1
UNIWERSYTET PRZYRODNICZO - HUMANISTYCZNY
W SIEDLCACH
WYDZIAŁ PRZYRODNICZY
Jolanta Marzena Wicha
Fenotypowe i genotypowe cechy pałeczek Escherichia coli wyizolowanych od osób z zakażeniem układu moczowego
Rozprawa doktorska
wykonana w Zakładzie Mikrobiologii Instytutu Biologii
Promotor
dr hab. Barbara Kot, prof. nzw.
Siedlce, 2018
2
Składam serdeczne podziękowania Pani prof. nzw. dr hab. Barbarze Kot za opiekę naukową i udzieloną mi pomoc
oraz wskazówki merytoryczne, przydatne w czasie powstawania i redagowania niniejszej rozprawy.
Dziękuję za życzliwość i wyrozumiałość
pracownikom Zakładu Mikrobiologii, Instytutu Biologii, UPH w Siedlcach.
3
Phenotypic and genotypic traits of Escherichia coli bacilli isolated from people with urinary tract infection
Słowa kluczowe: Escherichia coli, zakażenia układu moczowego, wrażliwość na substancje przeciwdrobnoustrojowe, geny wirulencji, biofilm
Key words: Escherichia coli, urinary tract infection, sensitivity to antimicrobial substances, virulence genes, biofilm
4
Spis treści
1. Wstep……… 77
2. Przegląd piśmiennictwa……… 9
2.1. ZUM jako jedna z najczęstszych infekcji bakteryjnych u ludzi……….. 9
2.1.1. Obraz kliniczny i metody identyfikacji ZUM……….. 10
2.1.2. Czynniki wpływające na wystąpienie ZUM……… 13
2.1.3. Mechanizmy obronne układu moczowego……….. 15
2.1.4. Klasyfikacja ZUM………... 17
2.2. E. coli jako główny czynnik etiologiczny ZUM……….. 19
2.3. Charakterystyka i grupy chorobotwórczych pałeczek E. coli………. 20
2.3.1. Enterotoksynogenne szczepy E. coli (ETEC)………... 22
2.3.2. Enteroinwazyjne szczepy E. coli (EIEC)………. 23
2.3.3. Enteropatogenne szczepy E. coli (EPEC)……… 23
2.3.4. Enterokrwotoczne/werotoksyczne szczepy E. coli (EHEC/VTEC)……. 24
2.3.5. Enteroagregacyjne (enteroadherentne) E. coli (EAEC)………... 25
2.3.6. Szczepy E. coli przylegające dyfuzyjnie (DAEC)………... 26
2.4. Uropatogenne pałeczki E. coli……….. 26
2.5. Czynniki determinujące chorobotwórczość UPEC……….. 27
2.5.1. Adhezyny………. 27
2.5.1.1. Fimbrie typu 1……….. 28
2.5.1.2. Fimbrie typu P………. 30
2.5.1.3. Fimbrie typu S. ……… 31
2.5.1.4. Adhezyny z rodziny białek Dr/Afa……….. 33
2.5.2. Toksyny wytwarzane przez UPEC……….. 33
2.5.2.1. Hemolizyny………... 33
5
2.5.2.2. Cytotoksyczny czynnik nekrotyzujący 1 (CNF1)……… 35
2.5.2.3. Siderofory………. 36
2.6. Antybiotykoterapia ZUM………. 37
2.6.1. Mechanizmy oporności na antybiotyki pałeczek E. coli dpowiedzialnych za ZUM………. 38
3.1. Biofilm bakteryjny……… 40
3. Cel pracy……… 45
4. Materiał i metody……….. 46
4.1. Pobieranie i posiew moczu……… 46
4.2. Ustalenie przynależności izolatów do rodziny Enterobacteriaceae……. 45
4.2.1. Ustalenie przynależności izolatów do gatunku E. coli………. 46
4.3. Ocena wrażliwości pałeczek E. coli na antybiotyki i chemioterapeutyki oraz występowania mechanizmów oporności……… 46
4.3.1. Ocena wrażliwości pałeczek E. coli na antybiotyki i chemioterapeutyki 46 4.3.2. Wykrywanie β-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym Typu ESBL……… 48
4.4. Wykrywanie właściwości hemolitycznych E. coli……… 49
4.5. Wykrywanie obecności genów kodujących wybrane czynniki zjadliwości uropatogennych pałeczek E. coli metodą PCR……….. 49
4.5.1. Izolacja genomowego DNA………. 49
4.5.2. Startery i zastosowane warunki reakcji PCR……… 49
4.6. Określenie przynależności szczepów E. coli do grup filogenetycznych... 51
4.7. Ocena właściwości adhezyjnych szczepów E. coli……… 53
4.7.1. Ocena adhezji do ludzkich i zwierzęcych krwinek czerwonych……….. 53
4.7.2 Ocena ekspresji fimbrii spiralnych……… 54
4.7.3. Ocena adhezji do komórek nabłonkowych układu moczowego………... 54
4.7.4. Ocena zdolności tworzenia biofilmu na cewniku urologicznym……….. 55
4.8. Badanie związków fenolowych jako czynników zapobiegających i eliminujących biofilm utworzony wewnątrz cewnika urologicznego… 55 4.8.1. Zapobieganie tworzeniu biofilmu E. coli wewnątrz cewnika urologicznego……… 56
6 4.8.2. Eliminacja biofilmu E. coli utworzonego wewnątrz cewnika
urologicznego……… 56
4.9. Analizy statystyczne………. 57
5. Wyniki………... 58
5.1. Przynależność izolatów do gatunku E. coli………... 58
5.2. Wrażliwość pałeczek E. coli na antybiotyki i chemioterapeutyki………. 59
5.2.1. Występowanie szczepów wielolekoopornych i wytwarzających β-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) w badanej populacji szczepów E. coli……… 64
5.3. Właściwości hemolityczne szczepów E. coli………. 65
5.4. Występowanie genów kodujących czynniki zjadliwości u szczepów E. coli wyizolowanych od pacjentów z ZUM………... 66
5.5. Przynależność do grup filogenetycznych szczepów E. coli wyizolowanych od pacjentów z ZUM……….. 71
5.6. Właściwości adhezyjne szczepów E. coli wyizolowanych z ZUM…….. 75
5.6.1. Adhezja szczepów E. coli do ludzkich i zwierzęcych krwinek czerwonych……… 75
5.6.2. Występowanie fimbrii spiralnych u szczepów E. coli………... 79
5.6.3. Adhezja pałeczek E. coli do nabłonków pochodzących z dróg moczowych……… 80
5. 5.6.4. Tworzenie biofilmu przez szczepy E. coli na cewniku lateksowym i na cewniku lateksowym opłaszczonym silikonem………. 82
5. 5.7. Związki fenolowe jako czynniki zapobiegające tworzeniu biofilmu oraz eliminujące biofilm E. coli utworzony wewnątrz cewnika urologicznego 84 6.0. Dyskusja……… 88
7.0. Wnioski i stwierdzenia……….. 102
8.0. Streszczenie……… 104
9.0. Summary……… 107
10.0. Przegląd piśmiennictwa………. 109
7
1. WSTĘP
Gatunek Escherichia coli należący do rodziny Enterobacteriaceae obejmuje zarówno szczepy komensalne wchodzące w skład mikrobiomu jelitowego człowieka, jak i szczepy chorobotwórcze powodujące zakażenia przewodu pokarmowego, dróg moczowych, żółciowych, a także uogólnione zakażenia, czyli bakteriemie, posocznice lub zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych (Sobieszczańska, 2007). Niektóre szczepy E. coli pozyskały geny kodujące czynniki wirulencji, które umożliwiły im zasiedlaniew organizmie gospodarza innych miejsc niż przewód pokarmowy. Geny te mogą być zlokalizowane w obrębie chromosomalnych wysp patogenności, na transpozonach, bakteriofagach lub plazmidach, co warunkuje ich transfer do komórek niechorobotwórczych szczepów E. coli lub do komórek innych gatunków. Patogenne szczepy E. coli mają istotne znaczenie w zakażeniach szpitalnych i pozaszpitalnych oraz w zakażeniach związanych ze stosowaniem biomateriałów.
Prawidłowo funkcjonujący układ moczowy jest wolny od drobnoustrojów z wyjątkiem ujścia cewki moczowej. Drobnoustroje kolonizujące cewkę moczową mogą zasiedlać dalsze odcinki układu moczowego oraz wywoływać infekcje dróg moczowych. Zakażenia układu moczowego (ZUM) są najczęstszymi infekcjami wywoływanymi przez bakterie i stanowią 10-20% zakażeń pozaszpitalnych oraz 40-50% wszystkich zakażeń u dorosłych pacjentów hospitalizowanych (Rokosz i wsp. 2005, Bochniewska i wsp. 2006, Walters i wsp. 2012).
Gatunek E. coli jest dominującym patogenem wśród czynników etiologicznych szpitalnych i pozaszpitalnych przypadków ZUM (Drews i wsp. 2005, Bean i wsp. 2008, Alanazi i wsp.
2018). Mimo znacznego postępu w dziedzinie nauk medycznych, diagnostyka i leczenie ZUM należą do poważnych problemów klinicznych. Wynika to z możliwych następstw zakażeń powodowanych przez pałeczki E. coli, do których należą niewydolność nerek, wodonercze, roponercze, urosepsa, bakteriemia, powikłania w okresie ciąży i porodu oraz inne obciążenia organizmu pacjenta, co wymaga indywidualnego rozpatrzenia każdego przypadku ZUM oraz skutecznego leczenia (Dzierżanowska i wsp. 2001, Hryniewicz i wsp. 2001, Jursa i wsp.
