Absorpcja dwufotonowa pochodnych diketopirolopiroli

Ważne miejsce wśród barwników o budowie kwadrupolowej zajmują diketopirolopirole. Ich niewątpliwe zalety, o których wspominałam we wstępie do niniejszej pracy przekładają się na wciąż rosnącą popularność tego układu w chemii organicznej i materiałowej. W 2014 roku ukazało się ponad 250 artykułów i 24 patenty, zaś w 2015 opublikowano prawie 300 artykułów i 22 patenty. Do tej pory ukazało się również

wiele przeglądów literaturowych dotyczących syntezy, właściwości i potencjalnych zastosowań tej grupy związków.⁷⁵

Pierwszą publikacją opisującą właściwości nieliniowe diketopirolopiroli był artykuł Yanga z 2009 roku.⁷⁶ Elektronodonorowe podstawniki aromatyczne w postaci ugrupowania difenyloaminy w połączeniu z elektronoakceptorowym rdzeń DPP okazały się mieć bardzo korzystny wpływ na własności nieliniowe, podnosząc przekrój czynny na absorpcję dwufotonową 10-krotnie dla związku 130 w porównaniu do cząsteczki z atomami bromu (związek 129, Rysunek 61). Maksima absorpcji jedno- i dwufotonowej, a także fluorescencji były przesunięte batochromowo. Niestety powiększenie chromoforu o dodatkowe pierścienie benzenowe (związek 131) spowodowało spadek przekroju czynnego na absorpcję dwufotonową. W tym przypadku oddalenie podstawników elektronodonorowych korzytsnie wpływające na moment kwadrupolowy cząsteczki, a przez to na absorpcję dwufotonową, zostało zniwelowane przez zmniejszenie sprzężenia między elementami cząsteczki.

Rysunek 61.

Wysokie wartości przekrojów czynnych na absorpcję dwufotonową pochodnych diketopirolopiroli zachęciły naukowców do badań mających na celu zastosowanie tych związków w praktyce. W 2013 roku Bolze i współpracownicy opublikowali artykuł prezentujący wykorzystanie pochodnych DPP w mikroskopii fluorescencyjnej wzbudzanej dwufotonowo.⁷⁷ Naukowcy zsyntetyzowali związki 132 i 133 (Rysunek 62), których podstawniki estrowe zostały wprowadzone, aby sprawdzić, jaki rodzaj połączenia

chromoforu z peptydem będzie najbardziej korzystny dla własności optycznych. Okazało się, że dla związku 133 z symetrycznymi podstawnikami aromatycznymi zaś różnymi podstawnikami na amidowym atomie azotu maksima absorpcji i emisji przesunięte są batochromowo, zaś przekrój czynny na absorpcję dwufotonową dwukrotnie wyższy niż dla związku 132.

Rysunek 62.

Następnie autorzy zsyntetyzowali związki 134 i 135 (Rysunek 63) posiadające łańcuchy peptydowe i użyli ich do wybarwienia komórek HeLa. Również w tym przypadku znacznie lepszy wynik uzyskano dla związku o symetrycznie ułożonych podstawnikach arylowych, gdyż dla związku 134 zauważono równomierne rozłożenie barwnika w całej objętości próbki, zaś związek 135 powodował pojawienie się wybarwionych plamek (głównie wewnątrz komórki).

Rysunek 63.

W kolejnych latach rozwijano nie tylko bibliotekę barwników, które można użyć w mikroskopii fluorescencyjnej wzbudzanej dwufotonowo, ale również techniki pozwalające wykorzystać te barwniki, które nie są wystarczająco rozpuszczalne w układach biologicznych. W celu ułatwienia tworzenia zawiesin w wodzie oraz zwiększenia biokompatybilności barwniki organiczne można umieszczać za pomocą odpowiednich technik w nanokapsułach. Wykorzystali to Liu, Hua i współpracownicy w pracy opublikowanej w 2015 roku.⁷⁸ Zsyntezowali oni dwa barwniki z DPP w roli jednostki centralnej (Rysunek 64). Struktury zaprojektowanych związków wynikają z kompromisu pomiędzy dążeniem do wysokiego przekroju czynnego na absorpcję dwufotonową a umożliwieniem zachodzenia zjawiska emisji indukowanej agregacją (AIEE, ang.

aggregation-induced emission enhancement). Powszechne dla związków o płaskiej strukturze zmniejszenie fluorescencji po wytrąceniu związku wynika z łatwości niepromienistej utraty energii. Aby temu zapobiec często stosuje się elementy o strukturze śmigła, co w opisywanym powyżej przypadku zapewnione jest przez obecność grup trifenyloaminowych.

