Aktywność pegylowanych kryptein w testach analgetycznych u myszy

W celu oceny antyopioidowych właściwości pegylowanych kryptein zbadano wpływ zmodyfikowanych peptydów (sekwencji mysich) na nocycepcję i analgetyczne działanie morfiny u myszy.

Badania farmakologiczne pegylowanych peptydów rozpoczęto od oceny wpływu na analgezję morfinową związków podanych dokomorowo (i.c.v.): peptydu NPFF, kryptein - NPSA, NPSS oraz pegylowanych kryptein: NPSA-PEG3000 i NPSS-PEG3000 w teście zanurzenia ogona (tail immersion test). Zbadano również wpływ selektywnego antagonisty receptora NPFF – dipeptydu RF9 na efekty wywołane podaniem w/w peptydów.

Wpływ peptydów wywodzących się z prekursora NPFFA oraz ich pegylowanych odpowiedników podanych dokomorowo na analgezję wywołaną morfiną.

Peptydy w dawkach 10 i 20 nmol (krypteiny) oraz 10 nmol (NPFF i RF9) były podawane dokomorowo (i.c.v.), zgodnie z metodyką opisaną w rozdziale 3.2.3. Wpływ peptydu NPFF, kryptein NPSA i NPSS oraz ich pegylowanych odpowiedników na analgezję wywołaną działaniem morfiny przedstawiają rysunki 4.13 - 4.17. Na podstawie analizy statystycznej z wykorzystaniem testu post hoc Tukey-Kramera stwierdzono, że iniekcja morfiny (3,2 mg/kg, i.p.) wywołuje silną antynocycepcję w 15 i 30 minucie testu.

Peptyd NPFF w dawce 10 nmol (i.c.v.) podany 5 minut przed iniekcją morfiny znacząco obniża aktywność antynocyceptywną morfiny w 15, 30 i 45 minucie testu. RF9 (10 nmol, i.c.v.) podany 5 minut przed peptydem NPFF odwraca natomiast efekt wywołany tym peptydem w 15 i 30 minucie pomiaru (Rysunek 4.14.)

Jak pokazano na Rysunku 4.15, podanie krypteiny NPSA w dawce 10 nmol (i.c.v.), 5 minut przed morfiną, wyraźnie hamowało analgetyczne działanie morfiny w 15, 30 i 45 minucie testu. Dawka 20 nmol (i.c.v.) peptydu wykazała silniejszy efekt antyopioidowy niż dawka 10 nmol (i.c.v.). RF9 (10 nmol, i.c.v.), antagonista receptorów NPFF odwracał antyopiodowe działanie peptydu NPSA w 15, 30 oraz 45 minucie testu.

83 15 30 45 60 75 90 105 120 -10 0 10 20 30 40 50

NPFF 10 nmol (i.c.v.) + Mor (3,2 mg/kg, i.p.)

RF 9 10 nmol (i.c.v.) + NPFF 10 nmol (i.c.v.) + Mor(3,2 mg/kg, i.p.) Saline (i.c.v.) + RF 9 10 nmol (i.c.v.)

Saline (i.c.v.) + Mor (3,2 mg/kg, i.p.) Saline (i.c.v.) + Saline (i.p.)

*** _*** ***

###

### ###

### p<0.001 vsSaline (i.c.v.) + Mor (3,2 mg/kg, i.p.) *** p<0.001 vs Saline (i.c.v.) + Saline (i.p.)

^^ ^{^^^}

^

^ p<0.05 ^^ p<0.01

^^^ p<0.001 vs NPFF 10 nmol (i.c.v.) + Mor (3,2 mg/kg, i.p.)

M P E [ % ]

NaCl 0,9% (i.c.v.) + NaCl 0,9% (i.p.)

NaCl 0,9% (i.c.v.) + morfina (3,2 mg/kg, i.p.) NPFF(10 nmol) (i.c.v.) + morfina (3,2 mg/kg) (i.p.) RF9 (10nmol) (i.c.v.) + NPFF (10 nmol) (i.c.v.) + morfina (3,2 mg/kg) (i.p.) RF9 (10nmol) (i.c.v.) + NaCl 0,9% (i.c.v.)