2004, Baka-Ostrowska 2006).
Wzrost liczby ZUM powodowanych przez pałeczki E. coli oraz rosnąca liczba szczepów opornych na stosowane antybiotyki w leczeniu infekcji dróg moczowych, uzasadniają konieczność oceny czynników zjadliwości oraz lekowrażliwości pałeczek E. coli,
8 pochodzących z przypadków ZUM. Ważne jest również poszukiwanie czynników alternatywnych w stosunku do antybiotyków, wykazujących aktywność przeciwdrobnoustrojową, które mogłyby być wykorzystywane w zapobieganiu i terapii odcewnikowych ZUM, powodowanych przez pałeczki E. coli.
9
2. PRZEGLĄD PIŚMIENNICTWA
2.1. ZUM jako jedna z najczęstszych infekcji bakteryjnych u ludzi
ZUM należą do najczęstszych, po infekcjach układu oddechowego, zakażeń u pacjentów korzystających z pomocy lecznictwa oraz do najczęstszych chorób wieku
dziecięcego (Shaikh i wsp. 2008, Chlabicz i wsp. 2011). Infekcja dróg moczowych występuje co najmniej raz w życiu u około 10% populacji płci żeńskiej, chociaż zakażenia skąpoobjawowe u kobiet mogą występować nawet dwa razy częściej niż wynika to ze statystyk, natomiast u mężczyzn odnotowuje się zakażenia dróg moczowych u 1-2% populacji (Czekalski 2010, Okrągła i wsp. 2014). Częstość występowania zakażeń dróg moczowych związana jest z budową układu moczowego. Ze względu na możliwość częstych nawrotów i powikłań, ZUM są poważnym problemem zdrowotnym na całym świecie. Około 25-50%
kobiet przechodzących ZUM cierpi na wielokrotne nawroty tej choroby. W praktyce za nawrót ZUM przyjmuje się objawy pojawiające się do 2 tygodni od zakończenia terapii (Foxman 2003, Strus i wsp. 2005, Sheffield 2010). U pacjentów z ostrym zapaleniem pęcherza w 15-50% przypadków rozwija się odmiedniczkowe zapalenie nerek, natomiast u 12% tych pacjentów pojawia się później bakteriemia. Szacuje się, że ZUM stanowią około 10-20% wszystkich zakażeń pozaszpitalnych oraz około 40-50% zakażeń szpitalnych, co wiąże się z koniecznością stosowania leków przeciwbakteryjnych (Mulvey 2002, Bochniewska i wsp. 2006, Shaikh i wsp. 2008, Kiliś-Pstrusińska 2012, Walters i wsp. 2012).
Ryzyko ZUM u pacjentów cewnikowanych zależy od metody i czasu cewnikowania, jakości opieki nad cewnikiem oraz ogólnego stanu zdrowia pacjenta. Częstość ZUM u pacjentów wynosi od 1-5% po pojedynczym krótkim epizodzie cewnikowania, a w przypadku pacjentów z cewnikiem założonym na stałe w otwartym systemie odpływu moczu, ZUM występuje u prawie wszystkich osób po upływie 4 dni. Wykazano, że po 7 dniach utrzymywania cewnika w pęcherzu u około 25% pacjentów występuje bakteriomocz (Tambyah i wsp. 2010, Naber i wsp. 2017). Utrzymywanie cewnika w każdym kolejnym dniu zwiększa ryzyko wystąpienia bakteriomoczu o 5% do 7% (Maki i Tambyah 2001).
W USA w 2012 roku zarejestrowano ponad 7 milionów wizyt lekarskich z powodu infekcji układu moczowego, z czego 100 tysięcy pacjentów wymagało hospitalizacji.
Najczęstszą przyczyną hospitalizacji było odmiedniczkowe zapalenie nerek. W skali globalnej odnotowuje się szacunkowo 150 milionów przypadków ZUM rocznie, a całkowite wydatki
10 związane z leczeniem pacjentów ambulatoryjnych i szpitalnych z zakażeniem dróg moczowych ocenia się na około 1,6 miliarda dolarów rocznie (Raz i wsp. 2000, Grabe i wsp.
2013). Dlatego też tak ważna jest właściwa terapia ZUM, która może przyczynić się do zmniejszenia wskaźnika zachorowań oraz obniżenia kosztów związanych z ich leczeniem (Ostrowska i wsp. 2013, Bury 2015).
2.1.1 Obraz kliniczny i metody identyfikacji ZUM
Do podstawowych czynników wpływających na obraz kliniczny zakażenia dróg moczowych należą lokalizacja zakażenia i wiek chorego. W zależności od lokalizacji ZUM występują charakterystyczne objawy. Zakażenia dolnych dróg moczowych charakteryzują się wystąpieniem objawów dyzurycznych, sporadycznie może wystąpić krwiomocz, szczególnie w przypadku wirusowej etiologii zakażenia lub gruźlicy. W przypadku zakażeń górnej części układu moczowego, czyli odmiedniczkowego zapalenia nerek (tzw. infekcyjne cewkowo- śródmiąższowe zapalenie nerek) występują objawy ogólne, tj. gorączka, dreszcze oraz bolesność okolicy lędźwiowej i dodatni objaw Goldflama (Ballek i wsp. 2010, Dielubanza i wsp. 2011, Ammenti i wsp. 2012). W około 30% przypadków ostrego odmiedniczkowego zapalenia nerek może rozwinąć się bakteriemia prowadząca do posocznicy, a nawet do śmierci pacjenta (Ostrowska i wsp. 2013, Bury 2015, Grabe i wsp. 2015). U małych dzieci objawy mogą w ogóle nie występować lub mają charakter nieswoisty. Nierozpoznanie infekcji układu moczowego u najmłodszych dzieci związane jest z ryzykiem jej uogólnienia (Załęska- Ponganis i wsp. 2016). ZUM u dzieci oraz pacjentów w podeszłym wieku objawiają się gorączką, żółtaczką patologiczną, utratą łaknienia, biegunką, niepokojem oraz zmianami skóry krocza. W przypadku dzieci do 2 roku życia najbardziej istotnym objawem ZUM jest gorączka bez ustalonej przyczyny, trwająca ponad 48 godzin (Shaikh i wsp. 2007). Ostre objawy dyzuryczne, takie jak częstomocz, parcie naglące, ból w okolicy podbrzusza sugerują toczące się zakażenia dróg moczowych (Kupilas i wsp. 2006, Grabe i wsp. 2015).
Rozpoznanie ZUM odbywa się w oparciu o ustalone kryteria, do których należą objawy kliniczne, zwiększona liczba leukocytów w moczu (leukocyturia), stwierdzenie znamiennego bakteriomoczu oraz izolację i identyfikację czynnika etiologicznego. Wniknięcie bakterii do układu moczowego powoduje nadmierne wytwarzanie białych krwinek, które gromadzone są w miejscu zakażenia. Wskaźnikiem potwierdzającym zakażenie dróg moczowych jest badanie ogólne moczu, w którym wzrasta liczba leukocytów. Obecność w polu widzenia większej liczby niż 5 leukocytów w moczu nieodwirowanym lub więcej niż 10 leukocytów w moczu
11 odwirowanym przy powiększeniu 400× wskazuje na stan zapalny układu moczowego. Liczba leukocytów w moczu świadczy o intensywności zakażenia. Więcej niż 20 leukocytów w polu widzenia stwierdza się w przypadku ostrego odmiedniczkowego zapaleniem nerek, któremu towarzyszy znaczny ropomocz (Kallenius i wsp. 1981, Ramakrishnam i wsp. 2005).
Stwierdzenie ropomoczu (łac. pyuria) opiera się także na podstawie dodatnich wyników metody paskowej, pozwalającej na wykrycie esterazy wytwarzanej przez granulocyty obojętnochłonne, ocenie mikroskopowej osadu moczu oraz obecności wałeczków leukocytarnych w osadzie moczu, które są charakterystyczne dla odmiedniczkowego zapalenia nerek. Leukocyturia nie różnicuje bakteriomoczu objawowego od bezobjawowego, co ma ogromne znaczenie w przypadku populacji o wysokim ryzyku występowania bezobjawowego bakteriomoczu i nie może stanowić wskazania do podania antybiotyku (Cai i wsp. 2012). Bakteriuria bezobjawowa wymaga leczenia tylko w określonych przypadkach, np. dotyczy około 4-10% kobiet w ciąży (Kazemier i wsp. 2014, Grabe 2015).
W diagnostyce ZUM wykorzystuje się także właściwości metaboliczne drobnoustrojów, takie jak zdolność redukcji azotanów do azotynów, które świadczą o występowaniu bakterii w moczu. Test na obecność katalazy, którą wytwarzają zarówno bakterie jak i granulocyty obojętnochłonne oraz pomiar poziomu laktoferyny uwalnianej przez leukocyty należą także do badań umożliwiających wykrycie ZUM. Stosowanie testów paskowych wykrywających obecność azotynów w nieodwirowanym moczu jest metodą alternatywną do posiewu moczu, rekomendowaną do badania próbek moczu pochodzących od dorosłych i dzieci powyżej 2
roku życia (Żurowska 2016). Dodatnia reakcja testu paskowego potwierdza obecność w moczu pałeczek jelitowych, które są najczęstszym czynnikiem etiologicznym ZUM.
Wykonanie tych testów jest wystarczające do potwierdzenia ZUM tylko przy występowaniu współistniejących objawów klinicznych (Simerville i wsp. 2005, Dzierżanowska 2008).
