Index of /rozprawy2/10604

Pełen tekst

(1)Akademia Górniczo-Hutnicza im. Stanisława Staszica w Krakowie Wydział Inżynierii Materiałowej i Ceramiki Katedra Biochemii i Neurobiologii. Magdalena Niedziółka Modyfikacje chemiczne i aktywność farmakologiczna neuropeptydów o nowych właściwościach biologicznych. Praca doktorska. Promotor: Prof. dr hab. Jerzy Silberring. Kraków, 2013.

(2) Pracę dedykuję moim córkom: Amelii i Helenie.

(3) Składam serdeczne podziękowania: Prof. dr hab. Jerzemu Silberringowi, promotorowi tej pracy, za umożliwienie prowadzenia ciekawych badań pod swoim kierunkiem, wszechstronną pomoc w trakcie prowadzenia eksperymentów oraz pisania tej pracy, za cenne wskazówki, zaufanie, cierpliwość i wyrozumiałość, Prof. dr hab. Jolancie Kotlińskiej za okazaną życzliwość, za umożliwienie prowadzenia badań farmakologicznych pod swoim kierunkiem jak również pomoc w trakcie ich wykonywania i interpretacji wyników, Mgr Ewie Gibuła-Bruzda za pomoc podczas wykonywania badań farmakologicznych oraz opracowywania wyników, Obecnym i byłym członkom Katedry Biochemii i Neurobiologii: Piotrowi Suderowi, Ani Drabik, Ani Bodzoń-Kułakowskiej, Dorocie Potępskiej, Przemkowi Mielczarkowi, Markowi Smoluchowi, Filipowi Sucharskiemu, Agnieszce Kraj, Markowi Nodze, Adamowi Moszczyńskiemu, Asi Ner za stworzenie miłej i rodzinnej atmosfery w pracy, nieocenioną pomoc i stymulujące dyskusje Oraz Mateuszowi, Rodzicom i Teściowej za wsparcie.. Przedstawione badania zostały częściowo sfinansowane z grantu Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego N N204 304837..

(4) SPIS TREŚCI WYKAZ SKRÓTÓW ........................................................................................................................................... 6 1. WSTĘP ............................................................................................................................................................. 8 1.1. BÓL I JEGO EFEKTYWNE LECZENIE ........................................................................................ 8 1.1.1. Morfina – przedstawiciel leków opioidowych.......................................................................... 8 1.1.2. Neuronalny i molekularny mechanizm działania opioidów ................................................... 10 1.1.3. Endogenne opioidy wywodzące się z OUN ........................................................................... 12 1.2. SYSTEM NPFF .............................................................................................................................. 14 1.2.1. Peptyd NPFF – budowa, funkcje ............................................................................................ 14 1.2.2. Budowa receptorów NPFF1 i NPFF2 ..................................................................................... 17 1.2.3. Agoniści i antagoniści receptorów NPFF1 I NPFF2 .............................................................. 18 1.2.4. Modulacyjna rola systemu NPFF na poziomie komórkowym ............................................... 21 1.2.5. Modulacyjna rola systemu NPFF w mechanizmie bólu ......................................................... 22 1.3. KRYPTEINY .................................................................................................................................. 24 1.3.1. Nowe krypteiny wywodzące się z prekursora NPFFA ............................................................ 25 1.3.2. Funkcja kryptein prekursora NPFFA...................................................................................... 26 1.4. PEGYLACJA .................................................................................................................................. 28 1.4.1. Bariera krew-mózg ................................................................................................................. 28 1.4.2. Budowa oraz właściwości koniugatów PEG-peptyd. ............................................................. 29 1.4.3. Funkcje oraz zastosowania pegylowanych białek i peptydów................................................ 31 2. CELE PRACY ................................................................................................................................................34 3. CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA ..................................................................................................................35 3.1. SYNTEZA PEPTYDÓW I BADANIA BIOCHEMICZNE ........................................................... 36 3.1.1. Synteza peptydów................................................................................................................... 36 3.1.2. Test chloranilowy, test Kaisera .............................................................................................. 39 3.1.3. Oczyszczanie peptydów ......................................................................................................... 39 3.1.4. Analiza peptydów za pomocą spektrometrii mas ................................................................... 40 3.1.5. Metabolizm krypteiny NPNA w homogenacie kory mózgowej ............................................. 40 3.1.6. Identyfikowanie produktów trawienia peptydu za pomocą spektrometrii mas ...................... 41 3.1.7. Izolowanie enzymów biorących udział w degradacji krypteiny ............................................. 41 3.1.8. Reakcja peptydów oraz koniugatów peptyd - polimer z frakcjami po rozdziale homogenatu .. ................................................................................................................................................ 42 3.1.9. Identyfikacja enzymów homogenatu kory mózgowej za pomocą inhibitorów różnych klas proteaz oraz jonów metali ....................................................................................................................... 42 3.1.11. Przygotowanie map peptydowych ..................................................................................... 44 3.1.12. Analiza nanoLC-MS/MS ................................................................................................... 45 3.1.13. Identyfikacja enzymów w bazie danych ............................................................................ 46 3.2. BADANIA FARMAKOLOGICZNE .............................................................................................. 47 3.2.1. Zwierzęta ................................................................................................................................ 47 3.2.2. Substancje używane do badań ................................................................................................ 47 3.2.3. Podania dokomorowe ............................................................................................................. 47 3.2.4. Podania dootrzewnowe ........................................................................................................... 48 3.2.5. Test zanurzenia ogona ............................................................................................................ 48 3.2.6. Metoda oceny działania antyopioidowego w testach termicznych ......................................... 49 3.2.7. Analiza statystyczna otrzymanych wyników .......................................................................... 49 3.2.8. Produkty wyjściowe i odczynniki ........................................................................................... 49 4. WYNIKI ..........................................................................................................................................................52 4.1. KRYPTEINY WYWODZĄCE SIĘ Z PREKURSORA NPFFA ..................................................... 52 4.1.1. Synteza peptydów................................................................................................................... 52 4.1.2. Metabolizm krypteiny NPNA w homogenacie kory mózgowej ............................................. 52 4.1.3. Izolowanie enzymów metabolizujących peptyd NPNA ......................................................... 57 4.1.4. Identyfikowanie enzymów metabolizujących peptyd NPNA ................................................. 61 4.1.4.1. Charakterystyka enzymów za pomocą inhibitorów proteaz oraz jonów metali ............. 61 4.1.4.2. Rozdział białek metodą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym ................................ 63. 4.

(5) 4.2. PEGYLOWANE KRYPTEINY PREKURSORA NPFFA .............................................................. 78 4.2.1. Synteza peptydów................................................................................................................... 78 4.2.2. Metabolizm pegylowanych kryptein in vitro .......................................................................... 79 4.2.3. Aktywność pegylowanych kryptein w testach analgetycznych u myszy................................ 82 5. DYSKUSJA .....................................................................................................................................................89 6. WNIOSKI .......................................................................................................................................................99 STRESZCZENIE .............................................................................................................................................. 100 ABSTRACT ....................................................................................................................................................... 102 LITERATURA .................................................................................................................................................. 103 ZAŁĄCZNIK nr 1 ............................................................................................................................................ 115. 5.

(6) WYKAZ SKRÓTÓW ACN ANOVA ATP BBB BLMH BOC cAMP CART. acetonitryl test analizy wariancji (ang. adenosine triphosphate) adenozynotrifosforan (ang. blood-brain barier-BBB) bariera krew-mózg hydrolaza bleomycyny grupa t-butoksykarbonylowa cykliczny adenozynomonofosforan (ang. cocaine and amphetamine-regulated transcript) – transkrypt regulowany przez kokainę i amfetaminę CBB (ang. Coomassie Brilliant Blue) cDNA komplementarny DNA CID (ang. collision induced dissociation) cFos gen wczesnej odpowiedzi komórkowej CREB (ang. cyclic adenosine monophosphate response-element binding protein) czynnik transkrypcyjny aktywowany na drodze fosforylacji katalizowanej przez kinazę białkową A DCM dichlorometan DIC diizopropylokarbodiimid DIPEA diizopropyloetyloamina DMF N,N – dimetyloformamid DOP receptor opioidowy δ DPDPE [D-Pen2, D-Pen5]-enkefalina DPPII peptydaza dipeptydylowa II DPPIII peptydaza dipeptydylowa III DTT ditiotreitol EC (ang. EC Enzyme Commision Numbe) numer identyfikacji enzymów EDTA kwas etylenodiaminotetraoctowy EIC (ang. extracted ion chromatogram) ESI electrospray FMRFAL prekursor amidowanego peptydu FMRF Fmoc grupa 9-fluorenylometoksykarbonylowa GABA kwas γ-aminomasłowy HOBt 1-hydroksybenzotriazol HPLC (ang. high-performance liquid chromatography) – wysokosprawna chromatografia cieczowa i.c.v. (ang. intracerebroventricular) – podanie dokomorowe i.p. (ang. intraperitoneal) – podanie dootrzewnowe KOP receptor opioidowy κ LC (ang. Liquid Chromatography) – chromatografia cieczowa MOP receptor opioidowy μ MPE maksymalny możliwy efekt terapeutyczny MS (ang. Mass Spectrometry) – spektromertia mas mRNA matrycowy kwas rybonukleinowy m/z stosunek masy do ładunku NAcc (ang. nucleus accumbens) jądro półleżące przegrody nanoLC-MS/MS (ang. Nano Liquid Chromatography Mass Spectrometry) kapilarna chromatografia cieczowa w połączeniu z tandemową spektrometrią mas N/OFQ nocyceptyna (orfanina) NOP receptor nocyceptyny NMP 1-metylo-2-pirolidon NPFF neuropeptyd FF OUN ośrodkowy układ nerwowy PEG glikol polietylenowy PFC (ang. prefrontal cortex) kora przedczołowa PHMB benzoesan p-hydroksyrtęciowy PMSF fluorek fenylometylosulfonowy PSA cytozolowa aminopeptydaza alanylowa (aminopeptydaza wrażliwa na puromycynę). 6.

