Toksyny wytwarzane przez UPEC

Toksyny UPEC są ważnym czynnikiem wirulencji, ponieważ mogą indukować odpowiedź zapalną i prowadzić do objawów infekcji dróg moczowych. Naruszając integralność komórek pomagają drobnoustrojom rozprzestrzeniać się w tkankach gospodarza, warunkują dostęp do substancji odżywczych oraz powodują niszczenie komórek obronnych organizmu gospodarza. Do najważniejszych toksyn wytwarzanych przez UPEC należą hemolizyny oraz cytotoksyczny czynnik nekrotyzujący 1 (CNF1) (Johnson 1991, Oliveira i wsp. 2011, Okrągła i wsp. 2014).

2.5.2.1. Hemolizyny

Ważnym czynnikiem wirulencji szczepów E. coli są hemolizyny. Chorobotwórcze szczepy E. coli wytwarzają hemolizyny, które można podzielić na wydzielane przez komórki bakteryjne do środowiska zewnętrznego (hemolizyna α, cytotoksyna ClyA) oraz związane z komórką bakteryjną (enterohemolizyny, hemolizyna β, hemolizyny kontaktowe, hemolizyna τ, hemolizyna szczepów enterokrwotocznych) (Pawłowska i Sobieszczańska 2016). Najlepiej poznaną hemolizyną wytwarzaną przez pałeczki E. coli jest hemolizyna α (HlyA), uważana za czynnik wirulencji szczepów E. coli odpowiedzialnych za zakażenia ogólnoustrojowe oraz za ZUM. Synteza, aktywacja i sekrecja hemolizyny HlyA jest kodowana przez 4 geny (hlyC, hlyA, hlyD, hlyB) umiejscowione w operonie hly, który znajduje się na plazmidzie koniugacyjnym lub chromosomie (Ludwig i wsp. 1996). Gen hlyA koduje białko strukturalne będące prekursorem HlyA (tzw. pro-HlyA), którego potranslacyjna aktywacja polega na acylacji dwóch wewnętrznych reszt lizynowych (Lys⁵⁶⁴, Lys⁶⁹⁰). Aktywacja pro-HlyA zachodzi w cytoplazmie w obecności białka HlyC, które jest acylotransferazą transportującą

34 kwas mirystynowy i palmitynowy z białka donorowego ACP (Acyl-Carier Protein) na pro-HlyA.Transport HlyA przez błonę wewnętrzną odbywa się przy udziale białek HlyB i HlyD, które tworzą kompleks translokacyjny (tzw. translokator). Gen hlyB koduje ATPazę HlyB, posiadającą trzy pary helikalnych regionów transbłonowych łączących cząsteczkę HlyB z błoną wewnętrzną (Stanley i wsp. 1998, Guzman-Veri i wsp. 2001). Natomiast związanie HlyB z HlyA odbywa się przez NH2- i COO-terminalne pętle cytoplazmatyczne. ATPaza HlyB posiada także integralną domenę wiążącą ATP. Białko pomocnicze HlyD kodowane jest przez gen hlyD. Translokator wraz z białkiem błony zewnętrznej TolC umożliwiają wydzielanie aktywnej cząsteczki HlyA do środowiska, po czym składniki kompleksu translokacyjnego powracają do stanu wyjściowego.

Uważa się, że ekspresja HlyA zależy także od genów biorących udział w biosyntezie LPS szczepów α-hemolizujących. LPS uczestniczy w formowaniu i utrzymaniu aktywnej konformacyjnie cząsteczki hemolizyny oraz chroni ją przed agregacją i degradacją (Ramboarina i wsp. 2005). Toksyna HlyA w środowisku zewnętrznym stopniowo ulega inaktywacji i tworzy duże agregaty, które nie wiążą jonów wapnia (Cortajarena 2002). HlyA w temperaturze 37°C nieodwracalnie łączy się z błonami erytrocytów, ale także wykazuje aktywność cytolityczną w stosunku do granulocytów, monocytów, komórek śródbłonka, nabłonka kanalików nerkowych przeżuwaczy, naczelnych i myszy (Guzmn-Verii i wsp. 2001, Sobieszczańska 2007). Zdolność wiązania HlyA ze sztucznymi błonami lipidowymi wskazuje na brak swoistych dla niej receptorów. Wiązanie to nie jest zależne od obecności jonów

wapnia i temperatury, natomiast proces lizy komórek jest zależny od tych czynników.