Natomiast rozpoznanie ZUM wyłącznie na podstawie objawów klinicznych jest obarczone w praktyce ambulatoryjnej 33% ryzykiem popełnienia błędu (Devillé i wsp. 2004, Schmiemann i wsp. 2010).
Podstawową rolę w diagnostyce laboratoryjnej ZUM spełniają badania ogólne i bakteriologiczne moczu. Istotnym etapem diagnostyki mikrobiologicznej ZUM jest
prawidłowe pobranie i przechowanie próbki moczu przed dostarczeniem go do laboratorium, co pozwala na wiarygodną interpretację uzyskanego wyniku (Rokosz i wsp. 2005, Kennedy i wsp. 2010, Zapała i wsp. 2013). Do 1958 roku w celu uniknięcia zanieczyszczeń florą jelitową skóry krocza i pochwy cewnikowanie pęcherza moczowego było metodą z wyboru w
12 diagnostyce ZUM. Przełomem wprowadzającym pojęcie czystego pobrania moczu ze środkowego strumienia była publikacja Bensona (1958), która zapoczątkowała w diagnostyce mikrobiologicznej u pacjentów z podejrzeniem zakażenia dróg moczowych czyste pobranie materiału i pozwoliła uniknąć ryzyka związanego z cewnikowaniem pęcherza (Hryniewicz i wsp. 2017). Aktualne polskie rekomendacje zalecają wykonanie badania bakteriologicznego moczu metodą czystego pobrania ze środkowego strumienia podczas kontrolowanej lub spontanicznej mikcji, cewnikowania pęcherza moczowego lub nakłucia nadłonowego (Żurowska 2015, Litwin i wsp. 2016). Częstość zanieczyszczeń może sięgać 7-31% próbek (Shrestha i wsp. 2013). W przypadku problemu z aseptycznym pobraniem próbki do badania, materiał można uzyskać z cewnikowania pęcherza moczowego (czułość 95%, swoistość 99%) lub nakłucia nadłonowego, które jest złotym standardem (El-Naggar i wsp. 2010). Pobraną próbkę moczu należy dostarczyć do laboratorium oraz posiać na podłoża stałe jak najszybciej od pobrania, w celu uniknięcia wzrostu liczby bakterii, które były przyczyną zakażenia lub kontaminacji (Stankovic i wsp. 2008). W przypadku konieczności przechowywania, mocz pobrany do jałowego pojemnika należy schłodzić do temperatury 4°C lub poddać procesowi konserwacji (najczęściej stosowany jest kwas borny), co zapobiega namnożeniu bakterii.
Próbki moczu pobrane na podłoża transportowe należy inkubować w cieplarce o temperaturze 35-37°C lub w temperaturze pokojowej do czasu dostarczenia materiału badanego do laboratorium (Wilson i Gaido 2004). Badania interwencyjne College of American Pathologists przeprowadzone w 127 laboratoriach wykazały, że wprowadzenie chłodzenia próbek moczu w ambulatoriach spowodowało istotne zmniejszenie częstości zanieczyszczenia próbek z 16,3% do 8,3%, u pacjentów w wieku 2-50 lat z 19,2% do 8,6%, a u pacjentów powyżej 50 roku życia z 18% do 11,5%, natomiast u kobiet częstość zanieczyszczonych próbek moczu zmniejszyła się z 20,8% do 9,7% (Bekeris i wsp. 2008, Hryniewicz i wsp. 2017).
Przedłużający się transport próbki moczu może prowadzić do rozpadu leukocytów, a tym samym do uzyskania niewiarygodnego wyniku badania analitycznego.
Najlepszą próbką do badania jest mocz uzyskany z porannej mikcji, w którym stwierdza się maksymalną liczbę bakterii, co ma znaczenie gdy pacjent ma częstomocz lub upośledzone zagęszczanie moczu. Posiew ilościowy moczu wykonuje się przy zastosowaniu ezy
kalibrowanej o średnicy 0,45mm. Mocz powinien być posiewany na podłoża stałe, tj. agar Columbia z dodatkiem 5% krwi baraniej, które umożliwia obserwację rodzaju
hemolizy, wzrost uropatogennych pałeczek Gram-ujemnych, ziarniaków Gram-dodatnich i drożdżaków oraz na podłoże wybiórczo-różnicujące dla pałeczek Gram-ujemnych, czyli na
13 podłoże MacConceya, umożliwiające zróżnicowanie bakterii pod względem zdolności fermentacji laktozy oraz hamujące wzrost ziarniaków Gram-dodatnich, a także na podłoże Saburouda zapewniające wzrost grzybów. W badaniach moczu stosuje się także podłoża chromogenne, różnicujące większość patogennych drobnoustrojów na podstawie morfologii kolonii. Badanie mikroskopowe nieodwirowanego moczu, który zabarwia się metodą Grama, pozwala na wykrycie ponad 90% przypadków bakteriomoczu (McCarter i wsp. 2009).
2.1.2 Czynniki wpływające na wystąpienie ZUM
Bakterie mogą przedostać się do układu moczowego drogą wstępującą przez cewkę moczową (zakażenie urogenne), drogą krwionośną (zakażenie hematogenne), drogą limfopochodną, przez przetoki powstałe między drogami moczowymi a pochwą lub macicą, a także przez przetoki moczowodowo-pęcherzowo-jelitowe lub w wyniku naruszenia ciągłości tkanek (Walters i wsp. 2012, Szewczyk 2013, Okrągła i wsp. 2014, Toczyńska- Silkiewicz i wsp. 2016). Po wniknięciu drobnoustrojów do układu moczowego człowieka następuje ich gwałtowne namnożenie. Zdecydowana większość przypadków ZUM objawia się zapaleniem pęcherza moczowego, jednak wniknięcie bakterii do pęcherza nie jest jednoznaczne z rozwojem zakażenia i wywołaniem objawów. Bakteriuria bezobjawowa nie jest leczona w przypadku kobiet zdrowych, nie będących w ciąży (Baraniak 2013, Schneeberger i wsp. 2014). Wszystkie stany patologiczne cewki i pęcherza, wrodzone lub nabyte, anatomiczne albo czynnościowe, które utrudniają odpływ moczu z pęcherza, prowadzą do nawracających lub przewlekłych stanów zapalnych dróg moczowych. Do wad
anatomicznych lub czynnościowych dróg moczowych utrudniających odpływ moczu i predysponujących do ZUM należą przerost gruczołu krokowego, zaburzenia w odpływie
pęcherzowo-moczowodowym, neurogenne zaburzenia czynności pęcherza, niedrożność spowodowana kamicą dróg moczowych. Przy prawidłowo działających mechanizmach zastawkowych zakażenie nie powinno się przenosić z pęcherza do moczowodu oraz do miedniczki nerkowej z następowym uszkodzeniem miąższu nerkowego (Wyszyńska 1991). W ostatnich latach ukazały się publikacje podkreślające rolę zespołów zaburzeń wydalania (DES, ang. dysfunctional elimination syndrome; BBD, ang. bladder and bowel dysfunction) obejmujących zaburzenia mikcji i defekacji w patogenezie ZUM. Zaburzenia te są obserwowane u niemal 40% dzieci powyżej 4 roku życia, u których wystąpiła pierwsza infekcja układu moczowego oraz u 56% dzieci w tej grupie wiekowej, które przebyły co najmniej jedno ZUM (Carpenter i wsp. 2013, Bulum i wsp. 2014, Shaikh i wsp. 2016).
14 Istotnym czynnikiem wpływającym na wystąpienie bakteriurii bezobjawowej jest cukrzyca.
Przeprowadzone badania wskazują, że u kobiet z cukrzycą typu 2, u których stwierdzono bezobjawową bakteriurię, istnieje większe ryzyko rozwoju objawowego ZUM oraz czterokrotnie wyższe ryzyko hospitalizacji (Karunajeewa i wsp. 2005). Ponadto wykazano, że ZUM występuje trzy razy częściej u kobiet chorych na cukrzycę niż u zdrowych (Semetkowska-Jurkiewicz 2007). ZUM stwierdza się najczęściej w okresie niemowlęctwa oraz u osób po 65 roku życia. W przypadku osób starszych infekcje dróg moczowych odnotowuje się u ponad 20% kobiet i ponad 10% mężczyzn. Szacuje się, że około 40-50%
dorosłych kobiet doświadczyła przynajmniej raz w życiu zakażenia dróg moczowych, z czego u większości obserwuje się wielokrotne zakażenia. Częstotliwość ZUM zwiększa się wraz z wiekiem. Wykazano, że bakteriomocz występuje u 10-15% kobiet należących do grupy wiekowej 65-70 lat, a w grupie wiekowej powyżej 80 lat odsetek kobiet, u których może wystąpić bakteriomocz jest wyższy i wynosi 15-20%. Liczba przypadków ZUM wzrasta nawet o 40% w wyniku niedoboru estrogenów u kobiet po okresie menopauzy. Większa zachorowalność na infekcje dróg moczowych osób w podeszłym wieku spowodowana jest współistniejącymi zaburzeniami, np. nieprawidłowym opróżnianiem pęcherza moczowego, upośledzeniem odporności w wyniku choroby podstawowej lub jej leczenia oraz przewlekłymi hospitalizacjami. Przyczyną ZUM są także zaniedbania higieniczne, nabyte niedobory odporności (zakażenie wirusem HIV), niektóre zabiegi diagnostyczne lub lecznicze wykonywane w obrębie dróg moczowych (cewnikowanie, chirurgia urologiczna, przezcewkowa resekcja gruczołu krokowego), stany zapalne w okolicy krocza, pochwy, stulejka z zapaleniem żołędzi, zaparcia oraz przetrzymywanie moczu w pęcherzu (Feld i Matto 2010, Chlabicz i wsp. 2011, Aswani i wsp. 2014, Okrągła i wsp. 2014).
