Adhezyny

Adhezyny warunkują przyleganie bakterii do komórek nabłonka dróg moczowych, umożliwiają kolonizację zajmowanej powierzchni oraz chronią komórki bakteryjne przed usunięciem podczas mikcji (Chmielewska i wsp. 2016). Ważną grupą adhezyn warunkującą wiązanie komórek bakteryjnych z nabłonkiem dróg moczowych są adhezyny fimbrialne.

Fimbrie są sztywnymi struktury białkowymi o długości około 1-3 µm i szerokości kilku nanometrów. Sztywność fimbrii ułatwia pałeczkom E. coli przeciwstawianie się nieregularnemu przepływowi moczu w cewce moczowej. Fimbrie są heterokompleksami składającymi się z podjednostek białkowych (fibrynoliny) tworzących strukturę wypustki i monomerów mniejszych podjednostek, odpowiedzialnych za wydłużanie wypustek, ich

28 stabilność oraz funkcje wiążące (Schwan i wsp. 2002, Andersson i wsp. 2007, Mirecka 2011).

Na szczycie takiej struktury znajduje się element rozpoznający receptor na komórkach nabłonkowych. W patogenezie ZUM największe znaczenie mają fimbrie typu 1, fimbrie typu P oraz adhezyny z rodziny białek Dr/Afa (Pickner i wsp. 2006, Dzierżanowska 2008).

2.5.1.1 Fimbrie typu 1

Fimbrie typu 1zwane pospolitymi są najczęstszym typem fimbrii występującym u UPEC. Występują u bakterii kolonizujących dolne odcinki układu moczowego.Obecność tych fimbrii stwierdzono u szczepów odpowiedzialnych za zapalenie pęcherza moczowego, natomiast rzadko wykazywano ich obecność u pałeczek E. coli izolowanych od pacjentów z zapaleniem nerek (Hermann i wsp. 2002, Andersson i wsp. 2007).

Schwan i wsp. (2002) stwierdzili, że ponad 85% szczepów E. coli posiada geny kodujące ten typ fimbrii, natomiast ponad 70% szczepów wytwarza je na swej powierzchni.

Badania przeprowadzone przez Hung i wsp. (2013) wykazały, że odgrywają one kluczową rolę w stabilności i rozwoju struktury biofilmu oraz biorą udział w stymulowaniu bakteryjnej autoagregacji. Adhezja bakterii z udziałem tych fimbrii jest niezbędna do utrzymania spójności tworzonej biomasy biofilmu. Wykazano, że szczepy z niefunkcjonalnym białkiem FimH, tworzyły cieńszy i słabszy biofilm z widocznymi zaburzeniami integralności w strukturze biofilmu (Beloin i wsp. 2008). Floyd i wsp. (2015) wykazali, że fimbrie typu 1 występują głównie u bakterii tworzących górną warstwę biofilmu, do której wnika tlen.

Pośrednicząc w formowaniu biofilmu ułatwiają szczepom UPEC kolonizację cewników lub implantów (Mulvey 2002, Pinkner i wsp. 2006, Mirecka 2011, Hung i wsp. 2013). Fimbrie typu 1 zakończone są białkiem FimH, które jest ważnym czynnikiem wirulencji UPEC.

Komórki pozbawione FimH nie kolonizują dróg moczowych, a zmiany w tym białku prowadzą do utraty właściwości inwazyjnych szczepów E. coli (Säemann i wsp. 2005, Dybowski 2007). W drogach moczowych białko FimH łączy się z receptorem uroplakinowym 1a (UP1a) komórek nabłonka pęcherza moczowego zawierającym reszty mannozowe (Bouckaert i wsp. 2006, Pinkner i wsp. 2006, Witkowska i wsp. 2009, Mirecka 2011).

Wykazano, że około 80% komensalnych izolatów E. coli wytwarza białko FimH wiążące tylko trimannozowe receptory, natomiast około 70% izolatów UPEC wytwarza zmienione białko FimH o dużym powinowactwie także do monomannozowych receptorów, co zwiększa stopień kolonizacji układu moczowego przez te szczepy(Muelvey 2002). Ważnym mechanizmem chroniącym drogi moczowe przed inwazją bakteryjną jest białko

Tamma-29 Harsfalla wydzielane przez nerki w pętli Henlego. Białko Tamma-Harsfalla zawierające łańcuch o wysokiej zawartości mannozy wiąże się z FimH, uniemożliwiając związanie bakterii z receptoremUP1a komórek nabłonka pęcherza moczowego(Säemann i wsp. 2005).