W procesie lizy N-terminalny, hydrofobowy region cząsteczki HlyA wbudowuje się w rdzeń błony plazmatycznej komórek eukariotycznych, gdzie HlyA zachowuje się jak integralne białko. HlyA indukuje także zmiany w poziomie jonów wapnia w komórkach nabłonka kanalików nerkowych, co stanowi sygnał do uwolnienia cytokin pozapalnych, takich jak IL-6 i IL-8 (Hernandes i wsp. 2009) oraz powoduje apoptozę limfocytów (Ogino i wsp. 2006).

Hemolizyna ClyA (SheA, HlyE) jest cytolizyną wykrytą po raz pierwszy u laboratoryjnego szczepu E. coli K-12. Wytwarzanie ClyA zachodzi w warunkach

beztlenowych, natomiast sekrecja do środowiska zewnętrznego jest najwyższa w późnej fazie logarytmicznego wzrostu (Ludwig i wsp. 1999, Castillo i wsp. 2001). ClyA gromadzi się w przestrzeni periplazmatycznej komórki bakteryjnej, a mechanizm jej sekrecji nie został dokładnie poznany. ClyA uwalniana jest w pęcherzykach widocznych w mikroskopie elektronowym w supernatantach hodowli bulionowych E. coli. U większości dzikich

35 szczepów E. coli, ClyA nie ulega ekspresji na wykrywalnym poziomie, co prowadzi do braku hemolitycznego fenotypu. ClyA powoduje powstawanie w błonach komórek eukariotycznych kationowo-selektywnych por złożonych z ośmiu niekowalentnie związanych cząsteczek cytolizyny (Afset i wsp. 2004). Pory tworzone w błonach plazmatycznych komórek eukariotycznych prowadzą do zmian stężenia wewnątrzkomórkowego wapnia, pobudzając kaskadę apoptozy. Oczyszczona ClyA działa toksycznie w stosunku do ludzkich i mysich makrofagów, ludzkich monocytów oraz komórek linii HeLa, powoduje także lizę erytrocytów różnych gatunków zwierząt oraz ludzkich. Aktywność hemolityczna ClyA nie wymaga jonów wapnia i jest hamowana przez cholesterol (Westermark i wsp. 2000).

Hemolizyna β wytwarzana w logarytmicznej fazie wzrostu jest związana z komórką bakteryjną i wymaga do aktywności jonów wapnia. Wykazuje aktywność hemolityczną w stosunku do erytrocytów różnych gatunków zwierząt. Strefy hemolizy wokół kolonii bakteryjnych wyrosłych na podłożach agarowych z krwią są przejrzyste i dobrze widoczne.

Hemolizyna β wykazuje podobieństwo do HlyA i wiele szczepów E. coli syntetyzuje obie te toksyny jednocześnie. W przeciwieństwie do HlyA wydaje się nie być immunogenną;

przeciwciała uzyskane dla szczepów β-hemolizujących nie neutralizują aktywności hemolitycznej tych szczepów. Hemolizyna β osiąga optymalną aktywność przy pH 5,5-8,0.

Gadberg i wsp. (1984) wykazali, że komórki bakteryjne wytwarzające hemolizynę β były cytotoksyczne dla monocytów i granulocytów, natomiast limfocyty okazały się stosunkowo oporne na działanie tej hemolizyny. Efekt cytotoksyczny był zależny od temperatury i dawki hemolizyny.

2.5.2.2. Cytotoksyczny czynnik nekrotyzujący 1 (CNF1)

Cytotoksyczny czynnik nekrotyzujący 1 (CNF1) jest toksyną białkową wytwarzaną przede wszystkim przez szczepy E. coli izolowane z przypadków bakteriemii, zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków oraz z przypadków infekcji dróg moczowych, rzadziej z przewodu pokarmowego dzieci z biegunką (Blanco i wsp. 1990, Houdouin i wsp. 2002).