(7) RP R-SAT SDS SDS-PAGE SEM TBTU tBu TFA TGS TMBS TOP Tris-HCl Trt VTA. układ odwróconych faz (ang. Reversed Phase) (ang. Receptor Selection and Amplification Technology) funkcjonalny test komórkowy dodecylosiarczan sodu (ang. sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) elektroforeza w żelu poliakrylamidowym w obecności SDS błąd standardowy średniej tetrafluoroboran N-tlenku N-(1H-benzotriazolo-1-yl-dimetylaminometyleno)-Nmetylometanoamonu grupa tert-butylowa kwas trifluorooctowy (ang. Tris-Glycine-SDS) bromotrimetylosilan oligopeptydaza thimet bufor 2-amino-3-(hydroksymetylo)-1,3-propanodiol pH 7,5 grupa tritylowa (ang. ventral tegmental area) pole brzuszne nakrywki. Skróty reszt aminokwasowych: Nazwa. Skrót trzyliterowy. Skrót jednoliterowy. Alanina Cysteina Kwas asparaginowy Kwas glutaminowy Fenyloalanina Glicyna Histydyna Izoleucyna Lizyna Leucyna Metionina Asparagina Prolina Glutamina Arginina Seryna Treonina Walina Tryptofan Tyrozyna. Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Pro Gln Arg Ser Thr Val Trp Tyr. A C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Y. 7.

(8) Wstęp. 1. WSTĘP 1.1.. BÓL I JEGO EFEKTYWNE LECZENIE. Ból jest odbierany jako nieprzyjemne doświadczenie zmysłowe lub emocjonalne, spowodowane rzeczywistym lub potencjalnym uszkodzeniem tkanek. Jest to odczucie subiektywne, integrowane na poziomie kory mózgowej. Ból często zwiastuje chorobę i jej towarzyszy. Jest również sygnałem informacyjno – fizjologicznym, ostrzeżeniem przed uszkodzeniem tkanek. Szczególnie uciążliwym rodzajem bólu jest ból przewlekły, towarzyszący osobom starszym na skutek chorób układu ruchowego, oraz pacjentom ze zdiagnozowanymi chorobami nowotworowymi. Problem ten jest szeroko rozpowszechniony - szacuje się, że w Polsce z powodu bólu nowotworowego cierpi 50 tysięcy pacjentów. Ból przewlekły prowadzi do stopniowej eliminacji przejawów aktywności społecznej, ponieważ chory koncentruje swe myśli wyłącznie na bólu. W farmakoterapii bólu przewlekłego od kilkunastu lat stosowana jest tzw. drabina analgetyczna (przeciwbólowa) Światowej Organizacji Zdrowia (WHO). Dzieli ona stosowane powszechnie leki przeciwbólowe na trzy grupy, w zależności od nasilenia odczuwanego bólu: analgetyki nieopioidowe, słabe opioidy i silne opioidy. Właściwie stosowany schemat drabiny analgetycznej pozwala na skuteczne leczenie bólu u ok. 90% chorych. Leczeniem bólu zajmuje się coraz więcej wyspecjalizowanych ośrodków, jakimi są poradnie leczenia bólu i ośrodki opieki paliatywnej. Nadrzędnym zadaniem prawidłowej farmakoterapii jest skuteczne opanowanie bólu, przy jak najmniejszych działaniach niepożądanych i z uwzględnieniem możliwych interakcji lekowych. Konieczne jest zatem zapoznanie się z mechanizmami działania, farmakokinetyką, postaciami leków, ich dawkowaniem oraz działaniami niepożądanymi i interakcjami poszczególnych preparatów [Smith, 2013; Koob, 2006; Weisner, 2009 ; Ballantyne, 2008].. 1.1.1. Morfina – przedstawiciel leków opioidowych Leki opioidowe należą do najsilniejszych i najbardziej skutecznych dostępnych analgetyków. Obecnie stosowanymi najczęściej lekami na trzecim stopniu drabiny analgetycznej są: morfina, buprenorfina i metadon. Leki te budzą jednak liczne obawy przed wystąpieniem objawów niepożądanych: głównie tolerancji (czyli konieczności przyjmowania coraz większych dawek leku w celu uzyskania podobnego efektu przeciwbólowego) i uzależnienia psychicznego. Właściwe leczenie stanowi wyzwanie dla współczesnej medycyny. 8.

(9) Wstęp. i prowadzi w wielu przypadkach do poprawienia jakości życia chorych, poprzez uniknięcie niepotrzebnego cierpienia oraz konsekwencji psychosomatycznych. Zastosowanie kliniczne opioidów obejmuje również działanie przeciwkaszlowe, hamujące perystaltykę, oraz zmniejszające ciśnienie w krążeniu płucnym. Opioidy stosowane są w zawale, a czasami wykorzystuje się również ich depresyjny wpływ na ośrodek oddechowy. Związki te podane w dawkach wywołujących analgezję powodują obniżenie temperatury ciała i zwężenie źrenic. Opioidy redukują przedoperacyjny ból i niepokój, powodują obniżenie dawki wziewnych środków znieczulających dzięki działaniu synergicznemu z innymi anestetykami, oraz zapewniają natychmiastową analgezję pooperacyjną, również tę kontrolowaną przez pacjenta. Jednak główne ich zastosowanie to uśmierzenie przewlekłego bólu nowotworowego, oraz leczenie ciężkich stanów pourazowych [Koob, 2006]. Jednym z przedstawicieli leków opioidowych jest morfina. Jest to główny, aktywny składnik opium, pochodzący z makówki maku lekarskiego (Papaver somniferum). Morfina została wyodrębniona w 1881 roku, ale dopiero 164 lata później, w 1968 roku badania rentgenograficzne potwierdziły strukturę tego alkaloidu. Modyfikacje peryferyjnych grup funkcyjnych morfiny doprowadziły do powstania szeregu analogów, spośród których najbardziej znanymi są: kodeina (eter metylowy morfiny) i heroina (diacetylowa pochodna morfiny) [Patrick, 2003].. HO. O H. H N. CH3. HO Rysunek 1.1. Struktura chemiczna morfiny oraz jej źródło – Papaver somniferum. Morfina wiąże się preferencyjnie z receptorem μ, jednym ze znanych receptorów opioidowych: μ (MOP), κ (KOP), δ (DOP) i nocyceptyny (NOP). Należą one do grupy receptorów metabotropowych, sprzężonych z białkami G. Aktywowanie receptorów opioidowych prowadzi do zahamowania aktywności cyklazy adenylanowej, zwiększenia przepuszczalności kanałów potasowych oraz zmniejszenia przepuszczalności kanałów wapniowych. Morfina wywołuje również zmiany w stężeniu wewnątrzkomórkowego 9.

