Antybiotykoterapia ZUM

ZUM jest schorzeniem stanowiącym problem zarówno w lecznictwie otwartym jak i zamkniętym. Leczenie przeciwbakteryjne oprócz wyjałowienia układu moczowego oraz usunięcia stanu zapalnego ma zminimalizować prawdopodobieństwo wystąpienia następstw zakażenia, takich jak bliznowacenie miąższu nerek, rozwoju PChN (przewlekła choroba nerek),niewydolności nerek, nadciśnienia tętniczego, przedwczesnego porodu u ciężarnych oraz urosepsy (SIRS, ang. systemic inflammatory respone syndrom), wskutek której w około 30% przypadków dochodzi do wstrząsu septycznego (Zapała i wsp. 2013). W zakażeniach dróg moczowych ważne jest szybkie wdrożenie leczenia przeciwbakteryjnego. U dzieci, u których włączono leczenie po 48 godzinach od wystąpienia gorączki, ryzyko powstania blizn w nerkach wzrastało o 50% (Załęska-Panganis i wsp. 2016). U 50-70% chorych na ZUM w postaci ostrego niepowikłanego zapalenia pęcherza, uzyskuje się samoistne wyjałowienie układu moczowego bez leczenia, chociaż objawy dyzuryczne mogą utrzymywać się przez kilka miesięcy (Kupilas 2013). Lekami stosowanymi w pierwszym etapie leczenia ZUM są fluorochinolony, trimetoprim z sulfometoksazolem oraz nitrofurantoina (Kupilas 2013). Mechanizmy oporności na antybiotyki, jakie występują u bakterii Gram-ujemnych mogą być przyczyną niepowodzeń w leczeniu ZUM, mogą prowadzić doselekcji i rozprzestrzeniania się szczepów wielolekoopornych, a nawet zgonu chorego. W skutek niewłaściwej antybiotykoterapii może dojść do kolejnych zakażeń dróg moczowych szczepami egzogennymi o obniżonej wrażliwości na antybiotyki (Kraśnicki i wsp. 2007). Podczas terapii antybiotykami drobnoustroje są poddawane działaniu leku o stężeniu podprogowym, co indukuje zmiany w morfologii i strukturach powierzchniowych komórek oraz hamuje wytwarzanie toksyn. Stężenia podprogowe przyczyniają się jednak do wyselekcjonowania szczepów opornych, a powstawanie zmienionych morfologicznie komórek bakteryjnych utrudnia ich rozpoznanie (Wojnicz 2007, Dzierżanowska 2008).

Narastająca liczba przypadków ZUM powodowanych przez pałeczki E. coli, które często

38 wykazują oporność na antybiotyki należące do jednej lub kilku grup, uzasadnia konieczność prowadzenia badań, których celem jest określenie czynników zjadliwości i mechanizmów oporności na antybiotyki stosowane w lecznictwie (Boczek i wsp. 2007).

2.6.1 Mechanizmy oporności na antybiotyki pałeczek E. coli odpowiedzialnych za ZUM Pałeczki Gram-ujemne mogą być naturalnie oporne na określoną grupę antybiotyków, mogą nabyć oporność w wyniku mutacji (mutacje w genie kodującym gyrazę prowadzą do powstania oporności na chinolony) lub w wyniku przeniesienia ruchomych elementów genetycznych (plazmidy, kasety genowe, transpozony, integrony) zawierających geny warunkujące oporność na daną grupę antybiotyków (Souli i wsp. 2008, Garbusińska i wsp.

2017). Z uwagi na zróżnicowany zakres lekooporności dokonano podziału szczepów bakteryjnych na wielolekooporne - MDR (ang. multidrug resistant), o rozszerzonej oporności - XDR (ang. extensively drug-resistant) oraz o całkowitej oporności na antybiotyki - PDR (ang. pandrug resistant) (Manhanda i wsp. 2010, Sopirala i wsp. 2010, Magiorakos i wsp.

2012, Hryniewicz 2012).

Szczepy bakteryjne izolowane z moczu pacjentów ze szpitalnym ZUM są mniej wrażliwe na antybiotyki w porównaniu ze szczepami powodującymi inne zakażenia.