15 30 45 60 75 90 105 120 -10 0 10 20 30 40 50

Salinel (i.c.v.) + Saline (i.p.) Saline (i.c.v.) + Mor (3,2 mg/kg, i.p.) NPSA 10 nmol (i.c.v.) + Mor (3,2 mg/kg, i.p.) NPSA 20 nmol (i.c.v.) + Mor (3,2 mg/kg, i.p.)

RF 9 10 nmol (i.c.v.) + NPSA 10 nmol (i.c.v.) + Mor (3,2 mg/kg, i.p.)

*** ^***

*** **

^^ ^{^^^}

** p<0.01

*** p<0.001 vs Saline (i.c.v.) + Saline (i.p.)

^^^ p<0.001 vs Saline (i.c.v.) + Mor (3,2 mg/kg, i.p.) ^ p<0.05

^^ p<0.01

## p<0.01 vs NPSA 10 nmol (i.c.v.) + Mor (3,2 mg/kg, i.p.) ^^^ ^^ ^^ ^^^ ^ ^ ## ## ^## % M P E

NaCl 0,9% (i.c.v.) + NaCl 0,9% (i.p.)

NaCl 0,9% (i.c.v.) + morfina (3,2 mg/kg, i.p.) NPSA(10 nmol) (i.c.v.) + morfina (3,2 mg/kg) (i.p.)

NPSA (20 nmol) (i.c.v.) + morfina (3,2 mg/kg) (i.p.) RF9 (10nmol) (i.c.v.) + NPSA (10 nmol) (i.c.v.) + morfina (3,2 mg/kg) (i.p.)

Rysunek 4.14. Wpływ peptydu NPFF (10 nmol, i.c.v.) na analgezję wywołaną podaniem morfiny (3,2 mg/kg,

i.p.) w czasie do 120 min od iniekcji w teście zanurzenia ogona u myszy. Przedstawiono także wpływ RF9 (10 nmol, i.c.v.) na antyopioidowe właściwości peptydu NPFF. Wyniki przedstawiono jako średnia maksymalnego możliwego efektu wyrażonego w procentach (%MPE) ± SEM (N=8-10). Poziom istotności statystycznej: ***P<0,001 względem grupy otrzymującej sól (NaCl 0,9%); ###P<0,001 względem grupy otrzymującej morfinę; ^P<0,05, ^^P<0,01, ^^^P<0,001 względem grupy otrzymującej NPFF i morfinę.

Rysunek 4.15. Wpływ peptydu NPSA (10 i 20 nmol, i.c.v.) na analgezję wywołaną podaniem morfiny (3,2

mg/kg, i.p.) mierzoną w teście zanurzenia ogona u myszy. Wpływ RF9 (10 nmol, i.c.v.) na antyopioidowe właściwości peptydu NPSA. Wyniki przedstawiono jako średnia maksymalnego możliwego efektu wyrażonego w procentach (%MPE) ± SEM (N=8-10). Poziom istotności statystycznej: **P<0,01, ***P<0,001 względem grupy otrzymującej sól (NaCl 0,9%); ^P<0,05, ^^P<0,01, ^^^P<0,001 względem grupy otrzymującej morfinę; ##P<0,01 względem grupy otrzymującej NPSA i morfinę.

Wyniki 84 15 30 45 60 75 90 105 120 -10 0 10 20 30 40 50

Saline (i.c.v.) + Saline (i.p.) Saline (i.c.v.) + Mor (3,2 mg/kg, i.p.)

NPSA-PG 10 nmol (i.c.v.) + Mor (3,2 mg/kg, i.p.) NPSA-PG 20 nmol (i.c.v.) + Mor (3,2 mg/kg, i.p.)

RF 9 10 nmol (i.c.v.) + NPSA-PG 10 nmol (i.c.v.) + Mor (3,2 mg/kg, i.p.)

