy arbuskularnej. Postep Mikrobiol. 54 (3), 331–343.

Gillespie A.W., Farrell R.E., Walley F.L., Ross A.R.S., Leinweber P., Eckhardt K.U., Regier T.Z., Blyth R.I.R., 2011. Glomalin-related soil protein contains non-mycorrhizal-related heat- -stable proteins, lipids and humic materials. Soil Biol. Biochem. 43, 766–777.

Guo H., He X.L., Li Y.P., 2012. Spatial distribution of arbuscular mycorrhiza and glomalin in the rhizosphere of Caragana korshinskii Kom. in the Otindag sandy land, China. Afr. J. Mic- robiol. Res. 6, 5745–5753.

Koide R.T., Peoples M.S., 2013. Behavior of Bradford-reactive substances is consistent with predi- ctions for glomalin. Appl. Soil Ecol. 63, 8–14.

Król M., 1997. Drobnoustroje ryzosfery jęczmienia jarego. ISBN 83-85725-59-8, H(13). Rozprawa habilitacyjna.

Nichols K.A., 2004. Characterization of glomalin a glycoprotein produced by arbuscular mycorrhi- zal fungi. Agriculture, Soil Sci. 81, 123–129.

Purin S., Rillig M.C., 2007. The arbuscular mycorrhizal fungal protein glomalin: Limitations, pro- gress, and a new hypothesis for its function. Pedobiologia 51, 123–130.

Rillig M.C., 2004. Arbuscular mycorrhizae and terrestrial ecosystem processes. Ecol. Lett. 7, 740–754.

Rillig M.C., Steinberg P.D., 2002. Glomalin production by an arbuscular mycorrhizal fungus: a me- chanism of habitat modification? Soil Biol. Biochem. 34, 1371–1374.

Schindler F.V., Mercer E.J., Rice J.A., 2007. Chemical characteristics of glomalin-related soil pro- tein (GRSP) extracted from soils of varying organic matter content. Soil Biol. Biochem.

39, 320–329.

Wang S., Wu Q.-S., He X.-H., 2015. Exogenous easily extractable glomalin-related soil protein promotes soil aggregation, relevant soil enzyme activities and plant growth in trifoliate orange. Plant Soil Environ. 61 (2), 66–71.

Wright S.F., Anderson R.L., 2000. Aggregate stability and glomalin in alternative crop rotations for the central Great Plains. Biol. Fert. Soils 31, 249–253.

Wright S.F., Franke-Synder M., Morton J.B., Upadhyaya A., 1996. Time course study and partial characterization of a protein on hyphae of arbuscular mycorrhizal fungi during active colonization of roots. Plant Soil 181, 193–203.

Wright S.F., Upadhyaya A., 1996. Extraction of an abundant and unusual protein from soil and com- parison with hyphal protein from arbuscular mycorrhizal fungi. Soil Sci. 161, 575–586.

Wu Q.S., Li Y., Zou Y.N., He X.H., 2015. Arbuscular mycorrhiza mediates glomalin-related soil protein production and soil enzyme activities in the rhizosphere of trifoliate orange grown under different P levels. Mycorrhiza 25, 121–130.

CAN SOIL PROTEINS BE PRESENT IN THE SOIL EVEN 20 YEARS?

ASSESSMENT OF TOTAL AND EASY EXTRACTABLE GLOMALIN CONTENTS IN ARCHIVAL SAMPLES OF SOIL

Summary. Glomalines are thermostable, water-insoluble glycoproteins abundantly pro- duced by Glomus fungi and tends to accumulate in the soil, that surrounds soil aggregates and protects them from destroying. Glomalines are especially resistant to destruction, hard to dissolve in water, while very easy dissolve in high temperature (121°C) in citrate buffer with neutral or alkali pH. These proteins have very unique physico-chemical properties performing a fundamental role in making soil structure. The content of glomalin in soil particles is significantly correlated with their stability (water resistance). It is possible that glomalin is involved in the formation of hydrophobic properties of soil, improving water and air relations in soil. Glomalines are mainly located on the surface of hyphae and spores of AM (arbuscular mycorrhizal) fungi and a hydrophobic substances covers and protects it from the degradation by other microorganisms. It also increases the stiffness and the durability of the cell of fungi facilitating their distribution in the soil. Production and dis- tribution of glomalin in soil involves many factors, both related to the physico-chemical properties of soil and plant and fungal species. The structure of soil and its chemical proper- ties have a significant effect on the growth of mycelium, and therefore the glomalin content.