Spowodowane jest to przede wszystkim dużą liczbą komórek bakteryjnych podczas ostrego zakażenia pęcherza lub ostrego zapalenia nerek (10⁸-10⁹ CFU/ml). Wysoka częstość podziałów w licznej populacji bakterii w obecności antybiotyku sprzyja zwiększonej częstości mutacji i selekcji komórek, które nabyły cechy oporności. Wysokie stężenie osiągane przez antybiotyki w moczu, często wielokrotnie przekraczające wartość MIC (ang. minimum inhibitory concentration), powoduje że w przypadku leczenia niepowikłanego zakażenia wywoływanego przez wrażliwy szczep bakterii, selekcjonowanie mutantów opornych zachodzi bardzo rzadko. Selekcja wariantów opornych na antybiotyki przebiega z różną częstością, zależną od antybiotyku i rodzaju bakterii. Rewersja populacji bakterii do fenotypu wrażliwego jest możliwa i zależy od wielu czynników, m.in. od mechanizmu oporności, lokalizacji chromosomalnej lub plazmidowej genów warunkujących oporność, stabilności plazmidów niosących te geny, występowania oporności krzyżowej z inną grupą antybiotyków (Hryniewicz i Holecki 2015).

U pałeczek E. coli oporność na antybiotyki β-laktamowe jest związana z syntezą β–

laktamaz, do których należą cefalosporynazy AmpC, β-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL, ang. extended-spectrum beta-lactamases), metalo-β-laktamazy MBL

39 (karbapenemazy) (Arcidiacono i wsp. 2002, Kraśnicki i wsp 2007). W następstwie powszechnego stosowania antybiotyków cefalosporynowych w leczeniu zakażeń szpitalnych w większości krajów europejskich (także w Polsce) pojawiły się szczepy pałeczek E. coli, wytwarzające enzymy o rozszerzonym spektrum substratowym. β-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym hydrolizują cefalosporyny III i IV generacji oraz aztreonam, natomiast nie hydrolizują karbapenemów i cefamycyn. W pojedynczych przypadkach szczepy mogą być wrażliwe na cefalosporyny III generacji i penicyliny z inhibitorami β-laktamaz, ale

ich zastosowanie jest możliwe tylko po uzyskaniu wyniku antybiogramu (Hryniewicz i Holecki 2015). Geny zlokalizowane w chromosomie warunkują naturalną oporność,

natomiast zdecydowana większość β-laktamaz nabytych, kodowana jest przez geny położone

na ruchomych elementach genetycznych, co sprzyja szybkiemu szerzeniu się tej cechy w obrębie tego samego gatunku lub gatunków genetycznie odległych (Jursa i wsp. 2004).

Aminoglikozydy działają bakteriobójczo na większość bakterii Gram-ujemnych, są lekiem rekomendowanym w leczeniu empirycznym chorych na niepowikłane ostre odmiedniczkowe zapalenie nerek oraz u chorych z powikłanym ZUM (Grabe i wsp. 2015).

Oporność E. coli na antybiotyki aminoglikozydowe może być związana ze zmianą

przepuszczalności błony komórkowej. Oporność ta ma charakter nabyty, wiąże się z mutacjami w chromosomie. Transport aminoglikozydów do wnętrza komórki bakteryjnej

zależy od potencjału energetycznego, który wytworzony jest przez transport elektronów.

Zaburzenie przepuszczalności ściany komórkowej u klinicznych szczepów E. coli jest związane ze zmianami w peptydoglikanie. Jednak dominującym mechanizmem oporności na aminoglikozydy jest zdolność syntezy enzymu modyfikującego te antybiotyki. Dołączenie reszty acetylowej lub nukleotydowej do miejsca aktywnego cząsteczki antybiotyku, którym jest grupa hydroksylowa lub aminowa, prowadzi do utraty jego aktywności biologicznej w wyniku braku zdolności wiązania z wewnątrzkomórkowym receptorem antybiotyku, jakim jest podjednostka 30S rybosomu. Wśród opornych szczepów pałeczek Gram–ujemnych dominują enzymy acetylujace AAC(3) występujące we wszystkich formach izomerycznych oraz nukleotydylotransferaza ANT(2’) (Wojnicz 2007).