*** ^*** *** ** # ### # ### ^^^ ^^^ ^^^ ^^^ ^^ _^^ ^^^{^} ** p<0.01

*** p<0.001 vs Saline (i.c.v.) + Saline (i.p.)

^^^ p<0.001 vs Saline (i.c.v.) + Mor (3,2 mg/kg, i.p.) ^ p<0.05

^^ p<0.01 # p<0.05

### p<0.01 vs NPSA-PG 10 nmol (i.c.v.) + Mor (3,2 mg/kg, i.p.)

%

M

P

E

NaCl 0,9% (i.c.v.) + NaCl 0,9% (i.p.)

NaCl 0,9% (i.c.v.) + morfina (3,2 mg/kg, i.p.) NPSA-PEG₃₀₀₀(10 nmol) (i.c.v.) + morfina (3,2 mg/kg) (i.p.)

NPSA-PEG₃₀₀₀ (20 nmol) (i.c.v.) + morfina (3,2 mg/kg) (i.p.) RF9 (10nmol) (i.c.v.) + NPSA-PEG3000(10 nmol) (i.c.v.) + morfina (3,2 mg/kg) (i.p.)

Dwuskładnikowa analiza wariancji (two way ANOVA) wykazała, że pegylowany odpowiednik NPSA – peptyd NPSA-PEG₃₀₀₀ w dawce zarówno 10 jak i 20 nmol (i.c.v.) podany, podobnie jak poprzednie związki, 5 minut przed morfiną również znacząco hamował analgetyczne działanie morfiny w 15, 30 i 45 minucie testu. Dawka 20 nmol (i.c.v.), podobnie jak podczas badania niemodyfikowanej krypteiny, wykazała najsilniejsze działanie antyopioidowe. RF9 (10 nmol, i.c.v.) odwraca efekt działania NPSA-PEG3000 w 15, 30 oraz 45 minucie testu zanurzenia ogona u myszy. Na podstawie analizy statystycznej post hoc Tukey-Kramera można stwierdzić że pegylowany peptyd – NPSA-PEG3000 wykazuje nieznacznie silniejsze antyopioidowe efekty farmakologiczne niż krypteina NPSA i peptyd NPFF (Rysunek 4.16).

Rysunek 4.16. Wpływ peptydu NPSA-PEG₃₀₀₀ (10 i 20 nmol, i.c.v.) na analgezję wywołaną podaniem morfiny (3,2 mg/kg, i.p mierzoną w teście zanurzenia ogona u myszy. Wpływ RF9 (10 nmol, i.c.v.) na antyopioidowe działanie peptydu NPSA-PEG3000. Wyniki przedstawiono jako średnia maksymalnego możliwego efektu wyrażonego w procentach (%MPE) ± SEM (N=8-10). Poziom istotności statystycznej: **P<0,01, ***P<0,001 względem grupy otrzymującej sól (NaCl 0,9%); ^P<0,05, ^^P<0,01, ^^^P<0,001 względem grupy otrzymującej morfinę; #P<0,05, ###P<0,001 względem grupy otrzymującej NPSA-PEG3000 i morfinę.

Krypteina NPSS w dawce zarówno 10 jak i 20 nmol (i.c.v.) wyraźnie hamowała analgetyczne działanie morfiny w 15, 30 i 45 minucie testu. Antagonista receptorów dla NPFF, RF9 (10 nmol, i.c.v.) silnie odwracał antyopioidowe działanie peptydu NPSS w 15, 30 oraz 45 minucie (Rysunek 4.17).

85 15 30 45 60 75 90 105 120 -10 0 10 20 30 40 50

Saline (i.c.v.) + Saline (i.p.) Saline (i.c.v.) + Mor (3,2 mg/kg, i.p.) NPSS 10 nmol (i.c.v.) + Mor (3,2 mg/kg, i.p.) NPSS 20 nmol (i.c.v.) + Mor (3,2 mg/kg, i.p.)

RF 9 10 nmol (i.c.v.) + NPSS 10 nmol (i.c.v.) + Mor (3,2 mg/kg, i.p.)