U chorych w ogólnie dobrym stanie, ZUM powstałe w wyniku cewnikowania przebiega zwykle łagodnie, bezobjawowo i ustępuje po usunięciu cewnika moczowego. Wśród głównych czynników etiologicznych infekcji dróg moczowych związanych ze stosowaniem cewników urologicznych (CAUTI, ang. Catheter-Associated urinary Tract Infection) należy wymienić E. coli, Staphylococcus epidermidis i Enterococcus faecalis (Giedrys-Kalemba i Jursa 2007, Beveridge i wsp. 2011, Grabe i wsp. 2015). Utrzymywanie cewnika w drogach moczowych stwarza idealne warunki do tworzenia biofilmu, zwiększając ryzyko zakażenia dróg moczowych. Badania składu biofilmu powstałego na powierzchni cewnika moczowego wskazują na występowanie bakterii z rodzaju Edwardsiella, Corynebacterium, Achromobacter, Citrobacter, Stenotrophomonas czy Burkholderia (Ostrowska 2013).
15 Utrzymujące się dłużej zakażenia mogą doprowadzić do powikłań w postaci zapalenia
prostaty, najądrzy, pęcherza moczowego lub odmiedniczkowego zapalenia nerek.
U pacjentów wysokiego ryzyka zakażenie dróg moczowych związane z cewnikowaniem może doprowadzić do bakteriemii lub sepsy. Taka postać zakażenia jest obarczona wysoką śmiertelnością. W 15% przypadków objawy związane z cewnikowaniem mają charakter mieszany, a w kolejnych zakażeniach występuje zróżnicowana flora bakteryjna. Często zakażenie ustępuje po usunięciu cewnika moczowego u pacjentów w ogólnie dobrym stanie, u których stwierdzono bakteriurię bezobjawową. U nielicznych chorych przewlekle cewnikowanych, zwłaszcza poddanych długotrwałej antybiotykoterapii rozwijają się kandydozy (Dzierżanowska 2008). Istotnym czynnikiem wpływającym na wystąpienie zakażenia odcewnikowego jest rodzaj biomateriału z jakiego wykonany został cewnik oraz czas pozostawania cewnika w drogach moczowych. Zakażenia odcewnikowe są częstsze u kobiet oraz u osób z obniżoną odpornością i niewydolnością nerek prowadzącą do zastoju moczu oraz wzrostu poziomu kreatyniny (Bartoszewicz i wsp. 2008).
2.1.3 Mechanizmy obronne układu moczowego
Cewka moczowa i pęcherz moczowy stanowią wrota wnikania drobnoustrojów patogennych do organizmu. W prawidłowych warunkach układ moczowy broni się przed wtargnięciem i szerzeniem zakażenia. Najważniejszym mechanizmem pozwalającym utrzymać stan fizjologiczny dróg moczowych jest sprawne opróżnianie pęcherza moczowego
mające na celu wydalanie metabolitów w sposób uniemożliwiający zaleganie moczu w poszczególnych odcinkach układu moczowego. Duże znaczenie w utrzymaniu jałowości
układu moczowego ma właściwy przepływ moczu z nerki do pęcherza moczowego oraz uniemożliwiony zwrotny przepływ z pęcherza do moczowodów. W przypadku dolnych dróg moczowych za utrzymanie jałowości dróg moczowych odpowiadają regularne mechaniczne spłukiwanie nabłonka podczas mikcji, fagocytarna aktywność leukocytów, kwaśny odczyn moczu, wysokie stężenie mocznika w moczu, złuszczanie się komórek nabłonka przejściowego (urothelium), bariera mechaniczna w postaci zwieracza cewki moczowej, budowa nabłonka dolnych dróg moczowych i substancje przez niego wydzielane oraz obecność mikroflory komensalnej w okolicy ujścia cewki moczowej, zapobiegające kolonizacji przez patogenne bakterie (Hryniewicz i wsp. 2001, Carlsson i wsp. 2001). W skład fizjologicznej flory bakteryjnej ujścia cewki moczowej u kobietw 75% wchodzą pałeczki mlekowe (Lactobacillus), gronkowce koagulazo-ujemne, paciorkowce i bakterie beztlenowe.
16 U mężczyzn funkcję tę spełnia wydzielina gruczołu krokowego, zawierająca sterczowy czynnik antybakteryjny, którego głównym składnikiem jest cynk (Kelleher i wsp. 2011).
Pęcherz moczowy może być krótkotrwale kolonizowany przez bakterie migrujące w górę kanału moczowego, które następnie są wypłukiwane wraz z komórkami nabłonka moczowego przez strumień moczu. Budowa komórki bakteryjnej oraz wykształcenie wielu mechanizmów adaptacyjnych i obronnych pozwalają drobnoustrojom na kolonizację układu moczowego, która w wielu przypadkach jest bezobjawowa (Johnson 1991, Okrągła i wsp. 2014). Bakterie uropatogenne wywołujące zakażenie mają skłonność do kolonizacji i inwazji komórek nabłonka i głębszych tkanek układu moczowego. Zjadliwość bakterii, jak też osłabienie mechanizmów obronnych dróg moczowych chorego sprzyjają rozwojowi ZUM (Semetkowska-Jurkiewicz 2007). U kobiet głównymi mechanizmami obronnymi okolicy zewnętrznego ujścia cewki moczowej jest wydzielina pochwowa o odczynie kwaśnym, stwarzająca niekorzystne warunki do kolonizacji pałeczkami Gram-ujemnymi. Jednak doniesienia wielu autorów wskazują, że szczepy E. coli są niewrażliwe na obniżenie pH środowiska (Lewczyk i Jankowski 2003, Kanjee i Houry 2013). Dodatkowo bardzo ważną funkcję ochronną pełni uroepithelium, stanowiące mechaniczną barierę utrudniającą przechodzenie patogenów, toksyn i jonów do głębszych warstw komórek (Apodaca 2004).
W ostatnich latach wzrosło zainteresowanie układem odpornościowym pęcherza moczowego, przy czym badania głównie prowadzone były z użyciem szczepów E. coli (Dybowski 2007). W układzie moczowym wykształcił się swoisty mechanizm pełniący rolę
„pierwszej linii obrony” przed zakażeniem, który tworzy bogato rozwinięta tkanka limfatyczna (Poggi i wsp. 1995). Komórkami efektorowymi układu immunologicznego są neutrocyty, monocyty, komórki NK i limfocyty. Działanie ich opiera się na zdolności do fagocytozy, wydzielaniu cytokin i mediatorów reakcji zapalnej (Uehling i wsp. 1999). Błona śluzowa układu moczowego wytwarza wiele czynników chroniących układ moczowy przed zakażeniem, do których należą wydzielane w drogach moczowych mukopolisacharydy, laktoferyna, lipokalina, neutrofile, cytokiny, globuliny odpornościowe klasy IgA i IgG, peptydy przeciwdrobnoustrojowe oraz wytwarzane w dystalnej części nefronu i wydalane z moczem białko Tamma-Horsfalla. Główną rolą białka Tamma-Horsfalla jest hamowanie adhezji komórek bakteryjnych do komórek nabłonka dróg moczowych przez łączenie się z białkiem FimH fimbrii typu 1. Białko Tamma-Horsfalla aktywuje również układ dopełniacza (Pak i wsp. 2001, Semetkowska-Jurkiewicz 2007, Chromek i Brauner 2008, Świrska i wsp. 2011). Mukopolisacharydy pokrywające błonę śluzową pęcherza moczowego
17 zapobiegają adhezji bakterii, a zniszczenie tej warstwy powoduje zwiększenie liczby bakterii w pęcherzu moczowym (Rejnhart i Sobel 1992, Agarwal i wsp. 2012). Glikoproteiny lipokalina i laktoferyna wytwarzana przez komórki wyściełające kanaliki dystalne rdzenia nerki wykazują również właściwości przeciwbakteryjne. Mechanizm ich działania polega na utrudnieniu bakteriom dostępu do żelaza, a tym samym przeciwdziałaniu namnażaniu się patogenów (Weichhart i wsp. 2008, Garcia-Montoya i wsp. 2012). Istotną rolę w utrzymaniu sterylności dróg moczowych spełniają peptydy przeciwbakteryjne występujące w ludzkim moczu, wytwarzane przez krwinki białe i komórki nabłonkowe. Peptydy te powodują uszkodzenie struktury lub upośledzenie funkcji metabolicznych mikroorganizmu (Radek i Gallo 2007, Zasloff 2007). Bogate unaczynienie błon śluzowych pęcherza moczowego pozwala na szybką mobilizację limfocytów w czasie lokalnej odpowiedzi na zakażenie.
W procesach zapalnych wzrasta migracja limfocytów i leukocytów do układu moczowego, w którym toczy się proces zapalny (Pastuszko i wsp. 2007). U obu płci cewka i pęcherz moczowy są pokryte błoną śluzową produkującą wydzielinę zawierającą IgG oraz sekrecyjne przeciwciała klasy IgA, które zapobiegają kolonizacji układu moczowego. Podczas infekcji wzrasta liczba komórek wydzielających immunoglobuliny IgA. Niski poziom tych przeciwciał może powodować nawracające ZUM, jednak ich rola w układzie moczowym nie została ostatecznie potwierdzona (Rejnhart i wsp. 1992, Schoor i wsp. 2001). Złuszczanie się komórek nabłonka wyściełającego drogi moczowe należy do wrodzonych mechanizmów odpornościowych, powodujących mechaniczne usuwanie bakterii z pęcherza moczowego.