Oporność bakterii na fluorochinolony może być związana z mutacją w genach gyrazy/topoizomerazy IV lub czynnym usuwaniem leku z komórki (efflux pump). Zmiany dotyczące gyrazy/topoizomerazy IV częściej występujące u bakterii Gram-ujemnych, związane są z obecnością białka GyrA lub GyrB. Geny kodujące oba białka położone są

w obrębie tzw. QRDR (quinolone-resistance determining regions). W przypadku

40 E. coli najczęstszą mutacją jest substytucja seryny w pozycji 83 albo asparaginianu w pozycji 87, warunkująca zmniejszone powinowactwo norfloksacyny do kompleksu DNA gyrazy lub obecność zmutowanego białka GyrB, które zmienia asparaginian w pozycji 426 na alaninę lub lizynę w pozycji 447 na glutaminę. Obie te zmiany warunkują oporność na kwas nalidyksowy (Dzierżanowska 2008, Dzierżanowska 2009, Dutkiewicz 2012).

Główny mechanizm oporności na trimetoprim/sulfometaksazol, polega na spadku powinowactwa do reduktazy dwuhydrofolianowej. Geny folA i folB odpowiedzialne za zmiany w reduktazie dwuhydrofolianowej mogą być zlokalizowane na transpozonie zintegrowanym z plazmidem lub chromosomem. Niektóre oporne szczepy pałeczek Gram-ujemnych wytwarzają od 3 do 80 razy więcej reduktazy dwuhydrofolianowej, co prowadzi do

spadku powinowactwa i oporności wysokiego stopnia. Wykazano, że trimetoprim z sulfometaksazolem nie należy do chemioterapeutyków szybko selekcjonujących szczepy

oporne wśród pałeczek Gram-ujemnych z rodziny Enterobacteriaceae (Dzierżnowska 2005).

Główny mechanizm oporności na tetracykliny, nadający bakteriom oporność na duże dawki antybiotyku, polega na czynnym usuwaniu antybiotyku z komórki przez kanały porynowe (efflux pump). Inny mechanizm oporności polega na modyfikacji miejsca docelowego działania na rybosomie, za który odpowiedzialne są geny należące do rodziny tet, zlokalizowane na transpozonie (Markiewicz, Kwiatkowski 2001, Karami i wsp. 2006).

2.7. Biofilm bakteryjny

W środowisku przyrodniczym bakterie występują głównie w postaci biofilmu, który tworzą mikrokolonie komórek osiadłych, otoczone macierzą zewnątrzkomórkową. W skład macierzy zewnątrzkomórkowej wchodzą m.in. polisacharydy, białka, lipidy, kwasy nukleinowe,surfaktanty wytwarzane przez komórki osiadłe. Mikrokolonie oddzielone są siecią kanałów wodnych, które służą do rozprowadzania substancji odżywczych oraz odprowadzania wtórnych produktów metabolizmu. Macierz zewnątrzkomórkową stanowi około 75-90% biofilmu (Stickler i wsp. 2008, Percival i wsp. 2011, Tenke i wsp. 2012, Vertes i wsp.2012). Komórki osiadłe wykazują odmienne cechy w porównaniu do komórek wolno żyjących (Garrett i wsp. 2008, Chatterjee i wsp. 2014). Biofilm może być utworzony przez drobnoustroje należące do jednego gatunku lub może być złożony z kilku lub kilkunastu różnych gatunków (Richards i wsp. 2009). Kształt biofilmu uzależniony jest od warunków środowiskowych. W miejscach gdzie narażony jest na szybki przepływ fazy wodnej, występuje on w postaci płaskiej, natomiast tam gdzie przepływ fazy wodnej jest powolny

41 tworzy kolumny lub występuje w postaci błony o kształcie grzyba (Strużycka 2010).