(10) Wstęp. cyklicznego adenozynomono-fosforanu (cAMP), powodując tym. samym. obniżenie. aktywności komórek [Contet, 2004]. W latach 80-tych wykazano obecność podtypów receptora μ, a mianowicie μ1 i μ2, przy czym omawiany alkaloid wiąże się z wysokim powinowactwem do receptorów μ1. Największe zagęszczenie podtypu μ1 receptora opioidowego występuje w korze czołowej i w rdzeniu kręgowym [Matthes, 1996]. Badania wykazały, że receptor μ1 jest zaangażowany we wzmocnienie pozytywne wywołane działaniem morfiny. Wiele białek obecnych w strukturach mózgowych pod wpływem morfiny ulega deregulacji (zarówno down- jak i up-regulacji), m.in. białka sygnałowe czy metaboliczne. Na określenie wszystkich białek, których ekspresja zmienia się pod wpływem morfiny używa się terminu – morfinom. Deregulacja białek wywołana podawaniem morfiny prowadzi do patofizjologii. Białka te mogą stanowić swoisty marker służący identyfikacji i leczeniu osób uzależnionych [Bierczynska-Krzysik, 2006; Bodzon-Kulakowska, 2011].. 1.1.2. Neuronalny i molekularny mechanizm działania opioidów Długotrwałe podawanie morfiny i innych opioidów wywołuje szybki rozwój tolerancji i szereg zmian adaptacyjnych. Związki te, poprzez działanie pozytywnie wzmacniające (czyli działanie nagradzające), indukują proces, związany z układem nagrody. Układ ten jest systemem oceniającym, pozwalającym na odczuwanie przyjemności i kary. Odpowiada również za wszystkie zasadnicze zachowania człowieka: pobieranie pokarmu, wody, aktywność seksualną, oraz agresję [Vetulani, 2001]. Układ nagrody zbudowany jest z takich struktur jak: pole brzuszne nakrywki (ang. ventral tegmental area- VTA), jądro półleżące przegrody (ang. nucleus accumbens – NAcc), kora przedczołowa (ang. prefrontal cortex - PFC) oraz jądro migdałowate (ang. amygdala). W pobudzeniu tego układu biorą udział aminy katecholowe – dopamina oraz serotonina. Opioidy wywołują bezpośredni wzrost wydzielania dopaminy w NAcc, oraz oddziałują na neurony dopaminergiczne znajdujące się w VTA. Jądra półleżące przegrody (NAcc) są miejscem strategicznym do otrzymywania informacji ze wszystkich struktur układu limbicznego, a następnie są przekształcane w impuls motywacyjny dzięki ich powiązaniu z układem pozapiramidowym. [Koob, 2008a] (Rysunek 1.2).. 10.

(11) Wstęp. Kora przedczołowa Prążkowie. NAcc Jądro VTA migdałowate Hipokamp. Rysunek 1.2. Budowa układu nagrody (na podstawie www.psychology4a.com/addiction). Wzmocnienie pozytywne angażuje też inne neuromodulatory i neuroprzekaźniki, takie jak: peptydy opioidowe, kwas γ-aminomasłowy (GABA), oraz endokanabinoidy, które prawdopodobnie biorą udział w serii niezależnych procesów aktywujących mezolimbiczny układ dopaminowy [Nestler 2005]. Do aktywacji receptorów opioidowych dochodzi w NAcc, co prowadzi do uwolnienia dopaminy, a także niezależnie od dopaminy, w VTA [Koob, 2008a]. Po odstawieniu opioidów pojawia się zespół abstynencyjny wywołujący niepokój, nudności, bóle kości, mięśni i stawów. Związane jest to z deregulacją układu nagrody, jak również wynika z powiązania tego systemu z układem stresu i awersji. Chroniczne podawanie związków psychoaktywnych doprowadza do zaburzeń w układzie podwzgórze–przysadkanadnercza, co prowadzi do zachowań depresyjnych. Związki te pobudzają również wydzielanie hormonu uwalniającego kortykotropinę (ang. corticotropin-releasing hormone, CRH), wywołując tym samym stany lękowe. Zespół ostrego odstawienia narkotyków związany jest również ze wzrostem wydzielania noradrenaliny w jądrach łożyskowych prążka krańcowego (ang. bed nucleus of the stria terminalis) i obniżeniem poziomu neuropeptydu Y w centralnych i przyśrodkowych jądrach migdałowatych. Zaburza to działanie mózgowych systemów antystresowych [Koob, 2008b]. Chroniczne podawanie opioidów wywołuje również istotne zmiany na poziomie molekularnym. Środki uzależniające aktywują białko wiążące się z elementem odpowiedzi na cAMP – CREB (ang. cyclic adenosine monophosphate response-element binding protein) w NAcc oraz jądrach migdałowatych, poprzez zwiększony proces fosforylacji CREB.. 11.

(12) Wstęp. Przewlekła aktywacja CREB prowadzi do wzrostu ekspresji dynorfiny w NAcc, doprowadzając do spadku uwalniania dopaminy. Wpływa to na zwiększenie negatywnych stanów emocjonalnych. Zarówno CREB jak i inne wewnątrzkomórkowe przekaźniki mogą aktywować czynniki transkrypcyjne, które zmieniają ekspresję genów, odpowiadając za utrzymujące się przez długi okres zmiany zachodzące pod wpływem substancji uzależniających. Warto tu wspomnieć o aktywowanym przez CREB wzroście ekspresji genów szybkiej reakcji, takich jak c-Fos, których produkty biorą udział w regulacji ekspresji wielu genów [Koob, 2008a]. W zrozumieniu mechanizmów neuronalnych działania związków opioidowych bardzo ważną rolę odgrywają badania na zwierzętach. Chociaż żaden zwierzęcy model nie naśladuje w pełni mechanizmów występujących u człowieka, to jednak za ich pośrednictwem można badać poszczególne elementy procesu analgezji wywołanej działaniem opioidów. Większość prac eksperymentalnych skupia się nad badaniem mechanizmu prowadzącego do wzmocnienia pozytywnego. Obecnie coraz większą uwagę zajmuje badanie modeli zwierzęcych przyjmujących opioidy długotrwale, w celu wyjaśnienia zmian, jakie następują w wyniku przewlekłego stosowania środków uzależniających [Koob, 2011, Kreek 2007]. Do badań eksperymentalnych na zwierzętach wykorzystuje się różne testy, m.in. warunkowanej preferencji miejsca (ang. conditioned place preference), sensytyzacji (ang. sensitization), tolerancji, abstynencji, test zanurzenia ogona (ang. tail immersion test). Ostatni z nich zastosowano w niniejszej pracy.. 1.1.3. Endogenne opioidy wywodzące się z OUN Działania niepożądane związane z długotrwałym przyjmowaniem opioidów w celu uśmierzenia bólu budzi wiele pytań odnośnie zasadności ich użycia. Lekarze często mają obawy przed stosowaniem opioidów u pacjentów. Mimo to, morfina nadal pozostaje najczęściej stosowanym analgetykiem w przypadku leczenia silnych stanów bólowych. Poszukuje się jednak alternatywnych związków, których mechanizm działania będzie podobny do opioidów, a których efekty uboczne związane z długotrwałym stosowaniem nie będą tak dotkliwie odczuwane przez chorych [Weisner, 2009]. Jednymi z takich związków są naturalnie występujące w układzie nerwowym peptydy opioidowe. Do ich odkrycia przyczyniło się kilka grup badawczych [Goldstein, 1971; Pert 1973; Terenius, 1973], które zidentyfikowały w homogenacie mózgowym myszy receptory, z którymi wiąże się specyficznie morfina. Endogennymi ligandami receptorów opioidowych: μ. 12.