Oba zsyntetyzowane przez autorów związki (136 i 137) charakteryzują się wysokimi współczynnikami absorpcji, zaś położenie jego maksimum oraz intensywność fluorescencji zależy od polarności rozpuszczalnika. Druga obserwacja wynika z zachodzenia zjawiska podwójnej fluorescencji (TICT, ang. twisted intramolecular charge transfer), które związane jest ze skręceniem cząsteczki wokół wiązania pojedynczego łączącego jej elektronodonowe i elektronoakceptorowe części w stanie wzbudzonym.⁷⁹ Zgodnie z oczekiwaniami dodawanie wody do rozpuszczonych w tetrahydrofuranie związków powodowało wzrost wydajności kwantowej fluorescencji, co związane jest z agregacją cząsteczek barwnika. Autorzy podkreślają również wysokie wartości przekroju czynnego na absorpcję dwufotonową obu barwników (powyżej 8000 GM), przy czym wprowadzenie grupy fenyloakrylonitrylowej uniemożliwiającej wypłaszczenie struktury całej cząsteczki związku 137 umożliwia zachodzenia zjawiska TICT z pominięciem rdzenia DPP obniżając intensywność absorpcji dwufotonowej w stosunku do związku 136. Pomiary z użyciem nanocząstek również okazały się pomyślne, czego dowodem są zamieszczone w publikacji zdjęcia naczyń krwionośnych wykonane przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej wzbudzanej dwufotonowo z zastosowaniem barwnika 137 zamkniętego w nanokapsułkach.

Rysunek 64.

Jednak nie tylko rozbudowane chromofory są obiektem zainteresowania naukowców. Dwa przykłady diketopirolopiroli z heteroaromatycznymi podstawnikami zostały gruntownie przebadane przez Belfielda i współpracowników.⁸⁰ Mono N-podstawione diketopirolopirole 138 i 139 (Rysunek 65) charakteryzowały się niską zależnością położenia maksimów absorpcji i fluorescencji od polarności rozpuszczalnika oraz wysokimi wydajnościami kwantowymi fluorescencji. Przekroje czynne na absorpcję dwufotonową dla obu związków dochodziły do 60-100 GM. Różnice w absorpcji dwufotonowej dla związków o sześcio- i pięcioczłonowych pierścieniach aromatycznych przyłączonych do rdzenia DPP okazały się niewielkie z powodu płaskiej struktury obu barwników. Pomimo braku podstawnika na jednym z amidowych atomów azotu związek 138 spełnia regułę określoną dla związków centrosymetrycznych mówiącą, że przejścia elektronowe dozwolone dla absorpcji jednofotonowej są wzbronione dla absorpcji dwufotonowej, zaś przejścia elektronowe dozwolone dla absorpcji dwufotonowej są wzbronione dla absorpcji jednofotonowej. Dla wspomnianego barwnika można to zaobserwować porównując absorpcję jednofotonową, która jest najwyższa w zakresie

400-500 nm, z relatywnie niską absorpcją dwufotonową w zakresie 800-1000 nm, odpowiadającym tej samej energii przejścia elektronowego.

Rysunek 65.

Dokładne badania wykazały również, że dla związków 138 oraz 139 zachodzi zjawisko tzw. superfluorescencji. Polega ono na jednoczesnej emisji fotonów przez grupę atomów lub jonów, pojawiającej się z pewnym opóźnieniem w stosunku do impulsu wzbudzenia i trwającej krócej niż czas życia atomu w stanie wzbudzonym.