Biofilm umożliwia drobnoustrojom przetrwanie w niesprzyjających warunkach środowiskowych. W procesie kolonizacji powierzchni przez komórki bakteryjne wyróżnia się etapy: transportu bakterii do powierzchni, adhezji oraz kolonizacji zasadniczej, podczas której przylegające bakterie zaczynają się dzielić, tworząc mikrokolonie i różnicować w populację biofilmu (Trafny 2000). Adhezja właściwa bakterii jest głównym etapem w procesie kolonizacji tkanek gospodarza, ponieważ wówczas bakterie przyłączają się w sposób nieodwracalny do powierzchni komórek nabłonka i substancji pozakomórkowej. Szybkość podziałów komórek bakteryjnych zależy od ich umiejscowienia w biofilmie, gdzie w różnych warstwach występują odmienne stężenia substratów i produktów metabolizmu bakterii oraz różna dostępność tlenu (Gristina i wsp. 1987). Powierzchniowe warstwy biofilmu mają dostęp do tlenu, natomiast w głębszych warstwach biofilmu, obniżone stężenie tlenu prowadzi do uaktywnienia beztlenowych szlaków metabolicznych takich jak denitryfikacja, desulfurikacja oraz fermentacja, podczas których powstaje mniejsza ilość energii, co zmniejsza tempo wzrostu komórek bakteryjnych (Czaczyk i wsp. 2003). Następuje także zahamowanie syntezy enzymów (proteaz, fosfolipaz) oraz toksyn (Bryers 2008).

Istotnym problemem, wynikającym ze zdolności adhezyjnych drobnoustrojów i tworzenia biofilmu są zakażenia występujące u pacjentów hospitalizowanych, u których

stosuje się biomateriały, z których wykonywane są przyrządy medyczne, takie jak cewniki, dreny, protezy kostne, stawowe, zastawki serca itp. Szacuje się, że ok. 60–70% zakażeń szpitalnych jest wynikiem tworzenia się biofilmu na powierzchni stosowanych materiałów medycznych. Biofilm bakteryjny na powierzchni tkanek lub biomateriałów wykazuje zwiększoną oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe oraz znaczną odporność na

komórkowe i humoralne mechanizmy obrony immunologicznej gospodarza. Powodzenie w leczeniu tego rodzaju zakażeń bardzo często wiąże się z potrzebą usunięcia biomateriału

z organizmu chorego. Infekcje ogólnoustrojowe powstałe w rezultacie cewnikowania dróg moczowych (urosepsa) zagrażają życiu pacjenta, ponieważ biofilm bakteryjny jest trudny do wykrycia w rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej i oporny na stosowane antybiotyki (Donlan i Costerton 2002, Mirecka 2011). Rozwój zakażenia w miejscu wprowadzenia biomateriału zależy od właściwości jego powierzchni i czasu przylegania drobnoustrojów do tej powierzchni (Różalska i wsp. 1998). Pierwsza warstwa komórek drobnoustrojów wiąże się z powierzchnią zazwyczaj za pomocą fimbrii. Następne komórki przylegają dzięki wydzielaniu wielocukrowych substancji śluzowych. Śluz pokrywający uformowaną strukturę

42 biofilmu zabezpiecza komórki osiadłe przed działaniem przeciwciał, fagocytozą, utrudnia opsonizację, zaburza chemotaksję. Komórki drobnoustrojów w biofilmie nie prezentują miejsca docelowego przyłączania się antybiotyków, co zmniejsza ich wrażliwość na działanie antybiotyków (Donlan 2002, Hoiby i wsp. 2011). Ponadto macierz zewnątrzkomórkowa ma zdolność pochłaniania substancji toksycznych nie przepuszczając ich do cytoplazmy (Czaczyk i wsp. 2003).Oporność drobnoustrojów na środki antybakteryjne spowodowana jest także zwolnionym metabolizmem komórek osiadłych.