*** _***

***

*** p<0.001 vs Saline (i.c.v.) + Saline (i.p.)

### ### _#

### ###

^^

^^

^^

### p<0.001 vs Saline (i.c.v.) + Mor (3,2 mg/kg, i.p.)

^^^ p<0.001 vs NPSS 10 nmol (i.c.v.) + Mor (3,2 mg/kg, i.p.) ## p<0.01 ## ^ ^ _^^ # p<0.05 ^ p<0.05 ^^ p<0.01 M P E [ % ]

NaCl 0,9% (i.c.v.) + NaCl 0,9% (i.p.)

NaCl 0,9% (i.c.v.) + morfina (3,2 mg/kg, i.p.) NPSS(10 nmol) (i.c.v.) + morfina (3,2 mg/kg) (i.p.)

NPSS (20 nmol) (i.c.v.) + morfina (3,2 mg/kg) (i.p.) RF9 (10nmol) (i.c.v.) + NPSS (10 nmol) (i.c.v.) + morfina (3,2 mg/kg) (i.p.)

Rysunek 4.17. Wpływ peptydu NPSS (10 i 20 nmol, i.c.v.) na analgezję wywołaną podaniem morfiny (3,2

mg/kg, pmierzoną w teście zanurzenia ogona u myszy. Wpływ RF9 (10 nmol, i.c.v.) na antyopioidowe właściwości peptydu NPSS. Wyniki przedstawiono jako średnia maksymalnego możliwego efektu wyrażonego w procentach (%MPE) ± SEM (N=8-10). Poziom istotności statystycznej: ***P<0,001 względem grupy otrzymującej sól (NaCl 0,9%); #P<0,05, ##P<0,01, ###P<0,001 względem grupy otrzymującej morfinę; ^P<0,05, ^^P<0,01, ^^^P<0,001 względem grupy otrzymującej NPSS i morfinę.

Peptyd NPSS-PEG3000 nieznacznie w dawce 10 nmol (i.c.v.), oraz wyraźnie w dawce 20 nmol (i.c.v.) hamował antynocyceptywne działanie morfiny w 15, 30, 45, oraz 60 minucie testu. RF9 (10 nmol, i.c.v.) podany 5 minut przed pegylowanym peptydem (10 nmol, i.c.v.) silnie odwracał jego antyopioidowe działanie. Przeprowadzone badania wykazały, że pegylowany NPSS wywołuje podobny efekt na działanie morfiny jak niezmodyfikowany peptyd NPSS. Jednakże czas, w którym obserwuje się opisane efekty farmakologiczne w przypadku pegylowanej krypteiny jest nieznacznie dłuższy (Rysunek 4.18).

Stwierdzono również, że sam peptyd NPFF (10 nmol) oraz NPSA i NPSS (10 i 20 nmol), jak również pegylowane odpowiedniki kryptein – peptydy NPSA-PEG3000 oraz NPSS-PEG3000 (zarówno 10 jak i 20 nmol) nie mają aktywności nocyceptywnej w teście zanurzenia ogona u myszy w porównaniu do grupy, której podano sól fizjologiczną (dane nie zamieszczone). Przeprowadzone badania wykazują, że pegylowane krypteiny: NPSA-PEG₃₀₀₀ oraz NPSS-PEG₃₀₀₀ wywołują podobne antyopioidowe efekt na działanie morfiny jak niemodyfikowane peptydy. Jednakże czas, w którym obserwuje się opisane efekty farmakologiczne, zwłaszcza w przypadku pegylowanej krypteiny NPSS jest dłuższy.

Wyniki 86 15 30 45 60 75 90 105 120 -10 0 10 20 30 40

50 Saline (i.c.v.) + Saline (i.c.v.) Saline (i.c.v.) + Mor (3,2 mg/kg, i.p.)

NPSS-PG 10 nmol (i.c.v.) + Mor (3,2 mg/kg, i.p.) NPSS-PG 20 nmol (i.c.v.) + Mor (3,2 mg/kg, i.p.)