Uroplakiny umiejscowione w błonie komórek urotelialnych są glikoproteinami, które mają za zadanie uszczelnić urotelium, co zmniejsza jego przepuszczalnośćdla jonów i substancji rozpuszczonych w moczu (Connell i wsp. 1996, Zhou i wsp. 2001, Apodaca 2004, Säemann i wsp. 2005, Dybowski 2007).

Fimbrie typu 1 należą do grupy fimbrii mannozowrażliwych. Receptory na powierzchni tkanek zawierające mannozę są łatwo rozpoznawane przez fimbrie typu 1, które umożliwiają ścisłą przyczepność w obliczu naprężeń mechanicznych występujących w pęcherzu moczowym (Thomas i Elkinton 2004). E. coli wiążąc się z β1 integrynami wykorzystuje kilka strukturalnych komponentów komórki gospodarza, w tym cytoszkielet aktynowy, mikrotubule i lipidy, aby wejść do komórki (Eto i wsp. 2007, Dhakal i Mulvey 2009). Fimbrie typu 1 wywołują silną reakcję ze strony komórek układu odpornościowego, tj. leukocytów obojętnochłonnych (wielojądrzastych), makrofagów i limfocytów. Ekspresja fimbrii typu 1 podlega zjawisku zmienności fazy, polegającemu na włączeniu lub wyłączeniu stanu ufimbriowania przez poszczególne komórki. Obecne w pęcherzu moczowym komórki E. coli syntetyzują ten rodzaj fimbrii, natomiast te same komórki w nerce nie wytwarzają tych struktur. Wyłączenie syntezy fimbrii przez komórki bakteryjne w nerkach osłabia reakcję obronną ze strony leukocytów obojętnochłonnych (Wyszyńska 1991). Fimbrie typu 1 łączą się z receptorami glikoproteinowymi obecnymi na leukocytach wielojądrzastych, co zapoczątkowuje reakcję zapalną, a uwolnione z leukocytów liczne substancje (enzymy lizosomalne, nadtlenki i wolne rodniki) o działaniu bakteriobójczym uszkadzają tkankę nerkową powodując martwicę i utratę czynnego miąższu podczas odmiedniczkowego zapalenia nerek (Krzeska i wsp. 1992). Komórkami układu odpornościowego pierwszej linii obrony podczas infekcji układu moczowego są mastocyty (komórki tuczne), licznie występujące bezpośrednio pod nabłonkiem pęcherza moczowego, w śluzówce, blaszce właściwej śluzówki oraz w mięśniu pęcherza. Szczepy E. coliwytwarzające fimbrie typu 1 powodują wzrost wydzielania histaminy przez komórki tuczne. Wydzielanie histaminy jest połączone z wydzielaniem innych substancji chemotaktycznych dla leukocytów, takich jak leukotrien B4. Substancje te odpowiadają za obserwowany w przebiegu zakażenia ropomocz, a także za typowe objawy zapalenia pęcherza moczowego, jak częstomocz, moczenie nocne, parcie na mocz i odczucia bólowe. Ból jest wywołany przez histaminę i bradykininę,

30 działająca na zakończenia nerwowe. Histamina powoduje także pobudzenie mięśnia wypieracza i nadmierną kurczliwość pęcherza (Soman i wsp. 2001, Dzierżanowska 2008). Na komórkach nabłonkowych dróg moczowych znajdują się receptory typu Toll, rozpoznające antygeny bakteryjne. Związanie fimbrii z receptorem aktywuje komórki nabłonkowe do

wytwarzania mediatorów stanu zapalnego, takich jak białka dopełniacza, peptydów o działaniu bakteriobójczym, cytokin, chemokin, defensyn i cząsteczek adhezyjnych.

W rezultacie rozwija się stan zapalny, sprzyjający eliminacji uropatogenów, ale jednocześnie powodujący uszkodzenie nerek. Poza podstawową funkcją fimbrii typu 1, jaką jest pośredniczenie w adhezji do komórek nabłonkowych gospodarza, fimbrie typu 1 odgrywają rolę w inwazji bakterii do komórek nabłonkowych. Inwazja do wnętrza komórek umożliwia rozprzestrzenianie zakażenia w tkankach i jednocześnie jest ucieczką bakterii z wrogiego jej środowiska, w którym działają liczne czynniki przeciwbakteryjne takie jak przeciwciała, dopełniacz i defensyny (Säemann i wsp. 2005, Dzierżanowska 2008).