Funkcjonowanie biofilmu warunkowane jest zdolnością komunikowania się komórek poprzez wytwarzanie cząsteczek sygnałowych, dyfundujących z jednej komórki do drugiej, co określane jest jako wyczuwanie gęstości komórek w biofilmie (QS, ang. Quorum Sensing) (Kolenbrander i wsp. 2002). Komunikowanie się komórek związane jest z wytwarzaniem autoinduktorów o niskich masach cząsteczkowych oraz obecności białkowych regulatorów transkrypcyjnych. Związanie cząsteczki autoinduktora z białkiem regulatorowym prowadzi do zmiany jego konformacji, które następnie indukuje transkrypcję genów docelowych (Czaczyk i wsp. 2003). Biofilm utworzony przez drobnoustroje należące do mikroflory komensalnej chroni tkankę gospodarza przed kolonizacją przez patogenne drobnoustroje, natomiast drobnoustroje tworzące biofilm na tkankach gospodarza pierwotnie jałowych są przyczyną przewlekłych infekcji (Trafny 2000, Stewart i wsp. 2001).

Badania przeprowadzone przez Hung i wsp. (2013) wykazały, że fimbrie typu 1 odgrywają kluczową rolę w stabilności i rozwoju struktury biofilmu. Adhezja bakterii z udziałem tych fimbrii jest niezbędna do utrzymania spójności tworzonej struktury biofilmu. Wykazano, że szczepy z niefunkcjonalnym białkiem FimH, które umiejscowione jest w końcowej części fimbrii typu 1 prowadziło do utworzenia cieńszego i słabszego biofilmu z widocznymi zaburzeniami integralności w postaci pęknięć.

Wiedza na temat powstawania, funkcjonowania i struktury biofilmu umożliwia poszukiwanie metod zapobiegania i leczenia zakażeń związanych z jego występowaniem.

Istotne jest poszukiwanie metod zapobiegających odcewnikowemu ZUM, które polegają m.in. na powlekaniu cewników warstwą zawierającą biofilm utworzony przez niepatogenne szczepy E. coli (np. HU2117). Innym rozwiązaniem jest zastosowanie przeciwciał wiążących adhezyny bakteryjne lub wytwarzanie specjalnych szczepionek, np. przeciw białkom fimbrialnym bakterii. Istnieje wiele doniesień wskazujących na znaczną redukcję (>90%) biofilmu utworzonego przez patogenne szczepy na cewnikach pokrytych powłoką zawierającą bakteriofagi, m.in. wykazano aktywność bakteriofaga T4 wobec E. coli (Chibeu i wsp. 2012,

43 Scharenberg i wsp. 2012, Siddiq i wsp. 2012, Chen i wsp. 2013). Opisane strategie mające na celu zmniejszenie ryzyka kolonizacji powierzchni biomateriałów przez drobnoustroje chorobotwórcze obejmują także zastosowanie niskocząsteczkowych związków o aktywności przeciwdrobnoustrojowej oraz ingerencję w quorum sensing. Ponadto prowadzone badania mają na celu opracowanie biomateriałów opornych na kolonizację i jednocześnie bezpiecznych dla ludzkiego organizmu. Modyfikacje obejmują zmiany ładunku powierzchniowego, zmniejszenie energii powierzchniowej, zwiększanie hydrofobowości materiałów medycznych oraz powlekanie biomateriałów powłokami zawierającymi związki wykazujące właściwości przeciwdrobnoustrojowe. Spośród antyseptyków stosowanych w lecznictwie największą skuteczność w eradykacji biofilmu wykazuje chlorowodorek oktenidyny. Do obiecujących metod leczenia zakażeń związanych z występowaniem biofilmu należą terapia fotodynamiczna, fagoterapia oraz terapia z wykorzystaniem peptydów przeciwdrobnoustrojowych (Maciejewska i wsp. 2016).

44

3. CEL PRACY

Celem pracy była:

1) ocena lekooporności pałeczek E. coli wyizolowanych z przypadków ZUM u pacjentów hospitalizowanych w różnych jednostkach organizacyjnych szpitala,

2) określenie potencjalnej zjadliwości szczepów E. coli poprzez identyfikację genów kodujących adhezyny, toksyny, system transportu żelaza oraz ustalenie wirulotypów, specyficznych dla szczepów E. coli powodujących ZUM,

3) ocena właściwości adhezyjnych pałeczek E. coli i zdolności do tworzenia biofilmu, 4) ocena działania wybranych wtórnych metabolitów roślinnych jako substancji

zapobiegających i eliminujących biofilm E. coli.