(13) Wstęp. (MOP), κ (KOP) i δ (DOP) są peptydy opioidowe, wyizolowane przez zespoły badawcze: Hughes’a i wsp., Goldsteina i wsp., oraz Lorda i wsp. [Hughes, 1975; Goldstein 1979; Lord 1977]. Wyróżniamy trzy podstawowe grupy peptydów opioidowych: endorfiny, enkefaliny i dynorfiny. Związki te odgrywają kluczową rolę w modulowaniu układu nagrody. Endogenne opioidy wpływają zarówno na efekt wzmocnienia pozytywnego, jak również, poprzez swoją obecność w układzie limbicznym, biorą udział w dynamicznym przyswajaniu narkotyków i w efektach. motywacyjnych. wywołanych. długotrwałym. przyjmowaniem. substancji. uzależniających [Gerrits, 2003]. Czwarty receptor opioidowy – receptor nocyceptynowy (NOP), oraz jego agonistanocyceptyna zostały odkryte stosunkowo niedawno, bo w 1994 roku przez dwie niezależne grupy badawcze [Meunier, 1995; Reinscheid, 1995]. Struktura receptora NOP jest zbliżona do receptorów opioidowych: μ, κ i δ (NOP należy do rodziny receptorów sprzężonych z białkiem G, ale nie wiąże on klasycznych endogennych peptydów opioidowych). Występuje też podobieństwo sekwencji liganda receptora NOP- nocyceptyny do dynorfiny A, endogennego liganda receptora opioidowego κ [Kotlinska, 2000]. Związanie nocyceptyny z receptorem wywołuje podobne efekty do tych wywołanych przez peptydy opioidowe. Nocyceptyna wpływa na aktywność lokomotoryczną, zjawiska lękowe, działanie nagradzające substancji uzależniających, uczenie się, pamięć i pobieranie pokarmu oraz zwiększa odczuwanie bólu (hiperalgezja). Nocyceptyna sama nie ma działania nagradzającego, ani awersyjnego, ale modyfikuje aktywność substancji uzależniających, w tym morfiny. Peptyd sam nie wywołuje zespołu odstawienia, lecz hamuje jego objawy wywołane podaniem naloksonu u szczurów uzależnionych od morfiny [Kotlinska, 2000]. Syntetyczny agonista receptorów NOP – Ro 64-6198, podany przewlekle nie zapobiega rozwojowi uzależnienia od morfiny [Kotlinska, 2003]. Obecnie wiadomo, że oprócz klasycznych peptydów opioidowych oraz nocyceptyny ważną rolę w zjawiskach związanych z aktywnością związków opioidowych pełni szereg innych neuropeptydów, w tym m.in. peptydy CART (ang. cocaine and amphetamineregulated transcript) oraz NPFF. Fragment peptydu CART został wyizolowany po raz pierwszy w 1981 roku, z podwzgórza owcy, ale jego rola była wówczas nieznana [Spiess, 1981]. Dopiero 14 lat później odkryto, że poziom mRNA kodującego prekursor peptydów CART wzrasta w prążkowiu 4-5 krotnie po podaniu kokainy i amfetaminy [Douglass, 1995]. Wykazano także, że mRNA kodujący peptydy CART jest obecny u układzie limbicznym, m.in. w jądrach półleżących przegrody –NAcc [Cole, 1995]. Jak dotąd nie zidentyfikowano receptorów 13.

(14) Wstęp. swoistych dla peptydu CART, wiadomo jednak, że nie oddziałuje on z receptorem żadnego z obecnie znanych neuroprzekaźników. Badania in vitro wskazują na łączenie się peptydu CART z receptorem sprzężonym z białkiem G. Wykazano że peptyd CART bierze udział w takich zjawiskach jak stres, przyjmowanie pokarmu, wydzielanie endokrynne oraz w przewodnictwie bólowym i efektach działania psychostymulantów [Dylag, 2006a].. 1.2.. SYSTEM NPFF. W niniejszej pracy badano aktywność peptydów wywodzących się z prekursora NPFF. W ostatnich latach znacząco wzrosło zainteresowanie aktywnymi biologicznie peptydami pochodzącymi z tego neuropeptydu. Peptyd NPFF, podobnie jak N/OFQ i peptydy CART nie wiąże się z receptorami opioidowymi, lecz z własnymi receptorami, nazwanymi NPFF1 i NPFF2. Neuropeptyd FF jest obecnie uważany za fizjologicznie aktywny neuromodulator biorący udział w procesie percepcji bólu, tolerancji na opioidy oraz w mechanizmach uzależnień. [Roumy, 2000].. 1.2.1. Peptyd NPFF – budowa, funkcje Neuropeptyd FF (NPFF) oraz AF (NPAF) wyizolowano po raz pierwszy w 1985 roku z mózgu. bydlęcego. przy. użyciu. przeciwciała. skierowanego. przeciwko. peptydowi. miotropowemu Macrocallista nimbosa - FMRF-NH2 [Boer, 1980; Dockray, 1983]. Peptyd miotropowy zawierający na N-końcu sekwencję Arg-Met-NH2 występuje u wszystkich mięczaków, spełniając funkcję neuromodulatora. Sekwencja aminokwasowa peptydu pochodzącego od bezkręgowców wykazuje podobieństwo do opioidowego peptydu enkefaliny ([Met5]enkefalina-Arg6-Phe7), a zatem również funkcja obu peptydów powinna być porównywalna [Greenberg, 1983]. Biologiczna rola peptydu NPFF wyizolowanego dzięki badaniom nad FMRF-NH2 ma istotne znaczenie w mechanizmie modulacji bólu [Panula, 1996], a także gospodarce wodnej [Majane, 1991; Sunter, 2001], pobieraniu pokarmu [Murase, 1996] i procesie regulacji efektów działania opiatów [Roumy, Zajac, 1998; Yang, 1985]. NPFF wpływa też na układ sercowo-naczyniowy. [Laguzzi,. 1996]. oraz. bierze. udział. w. magazynowaniu. i. wykorzystywaniu zasobów energetycznych [Lefrere, 2002].. 14.

(15) Wstęp. Peptyd miotropowy Macrocallista nimbosa. FMRF-NH2. [Met5]enkefalina-Arg6-Phe7. YGGFMRF. NPFF. FLFQPQRF-NH2. Rysunek 1.3. Zestawienie sekwencji peptydów prowadzących do odkrycia peptydu NPFF. Peptyd NPFF i jego receptor zidentyfikowano w centralnym układzie nerwowym kilku gatunków ssaków, w tym u ludzi [Panula, 1987; Majane, 1987; Perry, 1997]. Anatomiczne rozmieszczenie peptydu NPFF pokazuje największe jego zagęszczenie w takich strukturach jak: rdzeń kręgowy, podwzgórze i pień mózgu, oraz mniejsze w hipokampie i korze mózgowej [Kivipelto, 1989; Majane, 1989; Panula, 1996]. W wyniki sklonowania ssaczego genu kodującego dwa prekursory: NPFFA i NPFFB, możliwe stało się wyizolowanie peptydów odpowiedzialnych za specyficzną aktywność całego prekursora. Ich sekwencje zawiera Tabela 1.1.. Prekursor NPFFA. NPFFB. Peptyd. Sekwencja aminokwasowa. NPFF. FLFQPQRF-NH2. NPAF. AGEGLNSQFWSLAAPQRF-NH2. RFRP-3. VPNLPQRF-NH2. RFRP-1. MPHSFANLPLRF-NH2. Tabela 1.1. Sekwencje peptydów wywodzących się z prekursorów NPFFA i NPFFB. Z prekursora NPFFA wyizolowano w 1997 i 1999 roku przez dwa niezależne zespoły badawcze peptydy FF (NPFF) oraz AF (NPAF) [Perry, 1997; Vilim, 1999]. Autorzy nazwali ten prekursor FMRFAL – prekursor amidowanego peptydu FMRF.. 15.

(16) Wstęp Human Bovine Rat Mouse. MDSRQAAALLVLLLLIDG-GCAEGPGGQQE-DQLSAEEDSEPLPPQDA------QTSGSL MDARQAAALLLVLLLVTDWSHAEGPGGRDGGDQIFMEEDSGAHPAQDA------QTPRSL MDSK-WAAVLLLLLLLRNWGHAEEAGSWGE-DQVFAEEDKGPHPSQYAHTPDRIQTPGSL MDSK-WAAVLLLLLLLRNWGHAEEAGSWGE-DQVFAEEDKGPHPPQYAHTPDRIQTPGSL. 52 54 58 58. NPAF Human Bovine Rat Mouse. LHYLLQAMERPGRSQAFLFQPQRFGRNTQGSWRNEWLSPRAGEGLNSQFWSLAAPQRFGKK LRSLLQAMQRPGRSPAFLFQPQRFGRNTRGSWSNKRLSPRAGEGLSSPFWSLAAPQRFGKK MRVLLQAMERPRRNPAFLFQPQRFGRNAWGPWSKEQLSPQARE-----FWSLAAPQRFGKK FRVLLQAMETPRRSPAFLFQPQRFGRSAWGSWSKEQLNPQARQ-----FWSLAAPQRFGKK NPFF NPSF. 113 115 114 114. Rysunek 1.4. Sekwencja prekursora NPFFA. Kolorem szarym wyróżniono zidentyfikowane neuropeptydy wywodzące się z tego prekursora.. Sekwencje neuropeptydów powstających z prekursora NPFFA, a pochodzących z różnych gatunków zwierząt zestawione są w Tabeli 1.2. Rozmieszczenie tych peptydów w prekursorze pokazuje Rysunek 1.4. Peptydy te wykazują wspólną cechę: należą do rodziny RF-amidowanych peptydów, których C-koniec zawiera amidowaną sekwencję PQRF-NH2, natomiast N-koniec różni się pomiędzy gatunkami.. Nazwa. Peptyd. Pochodzenie. NPFF. FLFQPQRF-NH2. Mózg wołowy, mózg szczurzy, mysi rdzeń kręgowy, płyn mózgowo-rdzeniowy oraz neuroblastoma linii komórkowej SH-SY5Y pochodzenia ludzkiego. NPA-NPFF. NPAFLFQPQRF-NH2. Szczurzy rdzeń kręgowy. SPA-NPFF. SPAFLFQPQRF-NH2. Mysi rdzeń kręgowy. SQA-NPFF. SQAFLFQPQRF-NH2. Neuroblastoma linii komórkowej SH-SY5Y. NPAF. AGEGLSSPFWSLAAPQRF-NH2. Mózg wołowy. NPAF. AGEGLNSQFWSLAAPQRF-NH2. Płyn mózgowo-rdzeniowy, neuroblastoma linii komórkowej SH-SY5Y pochodzenia ludzkiego. NPSF. SLAAPQRF-NH2. Szczurzy i mysi rdzeń kręgowy, płyn mózgowo-rdzeniowy pochodzenia ludzkiego. Tabela 1.2. Peptydy wywodzące się z prekursora NPFFA. 16.