CNF1 wiąże się z powierzchnią hodowanych komórek nabłonka. Kim i wsp. (2005) wykazali, że szczep E. coli K1, który wytwarza CNF1, może być internalizowany po związaniu toksyny z dojrzałym receptorem lamininy. Zarówno prekursor, jak i dojrzałe postacie receptora lamininowego ulegają ekspresji na powierzchni komórek eukariotycznych. Po związaniu się z receptorem, CNF1 drogą endocytozy przedostaje się do wnętrza komórki, po czym jego domena katalityczna ulega translokacji do cytoplazmy. Toksyczność CNF1wynika z jego

36 zdolności do aktywacji białek Rho (Ras Homologues), Rac (Reorganization of Actin Cytoskeleton) i Cdc42, które głównie regulują organizację cytoszkieletu aktynowego. Poprzez

aktywację białek Rho, CNF1 wpływa na znaczącą reorganizację cytoszkieletu aktyny w ludzkich komórkach nabłonkowych, co włącza proces marszczenia błony i powstania wypustek cytoplazmatycznych. Rozległe modyfikacje układu mikrowłókien aktynowych, indukowane przez CNF1 wywołują swoiste zachowanie fagocytarne. Komórki nabłonka nabywają zdolność wychwytywania i internalizacji różnych rodzajów cząstek, w tym także bakterii, poprzez mechanizm endocytozy. Mimo, że Rho, Rac i Cdc42 głównie regulują organizację cytoszkieletu aktynowego, białka te także są zaangażowane w wiele innych procesów komórkowych. Konsekwencją aktywacji Rho przez CNF1 jest indukcja wielu zależnych od aktyny lub niezależnych procesów, w tym zmian w transkrypcji genów, wywoływanie makropinocytozy, kurczliwości i rozprzestrzeniania się komórek, wpływ na

proliferację komórek, progresję cyklu komórkowego oraz na zdolność do zmian w różnicowaniu komórek. Cytotoksyczny czynnik nekrotyzujący wytwarzany jest przez około

jedną trzecią szczepów UPEC (Bien i wsp. 2012). Wymienione właściwości CNF1 wpływają na komórki UPEC warunkując ich przetrwanie i rozprzestrzenianie się w organizmie gospodarza (Davis i Marques 2005, Fabbri i wsp. 2010).

2.5.2.3. Siderofory

Siderofory odpowiadają za dostarczenie komórce bakteryjnej jonów żelaza (Fe³⁺) w środowisku, w którym brakuje tego pierwiastka. O zdolności namnażania się bakterii w tkankach i narządach, w tym także w nerkach, decyduje obecność odpowiednich substratów pokarmowych oraz jonów, z których żelazo jest niezbędne do syntezy cytochromów, reduktazy rybonukleotydów i innych enzymów. W moczu ilość wolnego żelaza jest duża, natomiast w tkankach występuje ono przede wszystkim w postaci związanej w takich makrocząsteczkach, jak transferyna i laktoferyna. Większość bakterii nie jest zdolna do wykorzystania żelaza związanego w hemocząsteczkach. Bakterie do prawidłowego wzrostu i aktywności metabolicznej wymagają stężenia żelaza porównywalnego do stężenia występującego w cytoplazmie (około 10^-6M). Patogenne bakterie są wyposażone w systemy do pobierania żelaza z organizmu gospodarza, co ułatwia im przetrwanie w warunkach ograniczonego dostępu do tego pierwiastka, który jest ważnym czynnikiem wzrostu bakterii.

Pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzają siderofory o budowie hydroksamowej (aerobaktyna) oraz o katecholowej (enterobaktyna), których działanie polega na uwalnianiu

37 żelaza z kompleksów białkowych gospodarza i przenoszeniu go za pośrednictwem białkowych receptorów i przenośników błonowych do cytozolu komórki bakteryjnej, gdzie jest ono uwalniane (Siudeja i Olczak 2004). Wytwarzanie aerobaktyny przez UPEC jest częstsze niż wytwarzanie hemolizyny. W wyniku wydzielania aerobaktyny szczepy E. coli mogą wywoływać tzw. „rozedmowe” odmiedniczkowe zapalenie nerek, często o śmiertelnym przebiegu (Mikucki i wsp. 1998, Viles i wsp. 2008).