Dużym problemem w mikroskopii fluorescencyjnej, w tym wzbudzanej dwufotonowo, jest niska wydajność kwantowa fluorescencji barwników w wodzie.

Oznacza to, że nie zawsze synteza barwników z hydrofilowymi podstawnikami gwarantuje możliwość zastosowania ich w praktyce. Gryko i współpracownicy zsyntezowali trzy barwniki (140, 141 i 142, Rysunek 66), których wysoka rozpuszczalność w wodzie idzie w parze z doskonałymi własnościami optycznymi w tym rozpuszczalniku.⁸¹ Intensywność absorpcji rośnie, gdy zmieniają się pierścienie aromatyczne połączone bezpośrednio z rdzeniem DPP w kolejności: fenyl, tiofenyl i furyl. Jeszcze silniej zmiany strukturalne wpływają na absorpcję dwufotonową. W przypadku pierścieni pięcioczłonowych przekrój czynny na absorpcję dwufotonową jest rząd wielkości większy niż dla sześcioczłonowego pierścienia fenylowego, który ogranicza możliwość wypłaszczenia chromoforu. Niestety dla wszystkich związków wydajność kwantowa fluorescencji jak również przekrój czynny na absorpcję dwufotonową wyraźnie maleje przy zmianie rozpuszczalnika z DMSO na wodę. Mimo to jaskrawość dwufotonowa uzyskanych barwników jest wystarczająca do wykorzystania ich w mikroskopii fluorescencyjnej wzbudzanej dwufotonowo, tym bardziej, że są one w stanie selektywnie wybarwiać mitochondria.

Rysunek 66.

Biokompatybilność powyższych związków została osiągnięta przez umieszczenie w aromatycznej części cząsteczki podstawników ułatwiających m.in. rozpuszczanie w wodzie. Zamiast tego można wykorzystać podstawniki alkilowe amidowych atomów rdzenia diketopirolopirolu. Tę strategię wykorzystali Romieu, Ziessel i współpracownicy syntetyzując kolejne barwniki rozpuszczalne w wodzie (związki 143 i 144, Rysunek 67), które ponadto charakteryzowały się bardzo wysoką fluorescencją w roztworach wodnych (odpowiednio 0,61 i 0,90).⁸² Wykorzystano, więc kwasy karboksylowe będące bezpośrednimi prekursorami opisywanych barwników do połączenia chromoforu z białkiem. Był to pierwszy przypadek białka znakowanego przez DPP, a zsyntetyzowane biokoniugaty nadal posiadały wysokie wydajności kwantowe fluorescencji (powyżej 0,30).

Rysunek 67.

W celu uzyskania ciekawych własności optycznych coraz częściej stosuje się łączenie kilku chromoforów. Połączenie elektronoakceptorowych diketopirolopiroli z elektronodonorowymi makrocyklicznymi porfirynami można w tym kontekście uznać za bardzo obiecujące. Pierwszym połączeniem o strukturze kwadrupolowej, w którym rdzeń

DPP był otoczony dwiema jednostkami porfirynowymi był związek 145 (Rysunek 68),⁸³ jednak z uwagi na znaczne zwiększenie wielkości cząsteczki w stosunku do niewiele poprawionych własności optycznych w dalszych pracach skupiono się na barwnikach z jedną jednostką porfirynową.⁸⁴ Opublikowany w 2015 roku przez Heitza, Bolzego, Venturę i współpracowników związek 146 wykazywał dwa maksima absorpcji dwufotonowej ze znacznymi wartościami przekroju czynnego na absorpcję dwufotonową (najwyższymi w porównaniu do analogicznych związków z jedną lub czterema strukturami DPP).⁸⁵ Szansę na zastosowanie powyższego związku w roli fotouczulacza w terapii fotodynamicznej zwiększają dodatkowo jego cechy takie, jak: szybkie wnikanie do komórek, rozpuszczalność w wodzie i DMSO oraz wydajna fotokataliza otrzymywania tlenu singletowego (chociaż mniejsza niż dla porfiryny niepołączonej z DPP). Badania biologiczne potwierdziły wysoką fototoksyczność związku 146.

Rysunek 68.