(17) Wstęp. Prekursor peptydu NPFFB został sklasyfikowany jako RF-amidowany peptyd [Hinuma, 2000], jak również prekursor inhibitora hormonu – gonadotropiny (GnIH) [Tsutsui, 2010]. Wspólną cechą peptydów jest C-końcowa sekwencja: PQRF-NH2 oraz LPLRF-NH2 [Hinuma, 2000; Liu, 2001]. Do tej pory udało się sklasyfikować kilkanaście peptydów pochodzących z prekursora NPFFB, których zestawienie, w zależności od pochodzenia zawiera Tabela 1.3.. Nazwa Ludzki RFRP-1 Ludzki RFRP-3 Małpi RFRP-3 Wołowy RFRP-1 Wołowy RFRP-3 Szczurzy RFRP-3 Chomiczy RFRP-1 Chomiczy RFRP-3. Peptyd. Pochodzenie. MPHSFANLPLRF-NH2. Ludzki mózg. VPNLPQRF-NH2. Ludzki mózg. SGRNMEVSLVRQVLNLPQRF-NH2. Mózg małpy. SLTFEEVKDWAPKIKMNKPVVNKMPPSAANLPLRF-NH2. Mózg wołowy. AMAHLPLRLGKNREDSLSRWVPNLPQRF-NH2. Mózg wołowy. ANMEAGTMSHFPSLPQRF-NH2. Szczurzy mózg. SPAPANKVPHSAANLPLRF-NH2. Mózg chomika. TLSRVPSLPQRF-NH2. Mózg chomika. Tabela 1.3. Peptydy wywodzące się z prekursora NPFFB. 1.2.2. Budowa receptorów NPFF1 i NPFF2 Receptor neuropeptydu FF jest złożony z dwóch podtypów: NPFF1 i NPFF2 wykazujących silne powinowactwo do neuropeptydu NPFF. Wysokie stężenie receptorów zaznacza się szczególnie u ssaków w warstwach powierzchniowych rdzenia kręgowego, gdzie biorą udział w procesie nocycepcji i regulacji funkcji opioidowych. W 2000 roku trzy niezależne zespoły badawcze zidentyfikowały geny receptora NPFF. Pierwszy z nich nazwano NPFF-R1 (inne nazwy: HLWAR77, NPGPR i GPR740) [Bonini,. 17.

(18) Wstęp. 2000; Elshourbagy, 2000], drugi to NPFF-R2 (inna nazwa OT7TO22) [Bonini, 2000; Hinuma, 2000]. Oba receptory należą do rodziny receptorów metabotropowych sprzężonych z białkiem G. Receptory te wykazują w 50% podobieństwo sekwencji do receptora neuropeptydu Y oraz w 30-35% podobieństwo do receptora hipokretyny. Badania farmakologiczne obu receptorów wykazały, że nie są one bardzo restrykcyjne w procesie wiązania peptydów z prekursorów endogennych peptydów NPFFA i NPFFB. Jednakże wykazano, że peptydy powstające z prekursora NPFFA mają większe powinowactwo do receptora NPFF2, natomiast sekwencje wywodzące się z prekursora NPFFB – silniej wiążą się z receptorem NPFF1 [Liu, 2001; Mollereau, 2002]. Badania autoradiograficzne in vitro wykazały, że występowanie receptora NPFF1 ogranicza się do regionów okołordzeniowych, natomiast receptor NPFF2 występuje zarówno w mózgu jak i rdzeniu kręgowym. Ograniczona dystrybucja receptora NPFF1 sugeruje więc, że receptor ten w mniejszym stopniu odpowiada za generowanie funkcji jakie spełnia cały system NPFF [Gouarderes, 2007]. Udowodniono także wpływ dNPA - selektywnego agonisty receptorów NPFF2 na ekspresję genu wczesnej odpowiedzi komórkowej c-Fos w jądrach półleżących przegrody (łac. nucleus accumbens – NAcc) oraz w gałce bladej brzusznej (łac. ventral pallium). Związek ten wstrzyknięty domózgowo myszom przeciwdziała wzrostowi ekspresji genu cFos indukowanemu w tych strukturach mózgu poprzez morfinę [Mouledous, 2010]. Występowanie receptorów NPFF w mózgu dotyczy więc obszarów związanych z analgezją, lokomocją oraz systemem motywacji i nagradzania. Iniekcje antagonistów NPFF do jądra bocznego grzbietowego (ang. dorsal raphe nucleus) oraz jądra śródblaszkowego, znajdujących się we wzgórzu (ang. thalamus), a zatem w rejony mózgu, w których receptory te występują – odwracają analgezję wywołaną podaniem morfiny [Dupouy, 1995].. 1.2.3. Agoniści i antagoniści receptorów NPFF1 I NPFF2 Podstawowe właściwości, jakie musi spełniać dobry antagonista to: selektywność, specyficzność wiązania do receptora jak również osłabianie lub znoszenie działania agonisty. Przebadano kilka potencjalnych antagonistów receptora NPFF, pochodzących m.in. z endogennego prekursora NPFF, których N-koniec został zmodyfikowany: dezaminotyrozyloFLFQRF-NH2 [Malin, 1991 i 1995], dansyl-PQR-NH2 [Prokai, 2001] oraz PFR(Tic)-NH2 [Huang, 2000]. Jednakże wykazują one również działanie agonistyczne i niskie. 18.

(19) Wstęp. powinowactwo do receptora, co ogranicza ich użycie jako potencjalnych leków [Findeisen, 2011]. Spośród antagonistów receptorów NPFF na uwagę zasługują szczególnie BIBP3226 oraz RF9. Liczne badania in vivo oraz in vitro potwierdziły, że BIBP3226 odwraca aktywność głównie receptora NPFF1, choć wykazuje również działanie antagonistyczne i w mniejszym stopniu agonistyczne do receptora NPFF2. Związek ten jest jednocześnie selektywnym antagonistą receptora neuropeptydu Y - NPY1. Sugerowano także, że za efekty wywoływane in vivo przez BIBP3226 odpowiadają w większym stopniu receptory NPFF niż NPY1. Fakt, iż związek ten działa również na inne receptory, ogranicza szersze zastosowanie tego związku [Mollereau, 2001 i 2002]. Obecnie najbardziej obiecującym antagonistą jest związek RF9, który został zsyntetyzowany w 2006 roku przez Simonin i wsp. [Simonin, 2006]. Okazało się, że ta krótka pochodna RF-amidowanego dipeptydu bardzo silnie i selektywnie blokuje aktywność zarówno receptora NPFF1 jak i NPFF2. HN HO. NH2 NH. O H2N. HN NH. NH. O O. O O. NH. H2N. NH. NH. BIBP3226 – selektywny antagonista receptora NPFF1. RF9 – antagonista receptorów NPFF1 i NPFF2. Rys. 1.5. Struktura chemiczna antagonistów receptorów NPFF. Antagonistyczne działanie RF9 widoczne jest zarówno w testach in vitro jak i in vivo [Simonin, 2006]. Duża siła antagonistyczna RF9 w badaniach in vivo może być związana z odpornością na degradację przez enzymy proteolityczne, na skutek N-końcowej modyfikacji dipeptydu poprzez resztę 1-adamantanokarbonylową [Fang, 2008]. Związek ten blokuje również wzrost ciśnienia krwi tętniczej i częstości bicia serca wywołanymi przez NPFF u szczurów. Nie wpływa za to na aktywność lokomotoryczną [Elhabazi, 2012]. RF9 zapobiega jednak przede wszystkim rozwojowi opóźnionej i długotrwałej hiperalgezji spowodowanej 19.