ZUM pojawia się gdy zdolności chorobotwórcze bakterii są większe niż mechanizmy obronne człowieka.
2.1.4 Klasyfikacja ZUM
Autorzy stosują różne klasyfikacje ZUM, jednak przeważa kryterium praktyczne, w którym zwraca się uwagę przede wszystkim na lokalizację i przebieg zakażenia, na podstawie którego wyróżnia się zakażenia powikłane, niepowikłane, nawracające, objawowe i bezobjawowe (Grabe i wsp. 2015, Białek 2016). Biorąc pod uwagę lokalizację ZUM wyróżnia się infekcje obejmujące górne (nerki, moczowody) i dolne (pęcherz moczowy, cewka moczowa) odcinki układu moczowego. Granicę między nimi wyznaczają ujścia moczowodów do pęcherza moczowego (Chlabicz i wsp. 2011, Szewczyk 2013, Grabe i wsp.
2015).
18 Kliniczny podział ZUM wg EAU Guideline,s (2016)(EAU, ang. European Association of Urology) obejmuje:
- niepowikłane zapalenie pęcherza, - niepowikłane odmiedniczkowe zapalenie nerek, - powikłane zakażenie dolnych dróg moczowych z towarzyszącym odmiedniczkowym zapaleniem nerek, - posocznica moczowa (urosepsa), - zapalenie cewki moczowej, - postacie specjalne: zapalenie stercza, najądrza, jądra (Kupilas 2010, Burkhard i wsp.
2016, Smelov i wsp. 2016).
Niepowikłane ZUM występują u pacjentów z prawidłowym pod względem anatomicznym i czynnościowym układem moczowym oraz sprawnymi mechanizmami obronnymi. Natomiast powikłane ZUM wywołane często przez nietypowe drobnoustroje, dotyczy osób z nieprawidłową budową i zaburzeniami w funkcjonowaniu układu moczowego, a także pacjentów z upośledzonym układem immunologicznym (Shaikh i wsp. 2008, Thomas i Hooton 2012, Grabe i wsp. 2015). Za nawracające ZUM uważa się występowanie objawów przynajmniej 3 razy w ciągu roku lub 2 razy w ciągu ostatnich 6 miesięcy od ostatniego leczenia z użyciem leków przeciwdrobnoustrojowych, a czynnikiem etiologicznym jest drobnoustrój, który przeżył w drogach moczowych i był przyczyną poprzedniego ZUM.
W praktyce za nawrót ZUM przyjmuje się objawy pojawiające się do dwóch tygodni od zakończenia terapii. Reinfekcja to infekcja, która wystąpiła do 21 dni po wyjałowieniu moczu i ustąpieniu objawów zakażenia wywołana nowym czynnikiem etiologicznym pochodzącym spoza układu moczowego (Foxman 2003, Mastalerz-Migas i wsp. 2010). Bakteriuria bezobjawowa powinna być traktowana, jako szczególna jednostka, ponieważ może mieć swoje źródło zarówno w obrębie dolnych, jak i górnych dróg moczowych. W bakteriurii bezobjawowej stwierdza się obecność bakterii w moczu (bakteriuria znamienna), przy czym brak jest leukocyturii oraz klinicznych objawów zakażenia (Grabe i wsp. 2015, Nicole 2016).
Występowanie bakteriurii bezobjawowej szacowane jest na około 3,5% populacji i wzrasta wraz z wiekiem; częściej dotyczy kobiet oraz mężczyzn powyżej 70 roku życia z zapaleniem gruczołu krokowego (Foxman 2003, Karunajeewa i wsp. 2005).
19 2.2. E. coli jako główny czynnik etiologiczny ZUM
Najczęstszą grupą bakterii wywołującą ZUM są pałeczki Gram-ujemne należące do rodziny Enterobacteriaceae. W zależności od miejsca bytowania, wytwarzanych czynników zjadliwości i stanu zdrowia gospodarza mogą one być groźnymi patogenami wywołującymi choroby, w tym również ZUM. Pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae odpowiadają za ponad 90% przypadków ZUM u pacjentów ambulatoryjnych oraz za około 50% przypadków ZUM u pacjentów hospitalizowanych. Wśród tych zakażeń 70-95% powodowanych jest przez pałeczki E. coli (Watts i wsp. 2012, Kamble i wsp. 2013). Pozostałe pałeczki Gram-ujemne z rodziny Enterobacteriaceae należące do rodzaju Klebsiella, Proteus lub Enterobacter oraz pałeczki niefermentujące z rodzajów Pseudomonas i Acinetobacter znacznie rzadziej odpowiadają za ZUM. W nielicznych przypadkach czynnikiem etiologicznym zakażenia mogą być ziarniaki Gram-dodatnie, takie jak gronkowce, paciorkowce i rodzaj Enterococcus.
Sporadycznie przyczyną infekcji dróg moczowych są grzyby, wirusy lub pierwotniaki(Ronald 2003, Baka-Ostrowska 2006, Chlabicz i wsp. 2011, Okrągła i wsp. 2014, Toczyńska- Silkiewicz i wsp. 2016).
Rodzaj czynnika etiologicznego ZUM często związany jest z wiekiem pacjenta i specyfiką oddziału szpitalnego. Infekcje dróg moczowych rozwijające się na początku
hospitalizacji, tzn. do 72 godzin pobytu w szpitalu, spowodowane są zazwyczaj przez wrażliwe na antybiotyki drobnoustroje, kolonizujące okolice cewki moczowej i odbytu pacjenta. Przy przedłużonym pobycie w szpitalu trwającym ponad 72 godziny, endogenna mikroflora pacjenta zostaje zastąpiona mikroflorą pochodzącą ze środowiska szpitalnego, wykazującą lekooporność. W przypadku ZUM w środowisku szpitalnym wzrasta częstość izolacji pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae innych niż pałeczka E. coli oraz pałeczek Pseudomonas spp. W oddziałach zachowawczych profil izolowanych drobnoustrojów z ZUM bardziej przypomina pozaszpitalny, tzn. pałeczki E. coli odpowiadają za 75-90% zakażeń, natomiast na oddziałach urologii i chirurgii oraz intensywnej terapii wzrasta częstość izolacji Pseudomonas spp. i Enterococcus spp. Obecność cewnika założonego na stałe do pęcherza moczowego w początkowym okresie sprzyja zakażeniom wywoływanym głównie przez E. coli, Staphylococcus epidermidis i E. faecalis. W późniejszym okresie ZUM wywołują drobnoustroje Gram-ujemne, takie jak Proteus spp., Enterobacter spp., Serratia marcescens, Providencia stuartii, Pseudomonas spp. oraz bakterie Gram-dodatnie (Barisić i wsp.
20 2003,Dzierżanowska 2008, Kraśnicki i wsp. 2010, Beveridge i wsp. 2011). W Polsce oraz w innych krajach z przypadków ZUM u dzieci najczęściej izolowane są pałeczki E. coli (75-91%), natomiast rzadziej inne grupy drobnoustrojów, tj. Enterococcus spp. (13%), Enterobacter spp. (ok. 10%), Pseudomonas spp. (ok. 10%) (Kupilas 2010, Walters i wsp.
2012, Kamble 2013, Ostrowska i wsp. 2013).
W ostatnich latach stwierdzono, że grupa drobnoustrojów odpowiedzialnych za zakażenia dróg moczowych uległa znacznemu zróżnicowaniu, niemniej jednak pałeczki E. coli nadal odpowiadają za najwyższy odsetek przypadków ZUM. Zmiany te spowodowane są głównie zwiększeniem liczby pacjentów z grup ryzyka, zwiększeniem inwazyjności procedur diagnostyczno-leczniczych oraz rozprzestrzenianiem się drobnoustrojów wielolekoopornych, u których oporność na antybiotyki często uwarunkowana jest nabytymi mechanizmami oporności (Wolski 2017, Alanazi i wsp. 2018).
2.3. Charakterystyka i grupy chorobotwórczych pałeczek E. coli
Po raz pierwszy pałeczki E. coli zostały opisane w 1885 roku przez austriacko- niemieckiego pediatrę oraz bakteriologa Theodora Eschericha, który wyizolował je z kału niemowlęcia i nazwał Bacterium coli commune - bakteria jelitowa powszechna (Naylor i wsp.
2005, Minodier 2015). W 1919 roku bakterie te nazwano Escherichia coli od nazwiska odkrywcy i sklasyfikowano zgodnie z systematyką Bergeya. Komórki E. coli mają postać krótkich, prostych pałeczek o wymiarach 1,1-1,5 ҳ 2,0-6,0 µm, barwiących się Gram-ujemnie.
Wytwarzają rzęski rozmieszczone na całej powierzchni komórki oraz różne typy fimbrii(Satora 2007, Simon i wsp. 2012).
Pałeczki E. coli to gatunek zróżnicowany, obejmujący szczepy komensalne oraz szczepy patogenne dla przewodu pokarmowego, a także szczepy odpowiedzialne za inne zakażenia układowe i infekcje uogólnione.Pałeczki E. coli są względnymi beztlenowcami, rosną zarówno w warunkach tlenowych jak i beztlenowych. W warunkach beztlenowych mogą wykorzystywać azotany lub fumaran jako ostateczne akceptory elektronów. Jedną z najważniejszych cech biochemicznych tych pałeczek jest zdolność fermentowania laktozy, glukozy i maltozy z wytworzeniem produktów kwaśnych i gazowych. Fermentują one również galaktozę, arabinozę i fruktozę (Minodier 2015, Pappelbaum i wsp. 2015). Cechy te zostały wykorzystane do identyfikacji E. coli z użyciem podłóż wybiórczych i wybiórczo- różnicujących. E. coli jest pałeczką katalazo-dodatnią, nie wytwarzającą oksydazy cytochromowej, rozkładającą tryptofan do indolu. Tiosiarczan sodu i sole kwasów
21 żółciowychhamują wzrost tych drobnoustrojów. Pałeczki E. coli nie wytwarzają przetrwalników, są wrażliwe na działanie środków dezynfekcyjnych oraz wysokich temperatur.Należą do bakterii mezofilnych, chociaż mogą rosnąć w szerokim zakresie temperatur od 7-45°C. W pożywkach płynnych powodują jednolite zmętnienie, a na podłożach stałych tworzą kolonie śluzowe, tolerują środowisko o pH od 4,7 do 9,5.