Glomalins are very resistant to degradation. As aging hyphae outside the root and the roots of plants, biomass mycelium of AMF fungi is degraded – but not glomalin.

This protein is unchanged is able to survive in the soil even decades. Glomalins commonly occur in different types of soils.

The aim of the study was to demonstrate the presence of total and easy extractable glo- malins in archival samples of soil from the collection of soil Department of Microbiology IUNG-PIB in Puławy. The study selected 20 soil samples from field trials in 1994 with the cultivation of barley. The soil samples survey from various Polish regions and represented different types of soils. Soils were characterized by different physical, chemical and bio- logical properties. The studies carried out in this paper have shown the contents of glomalin in all soil samples. The concentration of total and easily extracted glomalin depend mainly on the type of soil. The presence of glomalin in soils confirms the hypothesis that these proteins are particularly resistant to degradation and can remain unchanged in the soil even decades.

Key words: glomalin, total glomalin, easily extractable glomalin, glomalin-related soil protein, soil, mycorrhiza

nr 587, 2016, 23–30

arkadiusz.telesinski@zut.edu.pl

© Copyright by Wydawnictwo SGGW

PORÓWNANIE EKOTOKSYCZNOŚCI

1-BUTYLO-2,3-DIMETYLOIMIDAZOLIOWYCH CIECZY JONOWYCH Z ANIONEM TETRAFLUOROBORANOWYM I HEKSAFLUOROFOSFORANOWYM W STOSUNKU DO WYBRANYCH ENZYMÓW GLEBOWYCH

Arkadiusz Telesiński

, Robert Biczak

, Barbara Pawłowska

, Michał Stręk

, Maciej Płatkowski

1 Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie

2 Akademia im. Jana Długosza w Częstochowie

Streszczenie. Celem podjętych badań było określenie oddziaływania dwóch 1-butylo- -2,3-dimetyloimidazoliowych cieczy jonowych z różnymi anionami: tetrafluoroborano- wym [BMMIM][BF4] i heksafluorofosforanowym [BMMIM][PF6] na aktywność wy- branych enzymów glebowych: dehydrogenaz, fosfatazy kwaśnej, fosfatazy zasadowej oraz ureazy. Badania przeprowadzono na piasku gliniastym o zawartości węgla orga- nicznego 9,50 g·kg^–1. Do gleby wprowadzono wodne roztwory [BMMIM][BF4] lub [BMMIM][PF6] w ilościach: 0, 1, 10, 50, 100, 400, 700 i 1000 mg·kg^–1 s.m. Tak przygo- towaną glebą napełniano wazony, do których następnie wysiano po 15 nasion jęczmienia jarego lub rzodkiewki. Przez cały okres badań utrzymywano stałą temperaturę 20 ±2°C oraz wilgotność na poziomie 70%. W 14. dniu doświadczenia oznaczono spektrofotome- trycznie aktywność wymienionych enzymów. Wprowadzenie do gleby [BMMIM][BF4]

i [BMMIM][PF6] spowodowało inhibicję aktywności wszystkich enzymów glebowych, pogłębiającą się wraz ze wzrostem dawki analizowanych substancji. Spośród ozna- czanych enzymów najbardziej wrażliwa na obecność obu cieczy jonowych okazała się fosfataza kwaśna. Jedynie po aplikacji analizowanych związków, w dawce 1000 mg·kg^–1, największa inhibicja aktywności wystąpiła w przypadku ureazy.