RF 9 10 nmol (i.c.v.) + NPSS-PG 10 nmol (i.c.v.) + Mor (3,2 mg/kg, i.p.) ***

***

***

*** p<0.001 vs Saline (i.c.v.) + Saline (i.p.)

### p<0.001 vs Saline (i.c.v.) + Mor (3,2 mg/kg, i.p.)

^^^ p<0.001 vs NPSS-PG 10 nmol (i.c.v.) + Mor (3,2 mg/kg, i.p.) ## p<0.01 # p<0.05 ^ p<0.05 ^^ p<0.01 # ## ### # ## # ^^^ ^^^ ^ # # _# ^^ M P E [ % ]

NaCl 0,9% (i.c.v.) + NaCl 0,9% (i.p.)

NaCl 0,9% (i.c.v.) + morfina (3,2 mg/kg, i.p.) NPSS-PEG₃₀₀₀(10 nmol) (i.c.v.) + morfina (3,2 mg/kg) (i.p.)

NPSS-PEG₃₀₀₀ (20 nmol) (i.c.v.) + morfina (3,2 mg/kg) (i.p.) RF9 (10nmol) (i.c.v.) + NPSS-PEG₃₀₀₀(10 nmol) (i.c.v.) + morfina (3,2 mg/kg) (i.p.)

Rysunek 4.18. Wpływ peptydu NPSS-PEG₃₀₀₀ (10 i 20 nmol, i.c.v.) na analgezję wywołaną podaniem morfiny (3,2 mg/kg, i.p.) mierzoną w teście zanurzenia ogona u myszy. Wpływ RF9 (10 nmol, i.c.v.) na antyopioidowe właściwości peptydu NPSS-PEG3000. Wyniki przedstawiono jako średnia maksymalnego możliwego efektu wyrażonego w procentach (%MPE) ± SEM (N=8-10). Poziom istotności statystycznej: ***P<0,001 względem grupy otrzymującej sól (NaCl 0,9%); #P<0,05, ##P<0,01, ###P<0,001 względem grupy otrzymującej morfinę; ^P<0,05, ^^P<0,01, ^^^P<0,001 względem grupy otrzymującej NPSS-PEG3000 i morfinę.

Wpływ peptydu NPSS oraz jego pegylowanego odpowiednika – NPSS-PEG₃₀₀₀ podanych obwodowo na analgezję wywołaną morfiną.

Jedną z wielu zalet modyfikacji związków aktywnych biologicznie przez glikole polietylenowe jest możliwość przekroczenia bariery krew – mózg [Chen, 1981]. W niniejszej pracy zbadano także wpływ peptydu NPSS oraz NPSS-PEG3000 na analgezję morfinową po podaniu obwodowym (i.p.) tych peptydów.

W tej serii eksperymentów badano krypteinę NPSS oraz jej pegylowany odpowiednik NPSS-PEG3000, biorąc pod uwagę efekty obserwowane po dokomorowym podaniu tych peptydów. Dawki kryptein oraz RF9 dobrano na podstawie wcześniejszych publikacji i badań [Silbert, 1991; Elhabazi, 2012]. Antagonista receptorów NPFF – RF9 był podawany zarówno dokomorowo (i.c.v.) jak i obwodowo (i.p.).

Jak pokazano na rysunku 4.19, peptyd NPSS w dawce 12 μmol/kg (i.p.) wykazuje wyraźny antyopioidowy wpływ na analgezję wywołaną podaniem morfiny. Analiza dwuskładnikowa wariancji (two way ANOVA) wykazała istotne różnice między grupami zwierząt F(4, 399)=25.69 P<0.0001 oraz czasem obserwacji F(6, 399)=18.01 P<0.0001. Test

post hoc Tukey-Kramera wykazał, że peptyd NPSS podany obwodowo wyraźnie hamował

aktywność antynocyceptywną morfiny w 15, 30, 45 i 60 minucie pomiaru. Antagonista receptorów dla NPFF, dipeptyd RF9 podany 5 minut przed krypteiną NPSS, zarówno

87 15 30 45 60 75 90 105 120 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60

sól (i.c.v.) + sól (i.p.) + sól (i.p.)

sól (i.c.v.) + morfina (3,2 mg/kg, i.p.) + sól (i.p.)

sól (i.c.v.) + NPSS 12mol/kg (i.p.) + morfina (3,2 mg/kg, i.p.) RF 9 (10 nmol, i.c.v.) + NPSS 12m/kg (i.p.) + morfina (3,2 mg/kg, i.p.)