Stwierdzono, że pałeczki E. coli giną w temperaturze 60-70°C w ciągu 20 minut, natomiast w temperaturze ok. 0°C przeżywają w wodzie nawet do kilku miesięcy, a w kale nawet do roku (Satora 2007, Simon i wsp. 2012, Janezic i wsp. 2013).
Wpływ E. coli na organizm ludzki znany jest od 1866 roku, kiedy Theodor Escherich powiązał infekcje układu moczowego z patogennym działaniem tych bakterii. Pałeczki E. coli mogą być przyczyną infekcji, gdy przedostaną się z przewodu pokarmowego do innych tkanek, zwłaszcza do dróg moczowych i żółciowych, płuc, otrzewnej, czy opon mózgowych.
Przypadki bakteriemii i/lub sepsy spowodowane przez pałeczki E. coli są wynikiem translokacji tych pałeczek z układu moczowo-płciowego lub pokarmowego do krwiobiegu(Rokosz i wsp. 2005). Pałeczki E. coli w obecności czynników sprzyjających mogą być przyczyną zakażeń pozajelitowych, np. w obecności ciała obcego (cewnik moczowy), w przypadku nieprawidłowości organicznych gospodarza (wady anatomiczne lub funkcjonale), upośledzenia odporności, czy infekcji wywołanych kilkoma gatunkami drobnoustrojów.
Zróżnicowana budowa antygenu somatycznego O (ok. 171 odmian), antygenu rzęskowego H (ok. 60 odmian) i otoczkowego K (80 odmian) pozwala na wewnątrzgatunkowe różnicowanie pałeczek E. coli. Przynależnośćdo serotypu wskazuje na potencjalną zjadliwość pałeczek E. coli(Szot i wsp. 2011).Szczepy E. coli mające antygen K1 są odpowiedzialne za 75-80% przypadków zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych (ZOMR) u noworodków, w tym przypadki śmiertelne stanowią 15-20%. Szczepy te odpowiedzialne są również za bakteriemię i sepsę oraz zakażenia dróg moczowych. W przypadku zakażenia pałeczkami E. coli wytwarzającymi antygen K1 nie obserwuje się odpowiedzi immunologicznej w postaci wytworzonych przeciwciał, co wiąże się ze
zjawiskiem określanym jako cząsteczkowa mimikra drobnoustrojów. Kwas α-2,8 N-acetyloneuraminowy (NeuNAc) jest podstawową jednostką budującą polisacharyd
otoczkowy K1, ale występuje on nie tylko na powierzchni komórek bakteryjnych wykazujących powinowactwo do układu nerwowego, ale także w cząsteczkach N-CAM (ang.
neural cel adhesion molecule) obecnych w organizmie noworodka, odgrywających istotną
22 rolę w powstawaniu tkanki nerwowej. W związku z tym antygen K1 nie jest rozpoznawany
przez układ immunologiczny człowieka jako czynnik obcy i nie dochodzi, zwłaszcza u noworodków i małych dzieci, do wytworzenia przeciwciał obronnych. U prawie 70%
noworodków urodzonych przez kobiety będące nosicielkami E. coli należących do typu otoczkowego K1 można wykryć obecność tych bakterii już w ciągu pierwszych 48 godzin życia (Cisowska 2003, Kaczmarek i wsp. 2010).
Wśród patogennych szczepów E. coli wyróżnia się szczepy biegunkowe oraz szczepy odpowiedzialne za zakażenia pozajelitowe (ExPEC, ang. Extraintestinal Pathogenic E. coli).
W zależności od typu infekcji jaką wywołują pałeczki E. coli należy wymienić następujące grupy szczepów: enterotoksynogenne E. coli (ETEC), enteropatogenne E. coli (EPEC), enterokrwotoczne E. coli (EHEC), enteroinwazyjne E. coli (EIEC), entroagregacyjne E. coli (EAggEC), uropatogenne E. coli (UPEC), a także szczepy odpowiedzialne za zapalenie otrzewnej lub związane z zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych (MNEC) (Kaper 2005, Marrs i wsp. 2005, Sobieszczańska 2007, Witkowska i wsp. 2009, Zalas-Więcek i wsp. 2010).
2.3.1. Enterotoksynogenne szczepy E. coli (ETEC)
Enterotoksynogenne szczepy E. coli stanowią jeden z najczęstszych czynników etiologicznych biegunek u ludzi i zwierząt w krajach Ameryki Łacińskiej, Afryki i Azji.
Biegunki wywoływane przez tę grupę pałeczek E. coli występują głównie u dzieci do 5 roku życia oraz u zwierząt hodowlanych. ETEC stanowią jedną z przyczyn tzw. biegunek podróżnych u turystów przybywających do rejonów endemicznego występowania tej grupy szczepów (WHO 2006). Do zakażenia tymi szczepami dochodzi po spożyciu skażonej żywności lub wody. Dawka infekcyjna wywołująca objawy chorobowe wynosi 106-1010 CFU/ml.Warunkiem zakażenia ETEC jestkolonizacja początkowego odcinka jelita cienkiego.
Adhezja do komórek nabłonka jelitowego jest możliwa dzięki obecności fimbrii, głównie CFA (ang. colonisation factor antigens) (Fleckenstein i wsp. 2010). Szczepy enterotoksynogenne E. coli różnią się rodzajem wytwarzanych adhezyn, które wiążą się z określonymi receptorami na powierzchni enterocytów. Objawy choroby w postaci wodnistej, nagle pojawiającej się biegunki, skurczy mięśni brzucha oraz nieznacznie podwyższonej temperatury występują najczęściej po 14-50 godzinach od zakażenia i są związane z działaniem enterotoksyn. Dodatkowymi objawami są wymioty oraz podwyższona temperatura. Objawy choroby ustępują samoistnie po 3-5 dniach (Qadri i wsp. 2005, Croxen i wsp. 2013, Blady-Chudzik i wsp. 2015). Właściwości chorobotwórcze ETEC związane są
23 z wytwarzaniem enterotoksyn ciepłowrażliwych LT-I (toksyna A-5B) i LT-II oraz
ciepłostałych ST-I (STa) i ST-II (STb). Enterotoksyna LT-I wykazuje 80% homologii z toksyną V. cholerae. Szczepy E. coli chorobotwórcze dla ludzi i zwierząt wytwarzają
enterotoksynę STa, natomiast enterotoksynę STb wytwarzają szczepy chorobotwórcze dla zwierząt (Jagielski 2010, Isidean i wsp. 2011, Croxen i wsp. 2013).
2.3.2. Enteroinwazyjne szczepy E. coli (EIEC)
Szczepy EIEC stanowią jednolitą pod względem właściwości fenotypowych grupę i są
czynnikiem etiologicznym biegunek czerwonkopodobnych o łagodnym przebiegu.
W większości są to szczepy nieruchliwe, niedekarboksylujące lizyny i niefermentujące laktozy. Chorobotwórczość tych bakterii jest związana z wytwarzaniem wielu czynników zjadliwości, kodowanych przez geny umiejscowione na dużym plazmidzie inwazyjności pINV o wielkości 220 kpz oraz przez geny chromosomalne. Umożliwiają one szczepom enteroinwazyjnym E. coli wnikanie do wnętrzakomórek nabłonka okrężnicy i namnażanie, a następnie przemieszczanie się do sąsiednich komórek, co powoduje ich destrukcję i pojawienie się krwi w kale (Yang i Wang 2014). Za inwazyjność szczepów odpowiadają
białka kodowane przez plazmidowe geny ipaA, ipaB, ipaC, ipaD i ipaH, natomiast zdolność
do przemieszczania się pałeczek w cytoplazmie komórek gospodarza jest związana z wydzielaniem białka kodowanego przez gen virA. Szczepy enteroinwazyjne E. coli nie
wytwarzają toksyn (Van den Beld i wsp. 2012).
2.3.3 Enteropatogenne szczepy E. coli (EPEC)
Szczepy EPEC są odpowiedzialne za biegunki u niemowląt, małych dzieci i u osób z obniżoną opornością. Wykazano, że chorobotwórcze właściwości enteropatogennych szczepów E. coli determinowane są przez geny umiejscowione na plazmidzie EAF, które kodują fimbrie typu IV(bfp). Umożliwiają one zlokalizowaną adhezję (LA, ang. localized adherence) i formowanie mikrokolonii na powierzchni komórek błony śluzowej jelita cienkiego. Zdolność do ścisłego przylegania i wywoływania destrukcyjnych zmian na powierzchni i polimeryzację aktyny wewnątrz enterocytów, warunkowana jest aktywnością aparatu sekrecyjnego typu III, który umożliwia wydzielanie i umieszczanie własnych białek sekrecyjnych w komórkach gospodarza. Geny kodujące aparat sekrecyjny typu III oraz białko intyminę są zlokalizowane w chromosomie w obrębie wyspy patogenności LEE (ang. Locus Enterocyte Effacing). W obrębie tej wyspy wyróżnia się trzy regiony, tj. region zawierający
24 geny kodujące aparat sekrecji typu III (geny esc i sep), region kodujący białko intyminę (gen eae)oraz receptor Tir(ang. Translocated intimin receptor) dla intyminy (gen tir), a także region obejmujący geny espA, espB, espD kodujące białka umożliwiające translokację sygnału do wnętrza komórki gospodarza. BiałkoTir jest wbudowywane w błonę komórki enterocytu, do którego wiąże się intymina, w wyniku czego dochodzi do utworzenia ścisłego kontaktu bakteria-enterocyt (Elliott i wsp. 2002, Ochoa i wsp. 2011). Intimina i białka sekrecyjne Esp (EPEC secreted proteins), tj. EspA o masie 25 kDa, EspB o masie 38 kDa i EspD o masie 40 kDa są niezbędne dla fenotypowego wyrażania zmian polegających na zaniku mikrokosmków w miejscu przylegania i zmian cytoszkieletu komórki eukariotycznej.