45

4. MATERIAŁY I METODY

4.1. Pobieranie i posiew moczu

Źródłem badanych pałeczek E. coli były próbki moczu pobierane w latach 2007-2008 od pacjentówz objawami ZUM, hospitalizowanych w oddziałach Pediatrii, Położnictwa, Ortopedii, Neurologii, Chorób Wewnętrznych oraz Stacji Dializ Szpitala Powiatowego w Wołominie. Pacjenci do wykonania badania mikrobiologicznego byli kwalifikowani na podstawie objawów klinicznych (gorączka >38°C, ból w okolicy lędźwiowej, ból nadłonowy, parcie na pęcherz moczowy, bolesne oddawania moczu) oraz wskaźników zakażenia dróg moczowych w badaniu ogólnym moczu. Mocz ze środkowego strumienia pobierano dosterylnych pojemnikówzgodnie z instrukcją pobrania materiału do badania. W przypadku małych dzieci i niemowląt mocz pobierano w sposób podany wyżej, a gdy to nie było możliwe wykonywano w warunkach aseptycznych nakłucie nadłonowe lub cewnikowanie

pęcherza moczowego. Próbki moczu pobrane w godzinach nocnych przechowywano w temperaturze 4°C. Uzyskane od pacjentów próbki moczu posiewano ezą kalibrowaną

przenosząc po 10 µl na podłoże chromogenne Chrom ID CPS (bioMérieux) i Columbia agar z dodatkiem 5% krwi baraniej (bioMérieux). Mocz rozprowadzanona powierzchni płytki jednym pociągnięciem ezy od obwodu ku środkowi płytki, po czym prostopadle do

pierwszego posiewu. Posiewy na podłożu CPS inkubowano w temperaturze 37°C w warunkach tlenowych, natomiast na podłożu Columbia agar z dodatkiem krwi baraniej

inkubowano w temperaturze 37°C w atmosferze o zwiększonej zawartości CO2 (5-10%). W dalszych badaniach uwzględniano kolonie, które wyrosły w monokulturze i pochodziły z próbek moczu z bakteriurię znamienną, czyli zawierające ≥10⁵ CFU/ml (ang. Colony Forming Units).

4.2. Ustalenie przynależności izolatów do rodziny Enterobacteriaceae

Wstępną identyfikację izolatów przeprowadzono w oparciu o morfologię kolonii rosnących na podłożu CPS oraz na podłożu Columbia agar z dodatkiem 5% krwi baraniej.

Kolonie różowo-czerwone, wytwarzające β-glukuronidazę na podłożu CPS oraz śluzowe,

46 często otoczone strefą hemolizy na podłożu Columbia agar z dodatkiem 5% krwi baraniej podlegały dalszej ocenie. W celu określenia morfologii komórek wykonano preparaty mikroskopowe barwione metodą Grama. Pałeczki Gram-ujemne badano w kierunku zdolności wytwarzania enzymu oksydazy cytochromowej. Na pasku bibuły rozprowadzano za pomocą ezy komórki bakteryjne zebrane z podłoża agarowego, po czym nanoszono 1% roztwór chlorowodorku tetrametylo-p-fenylenodiaminy (Argenta Oxoid).Granatowe zabarwienie (błękit indolofenolowy) bibuły świadczyło o reakcji dodatniej i wykluczało przynależność izolatu do rodziny Enterobacteriaceae, natomiast brak zmiany zabarwienia wskazywał na brak zdolności wytwarzania oksydazy cytochromowej, co jest cechą identyfikacyjną pałeczek należących do rodziny Enterobacteriaceae (Szewczyk 2013).