(20) Wstęp. przyjmowaniem narkotyków (heroiny, morfiny). Antagonista receptora NPFF podany jednocześnie z agonistą receptora NPFF, może skutecznie łagodzić ból bez jednocześnie nasilającej się tolerancji związanej z powtarzającą się ekspozycją na opioidy [Simonin, 2006]. Spośród wszystkich badanych antagonistów- RF9 wykazuje największe powinowactwo oraz selektywność w stosunku do receptorów NPFF. W przeciwieństwie do antagonistów – agonista wiąże się specyficznie do receptora, uruchamiając procesy neuromodulujące, wywołujące odpowiedź biologiczną. Agonista często naśladuje działanie naturalnie występujących ligandów, a jego połączenie z receptorem charakteryzuje się dużą aktywnością zarówno w badaniach in vivo jak i in vitro. Efekty farmakologiczne agonistów receptora NPFF są złożone, gdyż w zależności od miejsca podania agonisty obserwowane są efekty zarówno pro- jak i antyopioidowe [Roumy, Zajac, 1998]. Dla porównania na poziomie komórkowym aktywowanie receptorów NPFF1 i NPFF2 wywołuje wyłącznie antyopioidowe efekty [Roumy, 2003]. Badania strukturalne oraz farmakologiczne nad agonistami receptora NPFF2 [Gicquel, 1994; Mazarguil, 2001] udowodniły, że amidowana, C-końcowa sekwencja peptydów PQRF – spełnia kluczową rolę w procesie efektywnego wiązania agonistów do receptora NPFF2. Nadal poszukuje się nowych, selektywnych agonistów oraz antagonistów receptorów NPFF, które pozwolą lepiej zrozumieć różnice pomiędzy RF-amidowanymi peptydami, a tym samym poznać ścieżki sygnałowe przez nie indukowane. I tak w 2009 roku Gaubert i wsp. scharakteryzowali. niepeptydowe. związki. (pochodne. aryloiminoguanidyny),. będące. selektywnymi agonistami receptora hNPFF2. Ogólnoustrojowe podawanie tych związków wiązało się z aktywnością w modelach bólowych in vivo [Gaubert, 2009]. Natomiast Lameh i wsp. za pomocą funkcjonalnych testów komórkowych: R-SAT (ang. Receptor Selection and Amplification Technology - przekształcających efekty wywołane związaniem się liganda z receptorem na wymierną odpowiedź zachodzącą wewnątrz transfekowanych komórek) i cAMP (badającego poziom cyklicznego AMP wewnątrz komórki produkowanego przez cyklazę adenylanową) zidentyfikowali związki, które są selektywnymi agonistami receptora hNPFF2 (AC-263093), a także scharakteryzowali selektywnych antagonistów receptora hNPFF1 (AC-262620 i AC-262970), będących jednocześnie silnymi agonistami receptora hNPFF2. Te ostatnie badania in vivo dowodzą, że receptory NPFF1 i NPFF2 pełnią odmienną rolę w procesie nocycepcji: receptor NPFF1 wykazuje działanie nocyceptywne, natomiast NPFF 2 - antynocyceptywne [Lameh, 2010].. 20.

(21) Wstęp. 1.2.4. Modulacyjna rola systemu NPFF na poziomie komórkowym Stymulowanie receptorów NPFF na poziomie komórkowym prowadzi do deaktywacji receptorów opioidowych (MOP, KOP, DOP i NOP), jednak dokładny mechanizm tego procesu nie jest do końca znany. Zależność jaka występuje pomiędzy receptorami NPFF i receptorami opioidowymi potwierdzają liczne badania biochemiczne. Badania na rekombinowanych liniach komórkowych (CHO, HEK 293, SH-SY5Y) wykazały, że receptory NPFF (sprzężone z białkami G) regulują aktywność cyklazy adenylanowej [Mollereau, 2002 i 2005]. Receptory NPFF oddziaływają także na zależne od potencjału kanały wapniowe (głównie typu N), podobnie jak receptory opioidowe [Kersante, 2006]. Wykazano, że w linii komórkowej neuroblastomy SH-SY5Y wykazującej ekspresję receptorów hNPFF (pochodzenia ludzkiego) agonista tego receptora hamuje proces aktywacji receptorów opioidowych μ (MOP), co doprowadza do zahamowania przewodności kanałów wapniowych. [Mollereau,. 2005].. Efekt. ten. jest. najprawdopodobniej. związany z. desensytyzacją receptora MOP indukowaną przez receptor NPFF za pośrednictwem GRK2 (kinazy receptorów związanych z białkiem G typu 2), co potwierdzają najnowsze badania [Roumy, 2007; Mouledous, 2012]. Stymulowanie receptorów NPFF w żywych komórkach wywołuje zmianę w procesie przyłączania się białka G do receptora MOR. Receptory opioidowe μ (MOR), δ (DOP), κ (KOP) preferencyjnie aktywują podjednostkę Gαi2, przy czym receptor μ łączy się także z Gαi3. Natomiast receptor NPFF wywołuje preferencję w stosunku do podjednostek αS, αi, oraz β, przy czym receptor NPFF1 przyłącza się do podjednostek Gαi3 oraz GαS, natomiast NPFF2 z podjednostkami Gαi2 i Gαi3 oraz GαS i Gαo [Gouarderes, 2007]. Prawdopodobnie interakcja ta może być odpowiedzialna za wywoływanie antyopioidowych efektów agonistów NPFF. Receptor NPFF ma również wpływ na receptor nocyceptyny. Badania na wyizolowanych neuronach z jąder przykomorowych (ang. pereventricular hypothalamic nucleus) i jąder grzbietowych szwu podwzgórza (ang. dorsal raphe nucleus) zawierających zarówno receptory nocyceptyny (NOP) jak i odpowiednio NPFF1 i NPFF2 wykazały że analogi peptydu NPFF hamują indukowane poprzez nocyceptynę przewodnictwo jonów wapniowych [Roumy, 2003].. 21.

(22) Wstęp. 1.2.5. Modulacyjna rola systemu NPFF w mechanizmie bólu Peptyd NPFF bierze udział w wielu procesach fizjologicznych, m.in. modulacji hormonów, regulacji sercowo-naczyniowej, regulacji termicznej, oraz procesie pobierania pokarmu [Mollereau, 2005]. Wiele badań farmakologicznych wskazuje jednak przede wszystkim na istotne znaczenie peptydu w mechanizmach przewodzenia bodźców bólowych, głównie poprzez modulację systemu opioidowego [Roumy i Zajac 1998; Panula, 1999; Mouledous, 2010]. System opioidowy wraz z systemem anty-opioidowym, do którego zalicza się system NPFF, współdziała w procesie powstawania i regulacji uzależnień. Peptyd NPFF oraz jego analogi w zależności od dawki i miejsca podania powodują zarówno wzmocnienie jak i obniżenie efektów opioidowych. Chociaż peptyd NPFF nie wiąże się do receptorów opioidowych, jak również opioidy nie wykazują powinowactwa do receptorów NPFF [Raffa, 1994], to po podaniu dokomorowym (ang. intracerebroventricular – i.c.v.) związek ten wywołuje efekty antyopioidowe, bezpośrednio związane z aktywnością peptydu NPFF w mózgu [Kavaliers, 2006; Yang, 1985]. Peptyd NPFF odwraca bowiem analgezję wywołaną podaniem morfiny w teście usuwania ogona (ang. tail flick) zarówno u myszy jak i szczura [Dupouy, 1995; Gelot, 1998; Yang, 1985], a także wywołuje objawy abstynencji [Malin, 1990]. Natomiast dokanałowa iniekcja peptydu NPFF u szczurów prowadzi do rozwoju silnej i długotrwałej analgezji indukowanej poprzez morfinę [Gouardares, 1996; Quelven, 2002]. A więc domózgowa iniekcja peptydu NPFF wywołuje efekty pronocyceptywne, podczas gdy dokomorowa iniekcja prowadzi do analgezji [Yang, 2006]. Peptyd NPFF hamuje proces nabywania i ekspresji warunkowej preferencji miejsca indukowanej poprzez działanie morfiny [Kotlinska, 2007] jak również kokainy [Kotlinska, 2008] i amfetaminy [Kotlinska, 2012a], a więc wpływa na ośrodek nagrody w mózgu. Peptyd nie znosi warunkowej preferencji miejsca indukowanej poprzez etanol, a więc NPFF nie wpływa na działanie nagradzające wywołane działaniem etanolu, w przeciwieństwie do innego antyopioidowego peptydu – nocyceptyny. Endogenne opioidy odgrywają ważną rolę w nagradzających właściwościach wywołanych przez etanol, co związane jest z ich oddziaływaniem w rejonie VTA w mózgu [Kotlinska, 2007]. Natomiast antagonista peptydu NPFF- dansyl-PQR-NH2 zmniejsza reakcje lękowe wywołane przez etanol w teście podniesionego labiryntu krzyżowego. Proces ten ulega zahamowaniu przez NPFF, co świadczy o wpływie peptydu na zachowania lękowe wywołane działaniem etanolu. 22.