Podstawowym objawem zakażenia jest wodnista biegunka występująca w następstwie zniszczenia mikrokosmków jelitowych oraz cytoszkieletu komórek jelita cienkiego (Hicks i wsp. 1998, Sobieszczańska i wsp. 2001, Ochoa i wsp. 2008, Pawłowska i wsp. 2016).
2.3.4 Enterokrwotoczne/werotoksyczne szczepy E. coli (EHEC/VTEC)
Szczepy EHEC/VTEC są przenoszoneprzez żywność, wodę oraz w wyniku bezpośredniego kontaktu z osobą chorą, natomiast źródłem zakażenia jest najczęściej surowa lub niedogotowana wołowina, niepasteryzowane mleko i jego przetwory, surowe warzywa, owoce i woda skażone odchodami zwierząt (Kaper i wsp. 1998, Gyles 2007, Januszkiewicz i wsp. 2010, Hauser i wsp. 2013). Szczepy należące do tej grupy mogą wytwarzać ciepłostałą cytolizynę VT1 (ang. vero toxin), zbudowaną z dwóch podjednostek,którapodobna jest do toksyny Shiga (100% homologii sekwencji aminokwasowej) oraz werotoksynę VT2 wykazującą podobieństwo sekwencji aminokwasów tylko w 55% w stosunku do toksyny Shiga. Geny kodujące VT1 (stx1) i VT2 (stx2) zlokalizowane są w obrębie genomu bakteriofaga zintegrowanego z chromosomem bakterii. Komórki bakteryjne szczepów EHEC mogą wytwarzać tylko toksynę Stx1 lub Stx2, obie toksyny lub różne warianty toksyny Stx2.
Podjednostka A (35 kDa) ciepłostałej cytolizyny odpowiedzialna jest za hamowanie biosyntezy białka w komórkach docelowych, natomiast podjednostka B (7,7 kDa) odpowiada za wiązanie toksyny z receptorem. Wykazano, że 90% szczepów werotoksycznych wyizolowanych od człowieka wytwarza kodowaną plazmidowo enterohemolizynę (EhxA) lizującą erytrocyty ludzkie i leukocyty. Szczepy EHEC/VTEC mogą również posiadać czynniki zjadliwości, takie jak intyminę kodowaną przez gen eae oraz inne białka odpowiedzialne za uszkadzanie komórek nabłonka jelitowego podczas zakażenia.
Czynnikiem zjadliwości pałeczek E. coli O157 jest również LPS, wzmagający
25 cytotoksyczność werotoksyn wobec ludzkich komórek śródbłonka naczyń in vitro oraz ciepłostała toksyna EAST1. Szczepy EHEC/VTECstanowią czynnik etiologiczny krwotocznego zapalenia jelita grubego, któremu mogą towarzyszyć powikłania (Watanabe i wsp. 1996, Kaper i wsp. 1998, Fraser i wsp. 2004). U 10-15% chorych, głównie u dzieci poniżej 10 roku życia i u osób starszych, może wystąpić zespół hemolityczno-mocznicowy (HUS, ang. haemolytic-uraemic syndrome), w przypadku którego u 50% chorych występuje trwałe uszkodzenie nerek, u 20-30% stwierdzono encefalopatię, natomiast śmiertelność sięga 5-10% (Goldwater i Bettelheim 2012, Półtorak i wsp. 2016).
2.3.5. Enteroagregacyjne (enteroadherentne) E. coli (EAEC)
Szczepy EAEC są uważane za przyczynę ostrych biegunek u dorosłych zakażonych wirusem HIV, dzieci i dorosłych podróżujących z krajów uprzemysłowionych do mniej rozwiniętych gospodarczo części świata (Cennimo i wsp. 2007). Charakterystyczny sposób adhezji do komórek nabłonka jelit w postaci agregatów jest cechą swoistą EAEC, odróżniającą je od innych patogennych szczepów E. coli. Wykazano, że enteroagregacyjne szczepy E. coli są drugą co do częstości występowania po ETEC przyczyną biegunek u dzieci do 5 roku życia oraz podróżnych przebywających na terenie Ameryki Łacińskiej, Afryki i Azji. EAEC stanowią grupę heterogenną pod względem cech chorobotwórczości, gdyż należą do niej zarówno szczepy chorobotwórcze, jak i niechorobotwórcze dla człowieka.
Szczepy te często nabywają drogą horyzontalnego transferu genów czynniki wirulencji od innych patogenów przewodu pokarmowego (Duda i Sobieszczańska 2012). Wytwarzają toksynę EAST podobną do ST oraz toksynę hemolizynopodobną. Patomechanizm zakażenia wywołanego przez EAEC obejmuje adhezję do komórek nabłonka jelita za pośrednictwem swoistych dla tej grupy E. coli fimbrii agregacyjnych, stymulację błony śluzowej jelita do sekrecji śluzu, wydzielanie endotoksyn i/lub cytotoksyn modulujących aktywność sekrecyjną enterocytów lub powodującą ich uszkodzenia. Wodnista biegunka jest wynikiem zaburzeń wodno-elektrolitowych powstających wskutek nadmiernej aktywacji cyklazy guanylowej.
Adherencja EAEC do komórek jest uwarunkowana obecnością w komórkach bakteryjnych mannozoopornych fimbrii określanych jako EAF/I i AAF/II, które są kodowane przez geny plamidowe. Ważnym czynnikiem wirulencji niektórych szczepów należących do tej grupy jest proteaza serynowa Pic o aktywności mucynazy, która indukuje sekrecję śluzu przez komórki kubkowe błony śluzowej jelita, co odpowiada za śluzowy charakter biegunek oraz degraduje mucynę zawartą w śluzie, ułatwiając enteroagregacyjnym pałeczkom E. coli osiąganie
26 powierzchni nabłonka i przewlekłą kolonizację jelit (Kahali i wsp. 2004, Jagielski 2010, Duda i Sobieszczańska 2012, Croxen i wsp. 2013, Yang i Vang 2014).
2.3.6 Szczepy E. coli przylegające dyfuzyjnie (DAEC)
Dyfuzyjnie przylegające pałeczki E. coli charakteryzuje rozsiany sposób przylegania do linii komórkowych HEp-2 i HeLa (Scaletsky i wsp. 2002). Typowe dyfuzyjnie przylegające pałeczki E. coli wytwarzają adhezyny określane mianem adhezyn Afa/Dr, do których należą AfaE-I, AfaE-II, AfaE-III, AfaE-V, Dr, Dr-II. Rozpoznają one czynnik DAF (ang. decay accelerating factor), który jako składnik antygenu grupowego krwinek Dr związany jest z regulacją kaskady dopełniacza. Wykazano u nich także obecność adhezyn F1845 i NFA-I.
Wśród typowych dyfuzyjnie przylegających E. coli dominują uropatogenne szczepy, odpowiedzialne za wywołanie zapalenia pęcherza moczowego, odmiedniczkowe zapalenie nerek i bezobjawową bakteriurię. Natomiast wśród atypowych EAEC wyróżniono dwie podklasy szczepów. Pierwsza charakteryzuje się wytwarzaniem adhezyn AfaE-VII, AfaE- VIII, AAF-I, AAF-II, AAF-III, które nie wiążą się z czynnikiem DAF. Do drugiej podklasy zaliczane są szczepy posiadające adhezyny Afa/Dr (Afa/Dr DAEC) lub inne, np. związane z ZUM. Wśród szczepów wytwarzających Afa/Dr DAEC stwierdza się duże rozpowszechnienie genów warunkujących systemy transportu jonów żelaza, w tym geny yersiniabaktyny (irp), aerobaktyny (aer, iuc), salmocheliny (iro), systemu transportu hemu (shu) i systemu transportu molibdenu (modD). W grupie tej dominują szczepy biegunkotwórcze. Po przeprowadzeniu badań genomu tych szczepów wykazano, że posiadają one fragment DNA homologiczny do kodującego intyminę EPEC oraz wydzielają białka homologiczne do EspA, EspB i EspD, warunkujące powstawanie uszkodzeń A/E podobnych do wywołanych przez EPEC (Bouguénec i wsp. 2006, Croxen i wsp.2013, Baldy-Chudzik i wsp. 2015).
2.4. Uropatogenne pałeczki E. coli
Uropatogenne szczepy E. coli (UPEC) wykazują zróżnicowanie pod względem
zdolności dokolonizacji oraz przetrwania wewnątrz komórek nabłonkowych pęcherza i nerek(Zhou i wsp. 2001, Mulvey 2002, Watts i wsp. 2012, Ostrowska i wsp. 2013, Bury
2015). Stwierdzono, że UPEC kolonizujące drogi moczowe mogą pochodzić z przewodu pokarmowego. Transmisja tych drobnoustrojów może nastąpić poprzez spożycie skażonego pokarmu lub drogą płciową (Walters i wsp. 2012). Czynniki zjadliwości UPEC zazwyczaj
27 kodowane są przez geny chromosomalne, często umiejscowione w obrębie wysp patogenności (Mobley i wsp. 2009).