4.2.1. Ustalenie przynależności izolatów do gatunku E. coli

Pałeczki Gram-ujemne, niewytwarzające oksydazy cytochromowej były identyfikowane przy użyciu testu ID 32E w systemie automatycznym ATB (bioMérieux). Do badań używano 24-godzinnych hodowli, prowadzonych w temperaturze 37°C na podłożu stałymColumbia agar z dodatkiem 5% krwi baraniej. Komórki bakteryjne przenoszono do 0,85% NaCl przygotowując zawiesinę o gęstości 0,5 McFarlanda, którą następnie nanoszono do studzienek na pasku identyfikacyjnym ID 32E. Po 24-godzinnej inkubacji w temperaturze 37°C, w warunkach tlenowych, dokonywano odczytu metodą kolorymetryczną w aparacie ATB Expression (bio Merieux). Uzyskane czyste hodowle szczepów E. coli przechowywano w płynnym podłożu TSB (ang. Tryptic Soy Broth, BBL, Becton Dickinson, Sparks, Md.) z dodatkiem 15% glicerolu w temperaturze -80°C.

4.3. Ocena wrażliwości pałeczek E. coli na antybiotyki i chemioterapeutyki oraz występowania mechanizmów oporności

4.3.1. Ocena wrażliwości pałeczek E. coli na antybiotyki i chemioterapeutyki

Badanie wrażliwości na antybiotyki i chemioterapeutyki przeprowadzono metodą

dyfuzyjno-krążkową na podłożu Mueller-Hiton 2 agar (MHA) (bioMérieux) zgodnie z zaleceniem CLSI (ang. Clinical and Laboratory Standards Institute) (2009).Użyto krążków

firmy Argenta Oxoid, które zawierałyantybiotyki z grupy β-laktamów: ampicylinę (10 μg),

47 amoksacylinę z kwasem klawulanowym (20/10 μg), piperacylinę (100 μg), piperacylinę z tazobaktamem (100/10 μg), cefalotynę (30 μg), cefuroksym (30 μg), cefotaksym (30 μg), ceftazydym (30 μg), imipenem (10 μg), meropenem (10 μg), ertapenem (10 μg) i aztreonam (30 μg). Wrażliwość badanych pałeczek oceniano także na antybiotyki z grupy chinolonów - ciprofloksacyna (5 μg), z grupy aminoglikozydów - gentamycyna (10 μg) i amikacyna (30μg) oraz z grupy tetracyklin - tetracyklina (30 μg). W badaniach użyto również trimetoprim z sulfametoksazolem (1,25/23,75μg) z grupy sulfonamidów oraz nitrofurantoinę (300 μg) należącą do nitrofuranonów. W celu weryfikacji uzyskanych wyników jako szczepy wzorcowe zastosowano E. coli ATCC 25922 oraz E. coli ATCC 35218. Wyniki odczytywano mierząc średnicę stref zahamowania wzrostu w świetle przechodzącym wokół krążka nasyconego antybiotykiem; na ich podstawie badane szczepy określano jako wrażliwe, średniowrażliwe lub oporne.

4.3.2. Wykrywanie β-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym typu ESBL

Zdolność pałeczek E. coli do wywarzania β-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym typu ESBL oceniano stosując test dwóch krążków (DDST, ang. Double Disk Synergy Test) (Jarliera i wsp. 1988). Na podłożu Muller-Hintona (bioMérieux), na którym wcześniej rozprowadzono zawiesinę komórkową badanego szczepu o gęstości 0,5 w skali McFarlanda (około 10⁸ CFU/ml), układano krążek zawierający amoksycylinę z kwasem klawulanowym (20 μg + 10 μg). Następnie nanoszono krążki z ceftazydymem (30 µg) i cefotaksymem (30 µg) w odległości 2 cm pomiędzy środkiem tych krążków i środkiem krążka z amoksycyliną z kwasem klawulanowym. Po 16 – 18 godzinach inkubacji w temperaturze 35^oC oceniano kształt strefy zahamowania wzrostu. Wyraźne powiększenie strefy wokół krążka z ceftazydymem lub cefotaksymem od strony krążka zawierającego amoksycylinę z kwasem klawulanowym, świadczyło o wytwarzaniu przez badany izolat β-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL).