(23) Wstęp. [Kotlinska, 2009]. Odpowiednia modulacja systemu NPFF może więc stanowić ważne narzędzie w leczeniu uzależnień od alkoholu. Warto wspomnieć o istotnej roli peptydu NPFF w kontekście długotrwałego podawania środków uzależniających. Stymulowanie receptorów NPFF w rejonie pola brzusznej nakrywki (VTA) u szczurów blokuje proces uwalniania dopaminy powodowany działaniem morfiny [Kersante, 2011]. U myszy, w tym samym regionie śródmózgowia podane domózgowo (i.c.v.) analogi peptydu NPFF hamują wzmacnianą przez morfinę ekspresję komórkowego protoonkogenu c-Fos, zwłaszcza podczas przewlekłego zażywania środków uzależniających [Mouledous, 2010]. Antagonista peptydu NPFF – RF9 przeciwdziała powstawaniu tolerancji na działanie analgetyczne po podaniu morfiny i łagodzi zespół odstawienia wynikający z przewlekłego uzależnienia od niej [Elhabazi, 2012]. Chroniczne podawanie morfiny powoduje wzrost stężenia NPFF w płynie mózgowo – rdzeniowym, co stanowi istotny mechanizm przyczyniający się do powstania tolerancji na działanie opiatów. Badania wykazały że przewlekłe podawanie opioidów prowadzi do wzrostu aktywności systemu NPFF na skutek zmiany gęstości receptorów opioidowych pod wpływem podania NPFF lub przeciwciała przeciwko NPFF. Tłumaczy to fakt, że dawka naloksonu potrzebna do wywołania zespołu odstawienia maleje wraz ze stopniem rozwoju tolerancji. [Malin, 1990]. Peptyd NPFF wpływa również na aktywność lokomotoryczną zwierząt, którym przewlekle podaje się morfinę, etanol oraz kokainę. Peptyd NPFF wstrzyknięty dokomorowo hamuje ekspresję sensytyzacji na hiperlokomotoryczne działanie morfiny i etanolu [Kotlinska 2007], a także kokainy u myszy [Kotlinska, 2008]. Poza tym NPFF hamuje spontaniczną aktywność lokomotoryczną wywołaną działaniem morfiny, ale nie etanolu. Potwierdza to tezę - o interakcjach pomiędzy systemem NPFF i systemem opioidowym. Co więcej, silny antyopioidowy efekt działania peptydu NPFF zaznacza się wówczas, gdy system opioidowy jest wysoce aktywny [Kotlinska, 2008]. Inne peptydy, które również wywodzą się z prekursora NPFFA są mniej dokładnie zbadane. Wiadomo, że peptyd NPSF wywołuje reakcję nocyceptywną w wyniku iniekcji podskórnej [Yudin, 2006]. Z kolei inny peptyd - wołowy analog NPAF w wyniku podania domózgowego u szczurów skraca czas latencji w teście usuwania ogona, aczkolwiek efekt ten jest mniejszy w porównaniu z peptydem NPFF [Yang, 1985]. Natomiast dokanałowa iniekcja NPAF wywołuje, podobnie jak NPFF, efekty proopioidowe, wzmacniając proces antynocycepcji powodowanej działaniem morfiny [Jhamandas, 2006].. 23.

(24) Wstęp. NPFF jest uważany obecnie za system regulujący układ opioidowy, biorący udział w jego homeostazie, poprzez hamowanie działania opioidów i dlatego odgrywa ważną rolę w rozwoju tolerancji na opiaty [Roumy i Zajac, 1998; Panula, 1999].. 1.3.. KRYPTEINY. Peptydy są syntezowane w organizmie w postaci nieaktywnych prekursorów, które podlegają procesowi trawienia enzymatycznego przez szereg proteaz (w tym proteazy sygnałowe oraz enzymy metaboliczne), a także niekiedy modyfikacji prowadzących ostatecznie do powstania związków aktywnych biologicznie [Nyberg, 2002]. Podczas procesu trawienia uwalnianych jest wiele peptydów, również i takie, które pierwotnie są ukryte w macierzystym prekursorze i które dopiero w wyniku procesów enzymatycznych są uwalniane, wykazując aktywność biologiczną często niezależną od macierzystego związku. Takie ukryte w większym prekursorze peptydy określa się mianem kryptein. W ostatnim czasie do określenia zbioru bioaktywnych peptydów umieszczonych w obrębie białek macierzystych używa się terminu kryptom [Ueki, 2007]. Krypteiny klasyfikuje się w zależności od sposobu uwalniania w organizmie do 3 różnych grup (Rysunek1.6). Uwalnianie kryptein jest rozpowszechnione zwłaszcza w białkach związanych z sygnalizacją hormonalną, macierzą zewnątrzkomórkową, w białkach kaskady dopełniacza, jak i w mleku. Naturalnie występujące krypteiny pełnią ważną rolę w modulowaniu różnorodnych procesów biologicznych, takich jak: angiogeneza, odpowiedź immunologiczna czy wzrost komórek [Autelitano, 2006].. Klasa 1. Krypteiny powstające w wyniku naturalnego trawienia proteolitycznego prekursora białkowego o nowych niepowiązanych z prekursorem właściwościach biologicznych. Klasa 2. Krypteiny powstające w wyniku naturalnego trawienia proteolitycznego prekursora białkowego o właściwościach podobnych do prekursora ale zmienionej funkcji. Klasa 3. Krypteiny powstające in vitro, o zupełnie nowych właściwościach; fragmenty te mogą nie występować naturalnie. Rysunek 1.6. Trzy typy kryptein (na podstawie Autelitano, 2006). 24.

(25) Wstęp. Przewidywanie, które sekwencje aminokwasowe danego białka mogą stanowić funkcjonalne peptydy, nie jest rzeczą trywialną. Stosuje się w tym celu szereg narzędzi bioinformatycznych, które łączą informacje z genomu, cDNA i baz białkowych. Naukowcy przeszukują też ’ręcznie’ sekwencje danego białka i w oparciu o nowoczesne techniki oczyszczania, identyfikacji oraz syntezy rozpoznają peptydy o potencjalnie nowych właściwościach [Pimenta, 2007]. Proteolityczny mechanizm uwalniania kryptein o nowej aktywności stanowi istotny mechanizm zwiększania różnorodności białek i ich funkcji i stanowi potencjalnie nowe źródło leków peptydowych. Poznanie natomiast wszystkich peptydów wywodzących się z tego samego prekursora, modyfikacji oraz oddziaływań jakim ulegają (a więc kryptomu i proteomu) może być kluczowym krokiem w celu zrozumienia złożonych mechanizmów zachodzących podczas procesów fizjologicznych i w patofizjologii.. 1.3.1. Nowe krypteiny wywodzące się z prekursora NPFFA Prekursor peptydu NPFF – NPFFA zawiera jak dotąd trzy znane bioaktywne peptydy: NPFF. (FLFQPQRF-NH2),. NPAF. AGEGLSSPFWSLAAPQRF-NH2). oraz. NPSF. (SLAAPQRF-NH2). Wszystkie peptydy zawierają amidowany C-końcowy fragment PQRFNH2. Analiza sekwencji NPFFA wykazała, że pomiędzy wyizolowanymi peptydami istnieje jeszcze długi łańcuch aminokwasowy - o nieznanej dotychczas funkcji [Dylag, 2008]. Warto nadmienić, że prekursor NPFFA był analizowany za pomocą narzędzi bioinformatycznych pod kątem potencjalnych miejsc trawienia, jednak wśród nowych, teoretycznie powstających neuropeptydów nie było powyższej sekwencji [Southey, 2006].. Human Bovine Rat Mouse. MDSRQAAALLVLLLLIDG-GCAEGPGGQQE-DQLSAEEDSEPLPPQDA------QTSGSL MDARQAAALLLVLLLVTDWSHAEGPGGRDGGDQIFMEEDSGAHPAQDA------QTPRSL MDSK-WAAVLLLLLLLRNWGHAEEAGSWGE-DQVFAEEDKGPHPSQYAHTPDRIQTPGSL MDSK-WAAVLLLLLLLRNWGHAEEAGSWGE-DQVFAEEDKGPHPPQYAHTPDRIQTPGSL. 52 54 58 58. NPAF Human Bovine Rat Mouse. LHYLLQAMERPGRSQAFLFQPQRFGRNTQGSWRNEWLSPRAGEGLNSQFWSLAAPQRFGKK LRSLLQAMQRPGRSPAFLFQPQRFGRNTRGSWSNKRLSPRAGEGLSSPFWSLAAPQRFGKK MRVLLQAMERPRRNPAFLFQPQRFGRNAWGPWSKEQLSPQARE-----FWSLAAPQRFGKK FRVLLQAMETPRRSPAFLFQPQRFGRSAWGSWSKEQLNPQARQ-----FWSLAAPQRFGKK NPFF NPNA NPSF NPSS NPSA. 113 115 114 114. Rysunek 1.7. Sekwencje kryptein wywodzących się z prekursora NPFFA (zaznaczone podkreśleniem) wraz z innymi zidentyfikowanymi neuropeptydami wywodzącymi się z tego prekursora.. 25.