2.5.1.2. Fimbrie typu P

Fimbrie typu P należą do grupy fimbrii określanych jako mannozooporne. Ten typ fimbrii występuje powszechnie u szczepów E. coli odpowiedzialnych za ostre odmiedniczkowe zapalenie nerek. Obecność fimbrii typu P wykazano u 94% szczepów E. coli wyizolowanych z przypadków odmiedniczkowego zapalenia nerek (Baka-Ostrowska 2006, Watts i wsp. 2012). Natomiast według Kallenius (1981),odsetek szczepów mających fimbrie typu P wyizolowanych z przypadków zapalenia pęcherza wynosił 19%, z przypadków bezobjawowej bakteriurii 17% i tylko 7% szczepów E. coli wyizolowanych od zdrowych dzieci wytwarzało ten typ fimbrii. Fimbrie typu P kodowane są przez geny operonu papA-K, który może być zlokalizowany na jednej lub kilku wyspach patogenności (Rasko i wsp.

2001).Fimbrie typu P zbudowane są z podjednostek PapA. Białko PapH mocuje włókienkowatą strukturę w błonie zewnętrznej komórki bakteryjnej. Podjednostką dystalną tej struktury jest adhezyna PapG. Adhezyna ta wiąże się z disacharydem Gal α-(1-4) Gal, zawartym w glikosfingolipidach błony komórek nabłonkowych występujących w kanalikach nerkowych oraz na powierzchni erytrocytów (Wult i wsp. 2000, Mulvey 2002, Mirecka 2011).

W przebiegu przewlekłej bakteriurii bezobjawowej obecność bakterii mających fimbrie P może sugerować, że w dolnych drogach moczowych występują również miejsca wiązania dla adhezyny PapG, ale nie uaktywnia to reakcji zapalnej (Roberts i wsp. 1994, Wullt i wsp.

2000, Hryniewicz i Sulikowska 2001, Dybowski 2007).

31 W górnych odcinkach układu moczowego strumień moczu jest bardziej regularny niż w dolnych drogach, co sprzyja kolonizacji przez szczepy E. coli posidające fimbrie P, które są bardziej elastyczne w porównaniu z fimbriami typu 1 (Hryniewicz i Sulikowska 2001, Mulvey 2002, Andersson i wsp. 2007). Pałeczki E. coli wytwarzające fimbrie typu P, często także wytwarzają otoczkę polisacharydową i syntetyzują nitrozaminy uszkadzające śluzówkę moczowodu, a to zaburza perystaltykę moczowodów i odpływ moczu (Krzeska i wsp. 1992).

Fimbrie typu P warunkują adhezję komórek bakteryjnych do powierzchni nabłonka, jego kolonizację, a także powstanie silnego stanu zapalnego. Wykazano, że fimbrie P zwiększają odpowiedź ze strony nabłonkowych cytokin, powodują napływ leukocytów wielojądrzastych oraz wzrost poziomu w moczu interleukiny IL-6 i IL-8 (Zhou i wsp. 2001, Mulvey 2002).

Szczepy pozbawione genu pap, kodującego główną podjednostkę fimbrii, nie wywołują odczynu zapalnego. Fimbrie P rozpoznają receptor glikosfingolipidowy na komórkach nabłonkowych dróg moczowych, będący częścią antygenu P1 w układzie grupowym krwi P.

Występuje on na erytrocytach i wszystkich komórkach nabłonkowych. Chorzy posiadający

liczne receptory nabłonkowe podatni są na nawracające zakażenie układu moczowego i częściej obserwowane są u nich niepowodzenia terapeutyczne, mimo stosowania leku

zgodnie z wynikiem badania mikrobiologicznego (Ree i wsp. 1987, Yamamoto 2007, Dzierżanowska 2008).

2.5.1.3. Fimbrie typu S

Fimbrie typu S kodowane są przez operon sfa zlokalizowany w chromosomie, w skład którego wchodzi dziewięć genów. Fimbrie te składają się z dużej podjednostki SfaA oraz trzech mniejszych SfaG, SfaH i SfaS. Jednostka SfaS zlokalizowana jest na końcu cylindrycznej struktury i może pośredniczyć w procesie wiązania się bakterii z resztami kwasu sialowego (α-sjalyl-(2,3)-β-Gal) receptorów komórek nabłonkowych nerek lub śródbłonka naczyń. Fimbrie typu S ułatwiają bakteriom przenikanie w głąb tkanek gospodarza, wykrywane są często u szczepów odpowiedzialnych za posocznicę, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, czy odmiedniczkowe zapalenie nerek. Podczas odmiedniczkowego zapalenie nerek, proces adhezji uruchamia wydzielanie przez komórkę bakteryjną enzymów litycznych, które degradując komórki gospodarza oraz substancje międzykomórkowe, powodują uszkodzenie komórek położonych głębiej. Badania wskazują także na udział bakterii wytwarzających fimbrie typu S w zapaleniu pęcherza, gdyż reszty

32 kwasu sialowego obecne są na UP3, czyli integralnej części uroplakin występujących na powierzchni pęcherza (Mulvey 2002, Müller i wsp 2005, Dybowski 2007, Mirecka 2011).