Najważniejszymi czynnikami wirulencji UPEC są adhezyny i inwazyny umożliwiające pałeczkom E. coli wnikanie do komórek gospodarza, toksyny oraz system pobierania żelaza ułatwiający przetrwanie bakterii w warunkach ograniczonego dostępu do tego pierwiastka(Garcia i wsp. 2011, Bury 2012, Zaw i wsp. 2013). Do toksyn wytwarzanych przez UPEC należą między innymi hemolizyny, cytotoksyczny czynnik nekrotyzujący 1 (CNF1), toksyna autotransportująca. Jony żelaza mogą być pobierane przez pałeczki E. coli z udziałem enterobaktyny, aerobaktyny, yersiniabaktyny, salmocheliny, systemu wykorzystania hemu – chu i hma lub systemu transportu jonów żelaza – sit. Szczepy UPEC posiadają zdolność namnażania wewnątrzkomórkowego (Blanco i wsp. 1997, Johnson i Stell 2000, Garcia i wsp. 2011).
2.5. Czynniki determinujące chorobotwórczość UPEC
Drobnoustroje infekujące układ moczowy posiadają wyspecjalizowane mechanizmy pozwalające na przyleganie do nabłonkowych lub śródnabłonkowych warstw komórek pęcherza moczowego, co prowadzi do kolonizacji, a następnie do infekcji dróg moczowych.
Czynnikami determinującymi chorobotwórczość UPEC są adhezyny wchodzące w skład fimbrii typu 1 i P,które mają powinowactwo do dróg moczowych, fimbrie typu S,które mają powinowactwo do naczyń mózgowych, białka z rodziny Dr, warunkujące wiązanie drobnoustroju do swoistego receptora komórek gospodarza oraz toksyny wytwarzane przez te pałeczki.
2.5.1. Adhezyny
Adhezyny warunkują przyleganie bakterii do komórek nabłonka dróg moczowych, umożliwiają kolonizację zajmowanej powierzchni oraz chronią komórki bakteryjne przed usunięciem podczas mikcji (Chmielewska i wsp. 2016). Ważną grupą adhezyn warunkującą wiązanie komórek bakteryjnych z nabłonkiem dróg moczowych są adhezyny fimbrialne.
Fimbrie są sztywnymi struktury białkowymi o długości około 1-3 µm i szerokości kilku nanometrów. Sztywność fimbrii ułatwia pałeczkom E. coli przeciwstawianie się nieregularnemu przepływowi moczu w cewce moczowej. Fimbrie są heterokompleksami składającymi się z podjednostek białkowych (fibrynoliny) tworzących strukturę wypustki i monomerów mniejszych podjednostek, odpowiedzialnych za wydłużanie wypustek, ich
28 stabilność oraz funkcje wiążące (Schwan i wsp. 2002, Andersson i wsp. 2007, Mirecka 2011).
Na szczycie takiej struktury znajduje się element rozpoznający receptor na komórkach nabłonkowych. W patogenezie ZUM największe znaczenie mają fimbrie typu 1, fimbrie typu P oraz adhezyny z rodziny białek Dr/Afa (Pickner i wsp. 2006, Dzierżanowska 2008).
2.5.1.1 Fimbrie typu 1
Fimbrie typu 1zwane pospolitymi są najczęstszym typem fimbrii występującym u UPEC. Występują u bakterii kolonizujących dolne odcinki układu moczowego.Obecność tych fimbrii stwierdzono u szczepów odpowiedzialnych za zapalenie pęcherza moczowego, natomiast rzadko wykazywano ich obecność u pałeczek E. coli izolowanych od pacjentów z zapaleniem nerek (Hermann i wsp. 2002, Andersson i wsp. 2007).
Schwan i wsp. (2002) stwierdzili, że ponad 85% szczepów E. coli posiada geny kodujące ten typ fimbrii, natomiast ponad 70% szczepów wytwarza je na swej powierzchni.
Badania przeprowadzone przez Hung i wsp. (2013) wykazały, że odgrywają one kluczową rolę w stabilności i rozwoju struktury biofilmu oraz biorą udział w stymulowaniu bakteryjnej autoagregacji. Adhezja bakterii z udziałem tych fimbrii jest niezbędna do utrzymania spójności tworzonej biomasy biofilmu. Wykazano, że szczepy z niefunkcjonalnym białkiem FimH, tworzyły cieńszy i słabszy biofilm z widocznymi zaburzeniami integralności w strukturze biofilmu (Beloin i wsp. 2008). Floyd i wsp. (2015) wykazali, że fimbrie typu 1 występują głównie u bakterii tworzących górną warstwę biofilmu, do której wnika tlen.
Pośrednicząc w formowaniu biofilmu ułatwiają szczepom UPEC kolonizację cewników lub implantów (Mulvey 2002, Pinkner i wsp. 2006, Mirecka 2011, Hung i wsp. 2013). Fimbrie typu 1 zakończone są białkiem FimH, które jest ważnym czynnikiem wirulencji UPEC.
Komórki pozbawione FimH nie kolonizują dróg moczowych, a zmiany w tym białku prowadzą do utraty właściwości inwazyjnych szczepów E. coli (Säemann i wsp. 2005, Dybowski 2007). W drogach moczowych białko FimH łączy się z receptorem uroplakinowym 1a (UP1a) komórek nabłonka pęcherza moczowego zawierającym reszty mannozowe (Bouckaert i wsp. 2006, Pinkner i wsp. 2006, Witkowska i wsp. 2009, Mirecka 2011).
Wykazano, że około 80% komensalnych izolatów E. coli wytwarza białko FimH wiążące tylko trimannozowe receptory, natomiast około 70% izolatów UPEC wytwarza zmienione białko FimH o dużym powinowactwie także do monomannozowych receptorów, co zwiększa stopień kolonizacji układu moczowego przez te szczepy(Muelvey 2002). Ważnym mechanizmem chroniącym drogi moczowe przed inwazją bakteryjną jest białko Tamma-
29 Harsfalla wydzielane przez nerki w pętli Henlego. Białko Tamma-Harsfalla zawierające łańcuch o wysokiej zawartości mannozy wiąże się z FimH, uniemożliwiając związanie bakterii z receptoremUP1a komórek nabłonka pęcherza moczowego(Säemann i wsp. 2005).
Uroplakiny umiejscowione w błonie komórek urotelialnych są glikoproteinami, które mają za zadanie uszczelnić urotelium, co zmniejsza jego przepuszczalnośćdla jonów i substancji rozpuszczonych w moczu (Connell i wsp. 1996, Zhou i wsp. 2001, Apodaca 2004, Säemann i wsp. 2005, Dybowski 2007).
Fimbrie typu 1 należą do grupy fimbrii mannozowrażliwych. Receptory na powierzchni tkanek zawierające mannozę są łatwo rozpoznawane przez fimbrie typu 1, które umożliwiają ścisłą przyczepność w obliczu naprężeń mechanicznych występujących w pęcherzu moczowym (Thomas i Elkinton 2004). E. coli wiążąc się z β1 integrynami wykorzystuje kilka strukturalnych komponentów komórki gospodarza, w tym cytoszkielet aktynowy, mikrotubule i lipidy, aby wejść do komórki (Eto i wsp. 2007, Dhakal i Mulvey 2009). Fimbrie typu 1 wywołują silną reakcję ze strony komórek układu odpornościowego, tj. leukocytów obojętnochłonnych (wielojądrzastych), makrofagów i limfocytów. Ekspresja fimbrii typu 1 podlega zjawisku zmienności fazy, polegającemu na włączeniu lub wyłączeniu stanu ufimbriowania przez poszczególne komórki. Obecne w pęcherzu moczowym komórki E. coli syntetyzują ten rodzaj fimbrii, natomiast te same komórki w nerce nie wytwarzają tych struktur. Wyłączenie syntezy fimbrii przez komórki bakteryjne w nerkach osłabia reakcję obronną ze strony leukocytów obojętnochłonnych (Wyszyńska 1991). Fimbrie typu 1 łączą się z receptorami glikoproteinowymi obecnymi na leukocytach wielojądrzastych, co zapoczątkowuje reakcję zapalną, a uwolnione z leukocytów liczne substancje (enzymy lizosomalne, nadtlenki i wolne rodniki) o działaniu bakteriobójczym uszkadzają tkankę nerkową powodując martwicę i utratę czynnego miąższu podczas odmiedniczkowego zapalenia nerek (Krzeska i wsp. 1992). Komórkami układu odpornościowego pierwszej linii obrony podczas infekcji układu moczowego są mastocyty (komórki tuczne), licznie występujące bezpośrednio pod nabłonkiem pęcherza moczowego, w śluzówce, blaszce właściwej śluzówki oraz w mięśniu pęcherza. Szczepy E. coliwytwarzające fimbrie typu 1 powodują wzrost wydzielania histaminy przez komórki tuczne. Wydzielanie histaminy jest połączone z wydzielaniem innych substancji chemotaktycznych dla leukocytów, takich jak leukotrien B4. Substancje te odpowiadają za obserwowany w przebiegu zakażenia ropomocz, a także za typowe objawy zapalenia pęcherza moczowego, jak częstomocz, moczenie nocne, parcie na mocz i odczucia bólowe. Ból jest wywołany przez histaminę i bradykininę,