M P E [ % ] * *** ^*** *** ^^^ ^^^ ^^ ### ### # ## ## * p < 0.05

*** p < 0.001 vs sól (i.c.v.) + sól (i.p.) + sól (i.p.) ^ p < 0.05

^^ p < 0.01

^^^ p < 0.001 vs sól (i.c.v.) + morfina (3,2 mg/kg, i.p.) + sól (i.p.) # p < 0.05

### p < 0.001 vs NPSS 12m/kg (i.p.) + morfina (3,2 mg/kg, i.p.) ## p < 0.01

RF 9 (10 nmol, i.p.) + NPSS 12m/kg (i.p.) + morfina (3,2 mg/kg, i.p.)

^^^

^ ###

# ^# #

#

NaCl 0,9% (i.c.v.) + NaCl 0,9% (i.p.) + NaCl 0,9% (i.p.)

NaCl 0,9% (i.c.v.) + morfina (3,2 mg/kg, i.p.) + NaCl 0,9% (i.p.) NaCl 0,9% (i.c.v.) + NPSS (12 umol/kg) (i.p.) + morfina (3,2 mg/kg) (i.p.)

RF9 (10 nmol) (i.c.v.) + NPSS (12 umol/kg) (i.p.) morfina (3,2 mg/kg) (i.p.) RF9 (1,65 umol/kg) (i.p.) + NPSS (12 umol/kg) (i.p.) + morfina (3,2 mg/kg) (i.p.)

dokomorowo (i.c.v. w dawce 10 nmol) jak i obwodowo (i.p. w dawce 1,65 μmol/kg) odwracał antyopioidowe działanie krypteiny w 15, 30, 45 i 60 minucie pomiaru, przy czym silniejsze efekty obserwuje się po podaniu dokomorowym (i.c.v.).

Peptyd NPSS-PEG3000 w dawce 12 μmol/kg (i.p.) silnie hamował analgetyczne działanie morfiny w 15, 30, 45 i 60 minucie testu. RF9 odwracał działanie NPSS-PEG3000, które w przypadku podania obwodowego (1,65 μmol/kg, i.p.) utrzymuje się na stałym poziomie w czasie 15, 30, 45 i 60 minut. Dwuczynnikowa analiza wariancji wykazała różnice między grupami zwierząt F(4, 430)=22.72P<0.0001 i czasem obserwacji F(6, 430)=13.41 P<0.0001 (Rysunek 4.20).

Stwierdzono również, że sam peptyd NPSS (12 μmol/kg, i.p), NPSS-PEG3000 (12 μmol/kg, i.p.) oraz RF9 (zarówno 10 nmol, i.c.v. jak i 1,65 μmol/kg i.p.) nie ma wpływu na czas latencji zwierząt mierzony w teście zanurzenia ogona u myszy, w porównaniu do grupy kontrolnej, której podano sól fizjologiczną. Analiza dwuskładnikowa wariancji wykazała brak różnicy między grupami zwierząt F(4, 189)=0.62 P=0.6466 oraz czasem obserwacji F(6, 189)=1.13 P=0.3490) (dane nie zamieszczone).

Rysunek 4.19. Wpływ peptydu NPSS (12 umol/kg, i.p.) na analgezję wywołaną podaniem morfiny (3,2 mg/kg,

i.p.) mierzoną w teście zanurzenia ogona u myszy. Wpływ RF9 (10 nmol, i.c.v. oraz 1,65 umol/kg i.p.) na antyopioidowe właściwości peptydu NPSS podanego obwodowo. Wyniki przedstawiono jako średnia maksymalnego możliwego efektu wyrażonego w procentach (%MPE) ± SEM (N=8-10). Poziom istotności statystycznej: *P<0,05, ***P<0,001 względem grupy otrzymującej sól (NaCl 0,9%); ^P<0,05, ^^P<0,01, ^^^P<0,001 względem grupy otrzymującej morfinę; #P<0,05, ##P<0,01, ###P<0,001 względem grupy otrzymującej NPSS i morfinę.