2.5.1.4. Adhezyny z rodziny białek Dr/Afa

Białka adhezyjne z rodziny Dr obejmują adhezyny fimbrialne Dr i niefimbrialne AFA-I,

AFA-II, AFA-III, AFA-IV, NFA-I Dr-II. Fimbrie Dr o strukturze homopolimerycznej o średnicy około 2 nm zbudowane są z podjednostek białkowych DraE i kodowane są przez

operon dra posiadający sześć otwartych ramek odczytu (ORF): draA, draB, draC, draD, draE i draP. Geny operonu dra kodują białko DraP oraz DraA, odpowiedzialne za regulację procesu transkrypcji operonu. Zewnętrzne białko DraC będące miejscem polimeryzacji fimbrii oraz opiekuńcze periplazmatyczne białko DraB zaangażowane są w biosyntezę fimbrii, natomiast podjednostka inwazyjna DraD i fimbrialna DraE umożliwiają internalizację pałeczek E. coli Dr⁺ w komórkach nabłonkowych dróg moczowych, co sprawia, że ich eliminacja przez układ odpornościowy lub antybiotyki jest bardzo trudna. Nawracające zakażenia w przypadku bakterii Dr⁺ są dwa razy częstsze (Mulvey 2002, Mirecka 2011).

Badania epidemiologiczne przypadków ZUM i biegunek wskazują na predyspozycje dzieci i kobiet ciężarnych do zakażeń o etiologii E. coli wykazujących ekspresję adhezyn Dr⁺. Wytwarzanie adhezyn Dr⁺ wykazano u około 50% szczepów E. coli wyizolowanych z moczu dzieci z ZUM. U dorosłych, szczególnie młodych kobiet niebędących w ciąży, E. coli Dr⁺ rzadko powodują zapalenie pęcherza i odmiedniczkowe zapalenie nerek. Natomiast u kobiet w trzecim trymestrze ciąży pałeczki E. coli Dr⁺ powodują około 30-40% wszystkich przypadków odmiedniczkowego zapalenia nerek. Ponadto stwierdzono, że zakażenie E. coli Dr⁺ zwiększa ryzyko przejścia zakażenia w stan przewlekły (Nowicki 2001, Servin 2005, Mirecka 2011, Bury 2015). Receptory dla adhezyn Dr/Afa, będące antygenem grupowym krwi Dr(a+) i składnikiem cząsteczki regulatorowej dopełniacza DAF (ang. Deccay Accelerating Factor), znanej jako CD55, znajdują się na komórkach nabłonkowych układu moczowego, oddechowego, pokarmowego i płciowego. DAF czyli tzw. czynnik przyspieszający rozkład chroni tkanki przed uszkodzeniem przez autologiczny atak dopełniacza. W czasie ciąży, pod wpływem progesteronu, wzrasta ekspresja receptora DAF w celu ochrony płodu przed cytotoksycznym działaniem układu dopełniacza. Większa liczba receptorów dla E. coli Dr⁺ ułatwia kolonizację, adhezję i rozwój zakażenia. Związanie adhezyn Dr z leukocytami wielojądrzastymi nie zawsze prowadzi do zabicia bakterii.

Oporność na fagocytozę bakterii wytwarzających adhezynę Dr może być kolejnym istotnym

33 czynnikiem w przechodzeniu zakażenia w stan przewlekły. Rozpoznawanie receptorów na błonie podstawnej kanalików nerkowych oraz w torebce Bowmana pozwala bakteriom na zajęcie nerek (Dzierżanowska 2008). Innym receptorem wiążącym adhezyny Dr jest kolagen

typu IV, obecny w błonie podstawnej nabłonka dróg moczowych, który nie wiąże się z adhezynami Afa (Mirecka 2011). Za właściwości chorobotwórcze szczepów E. coli

odpowiedzialne są głównie DraE/AfaE oraz DraD/AfaD, które łączą się z komórkami gospodarza. Wykazano, że w przypadku AfaE-I istnieje 32% homologia z adhezynami Dr, z kolei sekwencja aminokwasowa Afa-III wykazuje aż 98% zgodność z Dr (Servin 2005, Zalewska-Piątek 2013).