Słowa kluczowe: ciecze jonowe, gleba, dehydrogenazy, ureaza, fosfatazy, wskaźnik opor- ności

24 A. Telesiński i inni

Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych WSTĘP

Aktualnie na całym świecie prowadzi się coraz więcej badań nad syntezą i właści- wościami cieczy jonowych, które wskazują na możliwość praktycznego ich zastoso- wania [Pham i in. 2010]. Pierwszym opisanym przez Waldena w 1914 roku związkiem tego typu był azotan etyloamoniowy [C₂H₅NH₃]⁺[NO₃]ˉ, ale szersze zainteresowanie cieczami jonowymi datuje się na 1990 rok, kiedy to odkryto możliwości ich wykorzy- stania jako środowiska reakcji [Majewska i Białecka-Florjańczyk 2010]. Ze względu na swoje właściwości stały się one głównymi rozpuszczalnikami w tzw. zielonej chemii, znajdując szerokie zastosowanie w takich dziedzinach nauki, jak: synteza organiczna, biokataliza, elektrochemia, chemia analityczna i wiele innych [Liu i in. 2006, Matzke i in. 2009].

W odróżnieniu od rozpuszczalników organicznych ciecze jonowe są płynnymi solami całkowicie zbudowanymi z jonów. Składają się one zazwyczaj z dużego organicznego kationu oraz o wiele mniejszego nieorganicznego lub organicznego anionu [Stepnowski 2005]. Ładunek dodatni w tych solach zlokalizowany jest na atomie azotu, fosforu lub siarki [Pernak i in. 2005]. Wśród cieczy jonowych poszukuje się związków chemicznych o właściwościach biobójczych, które mogłyby zastąpić komercyjnie stosowane, niebez- pieczne dla zdrowia i życia człowieka biocydy [Janiszewska i in. 2010].

W praktyce najczęściej stosowane są ciecze jonowe imidazoliowe i pirydyniowe. Naj- bardziej popularne i najdokładniej przebadane są z kolei pochodne 1-alkilo-3-metyloimi- dazoliowe [Docherty i in. 2007].

Słaba prężność par cieczy jonowych bywa często utożsamiana z brakiem ich szkod- liwego oddziaływania na środowisko. Nie można jednak wykluczyć, że w wyniku do- brej rozpuszczalności w wodzie cieczy jonowych, ich resztkowe pozostałości znajdują się w ściekach i środowisku. Źródłem zanieczyszczenia środowiska mogą być również produkty i odpady zawierające ciecze jonowe. Pod uwagę należy brać także zanieczysz- czenia wprowadzane bezpośrednio do środowiska wodno-glebowego, w wyniku różno- rakich zdarzeń incydentalnych takich jak awarie urządzeń technologicznych oraz pojaz- dów transportowych [Amde i in. 2015]. Rozpuszczalność w wodzie, a także zdolność do tworzenia wiązań wodorowych wpływają w znaczący sposób na szybkość dystrybucji, biodostępność, potencjał biodegradacyjny oraz bioakumulację cieczy jonowych w śro- dowisku. Związki rozpuszczalne w wodzie rozprzestrzeniają się najszybciej zarówno w środowisku glebowym, jak i wodnym, będąc łatwiej dostępnymi dla mikroorganizmów oraz organizmów wyższych [Zhao i in. 2007]. Wiele cieczy jonowych zawiera w anionie atomy fluoru. Aniony takie mogą w środowisku ulegać hydrolizie, czego efektem może być powstawanie toksycznego fluorowodoru [Swatlowski i in. 2003].

Precyzyjną miarą stanu ekochemicznego gleb, uwzględniającą zarówno pojemność homeostatyczną danego ekosystemu ekologicznego, jak i poziom zanieczyszczenia śro- dowiska, który zagraża organizmom żywym, jest aktywność enzymów glebowych [Bie- lińska i Mocek 2010].

Celem podjętych badań było więc określenie oddziaływania dwóch cieczy jonowych:

tetrafluoroboranu 1-butylo-2,3-dimetyloimidazoliowego [BMMIM][BF4] i heksafluoro- fosforanu 1-butylo-2,3-dimetyloimidazoliowego [BMMIM][PF6] na aktywność dehy- drogenaz, fosfataz i ureazy.