Wyniki 88 15 30 45 60 75 90 105 120 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60

sól (i.c.v.) + sól (i.p.) + sól (i.p.)

sól (i.c.v.) + morfina (3,2 mg/kg, i.p.) + sól (i.p.)

sól (i.c.v.) + PEG-NPSS 12mol/kg (i.p.) + morfina (3,2 mg/kg, i.p.)

RF 9 10 nmol (10 nmol, i.c.v.) + PEG-NPSS 12mol/kg (i.p.) + morfina (3,2 mg/kg, i.p.)

M P E [ % ] * *** *** *** * p < 0.05

*** p < 0.001 vs sól (i.c.v.) + sól (i.p.) + sól (i.p.) ^^ p < 0.01

^^^ p < 0.001 vs sól (i.c.v.) + morfina (3,2 mg/kg, i.p.) + sól (i.p.) ### p < 0.001 vs PEG-NPSS 12m/kg (i.p.) + morfina (3,2 mg/kg, i.p.)

## p < 0.01 ^^^ ^^ ^^^ ^^^ _^^ ### ## ## ^## ## ## ^### ## ### ###

RF 9 10 nmol (10 nmol, i.p.) + PEG-NPSS 12mol/kg (i.p.) + morfina (3,2 mg/kg, i.p.) NaCl 0,9% (i.c.v.) + NaCl 0,9% (i.p.) + NaCl 0,9% (i.p.)

NaCl 0,9% (i.c.v.) + morfina (3,2 mg/kg, i.p.) + NaCl 0,9% (i.p.) NaCl 0,9% (i.c.v.) + NPSS-PEG3000 (12 umol/kg) (i.p.) + morfina (3,2 mg/kg) (i.p.)

RF9 (10 nmol) (i.c.v.) + NPSS-PEG₃₀₀₀(12 umol/kg) (i.p.) morfina (3,2 mg/kg) (i.p.) RF9 (1,65 umol/kg) (i.p.) + NPSS-PEG₃₀₀₀ (12 umol/kg) (i.p.) + morfina (3,2 mg/kg) (i.p.)

Rysunek 4.20.Wpływ peptydu NPSS-PEG3000 (12 umol/kg, i.p.) na analgezję wywołaną podaniem morfiny (3,2 mg/kg, i.p.) w teście zanurzenia ogona u myszy. Wpływ RF9 (10 nmol, i.c.v. oraz 1,65 umol/kg i.p.) na antyopioidowe właściwości peptydu NPSS-PEG3000 podanego obwodowo. Wyniki przedstawiono jako średnia maksymalnego możliwego efektu wyrażonego w procentach (%MPE) ± SEM (N=8-10). Poziom istotności statystycznej: *P<0,05, ***P<0,001 względem grupy otrzymującej sól (NaCl 0,9%); ^^P<0,01, ^^^P<0,001 względem grupy otrzymującej morfinę; ##P<0,01, ###P<0,001 względem grupy otrzymującej NPSS-PEG3000 i morfinę.

W badaniach wykazano więc istotny wpływ peptydu NPSS oraz jego pegylowanego odpowiednika – NPSS-PEG3000 podanych obwodowo na hamowanie analgezji wywołanej działaniem morfiny. Dipeptyd RF9, podany zarówno dokomorowo jak i obwodowo, odwraca antyopioidowe właściwości pegylowanej krypteiny, przy czym lepsze efekty uzyskano w wyniku podania dokomorowego (i.c.v.). Czas, w którym RF9 odwracał działanie peptydu (zarówno dokomorowo jak i obwodowo) jest jednak nieco krótszy niż dla koniugatu peptydu z polimerem (por. Rys. 4.18 i 4.19).

89