Dodatni lub wątpliwy wynik testu dwóch krążków potwierdzano używając krążków z cefotaksymem (30 µg) i cefotaksymem z kwasem klawulanowym (30 μg + 10 μg) oraz ceftazydymem (30 μg) i ceftazydymem z kwasem klawulanowym (30μg + 10μg). Do badania użyto krążków firmy Argenta Oxoid. Wielkości stref zahamowania wzrostu porównywano do stref uzyskanych po zastosowaniu krążków odpowiednio z samym cefotaksymem (30 μg) lub ceftazydymem (30 μg). Średnice stref zahamowania wzrostu wokół krążków zawierających cefotaksym oraz ceftazydym z kwasem klawulanowym większe co najmniej o 5 mm w

48 porównaniu do stref uzyskanych w przypadku krążków bez kwasu klawulanowego, świadczyły o wytwarzaniu przez badane izolaty ESBL (Gniadkowski i wsp. 2009).

Wiarygodność otrzymanych wyników potwierdzano stosując szczep referencyjny Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 wytwarzający ESBL oraz szczep E. coli ATCC 25922 nie wytwarzający enzymów typu ESBL.

4.4. Wykrywanie właściwości hemolitycznych E. coli

Do badań użyto 24-godzinnych hodowli szczepu E. coli w podłożu BHI (ang. Brain Heart Infusion Broth; BBL, Becton Dickinson), które posiewano na podłoże Columbia agar z dodatkiem 5% krwi baraniej w postaci pasków. Hodowlę prowadzono w ciągu 24 godzin w temperaturze 37ºC. Hemolizę odczytywano po 24 godzinnej inkubacji. Obecność strefy całkowitego przejaśnienia podłoża wokół wzrostu świadczyła o wytwarzaniu hemolizyn przez oceniane szczepy (Szewczyk 2013).

4.5. Wykrywanie obecności genów kodujących wybrane czynniki zjadliwości uropatogennych pałeczek E. coli metodą PCR

4.5.1. Izolacja genomowego DNA

Izolację genomowego DNA przeprowadzono zgodnie z instrukcją producenta wykorzystując zestaw Genomic DNA PrepPlus firmy A&A Biotechnology (Gdynia).

Uzyskane genomowe DNA przechowywano w temperaturze 4°C lub w przypadku analiz prowadzonych w odległych terminach w temperaturze -20°C. W poszczególnych reakcjach PCR używano po 2,5 ml preparatu DNA uzyskanego z badanych szczepów.

4.5.2. Startery i zastosowane warunki reakcji PCR

Oligonukleotydy starterowe były syntetyzowane przez firmę DNA Gdańsk, a ich sekwencje i oczekiwane wielkości produktów PCR przedstawiono w Tab. 1. Stosując metodę PCR identyfikowano geny kodującefimbrie typu 1 (fim), typu S(sfa), typu P (pap),adhezynę niefimbrialną (afa), aerobaktynę(aer), hemolizynę HlyA (hly) i cytotoksyczny czynnik nekrotyzujący CNF1 (cnf). Amplifikację fragmentu genu fim przeprowadzono metodą PCR monopleks z użyciem starterów homologicznych do amplifikowanych sekwencji genu fim wg Struve i Krogfelt (1999). W skład mieszaniny reakcyjnej o objętości 25 ml wchodziły: 0,6 U

49 polimerazy REDTAQ Genomic DNA (Sigma-Aldrich, Steinheim, Niemcy), roztwór deoksynukleozydotrifosforanów (dCTP, dGTP, dATP, dTTp) (Fermentas, Wilno, Litwa) o stężeniu 200 mM, bufor reakcyjny dla polimerazy REDTAQ oraz oligonukleotydy starterowe

49 polimerazy REDTAQ Genomic DNA (Sigma-Aldrich, Steinheim, Niemcy), roztwór deoksynukleozydotrifosforanów (dCTP, dGTP, dATP, dTTp) (Fermentas, Wilno, Litwa) o stężeniu 200 mM, bufor reakcyjny dla polimerazy REDTAQ oraz oligonukleotydy starterowe