(26) Wstęp. Spośród sekwencji rozpościerającej się pomiędzy peptydem NPFF i NPSF w prekursorze NPFFA pochodzenia szczurzego, do dalszych badań wybrano peptyd zaznaczony podkreśleniem: RFGR↓NAWGPWSKEQLSPQA↓REFW. N-koniec peptydu może zostać uwolniony w wyniku działania konwertaz prekursorów (ang. pro-protein convertases - PCs), które rozpoznają sekwencję Arg-Xxx-Xxx-Arg, uwalniając w ten sposób wiele aktywnych białek/peptydów z ich prekursorów. Natomiast C-końcowy fragment przypuszczalnie może być uwalniany w wyniku działania proteazy trypsynopodobnej (na C-końcu argininy), która zostaje w kolejnym kroku odłączona przez karboksypeptydazę B [Dylag, 2008]. Omawiany peptyd różni się pomiędzy gatunkami i różni się nazwą. Szczurzy analog o sekwencji. NAWGPWSKEQLSPQA. nazwano. NPNA. od. jego. końcowych. reszt. aminokwasowych. Natomiast mysi peptyd o sekwencji SAWGSWSKEQLNPQA zgodnie z powyższą regułą nazwano NPSA [Kotlinska, 2012b]. Uwolniony peptyd – fragment 85-99 w przeciwieństwie do peptydów NPFF nie posiada amidowanego C-końca na skutek braku glicyny niezbędnej do procesu amidacji. Należy zauważyć, iż nie udowodniono, że ten konkretny endogenny peptyd jest naturalnie uwalniany z prekursora NPFF. Omawiany fragment 85-99 może zawierać jeszcze mniejszy, aktywny biologicznie peptyd. Z tego właśnie powodu omawiany związek można skategoryzować jako krypteinę typu trzeciego (Rysunek 1.6.), co oznacza nowy aktywny fragment powstający in vitro, nie występujący naturalnie [Dylag, 2008].. 1.3.2. Funkcja kryptein prekursora NPFFA Efekt farmakologiczny wywoływany przez krypteiny NPNA i NPSA jest podobny do opisanych dla peptydu NPFF. Efekt farmakologiczny wywoływany przez NPFF jest zależny od miejsca podania (dokomorowego lub dokanałowego). Dlatego aby odnieść efekt aktywności peptydu NPFF do efektów wywołanych działaniem kryptein, należy brać pod uwagę tylko te badania, w których miejsce podania tychże związków jest identyczne. NPNA wstrzyknięty domózgowo (i.c.v.) w dawce 10 nmol wyraźnie osłabia, a w dawce 20 nmol silnie odwraca analgezję wywołaną działaniem morfiny w teście zanurzenia ogona (ang. tail immersion test). Sam peptyd nie wykazuje żadnej aktywności nocyceptywnej (zarówno w dawce 10 i 20 nmol). Podobnie podczas testu warunkowanej preferencji miejsca (ang. conditioned place preference-CPP), umożliwiającym ocenę działań nagradzających, krypteina hamuje okres przebywania w warunkowo wybieranym pomieszczeniu (czyli hamuje proces preferencji miejsca) związanego z otrzymaniem morfiny. Efekt jest. 26.

(27) Wstęp. proporcjonalny do otrzymanej dawki – jest wyższy przy dawce 20 nmol. Sam peptyd nie wpływa na rozwój preferencji miejsca [Dylag, 2008]. Efekty farmakologiczne wywoływane przez mysią krypteinę – NPSA są podobne. Zarówno test gorącej płytki (ang. hot-plate test) jak również test zanurzenia ogona wykazał, że czas latencji, czyli czas od początku działania bodźca do wystąpienia reakcji bólowej (odpowiednio podskoki czy lizanie łap w teście gorącej płytki oraz gwałtowny ruch ogona w teście zanurzenia ogona) u myszy uzależnionych od morfiny, po podaniu krypteiny do komory bocznej mózgu ulega znacznemu skróceniu. Antagonista receptorów NPFF – dipeptyd RF9 odwraca antyopioidowe efekty związane z działaniem kryptein. Potwierdza to udział receptorów NPFF na efekty wywoływane przez krypteiny [Kotlinska, 2012b]. Tym samym badaniom poddano krótszy fragment peptydu NPSA, a mianowicie peptyd NPSS: SAWGSWS. Sekwencję tę wybrano - ze względu na potencjalne miejsce trawienia – Lys92. Peptyd również odwraca analgezję podanej obwodowo morfiny [Kotlinska, 2012b]. Udowodniono także, że peptyd NPNA wpływa na aktywność genów kodujących podjednostki Gα ((i1), (i2) oraz (i3)) łączących się z receptorami opioidowymi w trzech regionach: hipokampie, korze czołowej oraz prążkowiu [Suder, 2008]. Chociaż proces ten nie jest do końca zrozumiały, to w nawiązaniu do tego samego efektu wywoływanego przez system NPFF przyjęto kilka hipotez. NPNA może się wiązać bezpośrednio z receptorem NPFF, który z kolei fizycznie oddziałuje na receptory opioidowe. Krypteina może też oddziaływać nie tyle na receptor, co na system innych neuroprzekaźników, które łączą się z tymi samymi podjednostkami białek G(i), np. glutaminą czy serotoniną. Udowodniono już wcześniej, że system NPFF moduluje poziom neuroprzekaźników przyłączonych do GPCRs. Trzecia hipoteza zakłada istnienie nowych receptorów NPNA, których stymulacja w wyniku wiązania peptydu NPNA obniża aktywność genów kodujących podjednostki białek Gi, co z kolei hamuje syntezę cAMP [Suder, 2008]. Poznanie dokładnej endogennej ścieżki sygnałowej inicjowanej przez krypteiny wymaga jednak dalszych badań. Aktywność biologiczna badanych kryptein jest trudna do wytłumaczenia. Istnieje kilka hipotez na temat ich niekonwencjonalnego działania. Być może receptory NPFF zawierają inne miejsce wiązania, do którego przyłączają się krypteiny. Możliwe również, że efekty analgetyczne wywołane działaniem peptydów są związane z zupełnie innym receptorem, na który oddziałuje również antagonista receptorów NPFF – RF9 [Kotlinska, 2012b]. Obecny stan wiedzy stawia jeszcze dużo pytań odnośnie kryptein. Zastanawiająca jest fizjologiczna rola tych peptydów oraz to, czy i w jakiej formie istnieją one w organizmie. Nieznane są. 27.

(28) Wstęp. również czynniki, które regulują proces konwersji lub degradacji kryptein oraz jak mechanizm ten przebiega w organizmie żywym. Warto również wspomnieć o krypteinach wśród innych peptydów wpływających na rozwój uzależnień lekowych – peptydach CART. W wyniku ekspresji genu kodującego peptyd CART powstają prepropeptydy, które w wyniku dalszego trawienia proteolitycznego prowadzą do powstania właściwego peptydu CART (fragment 55-102), wykazującego wpływ na szereg procesów, m.in. pobieranie pokarmu, odczuwanie bólu czy efekty wywołane przez środki uzależniające. Analiza sekwencji peptydu ujawniła istnienie innego fragmentu (85102), który przebadano pod kątem aktywności farmakologicznej. Nie ma dowodów, które wskazywałyby że CART (55-102) ulega specyficznej proteolizie. Wykazano jednak, że CART (85-102) odwraca stymulujący wpływ kokainy i amfetaminy na aktywność lokomotoryczną, łagodzi objawy abstynencji morfinowej oraz zapobiega wystąpieniu sensytyzacji na hiperlokomotoryczne działanie morfiny u myszy [Dylag, 2006b]. Krypteiny, jako nowe związki powstające w wyniku działania endogennych enzymów, często wykazujących odmienną aktywność w stosunku do prekursora, z którego się wywodzą mogą mieć więc istotne znaczenie podczas opracowywania nowych terapii lekowych.. 1.4.. PEGYLACJA. 1.4.1. Bariera krew-mózg Rola, jaką neuropeptydy odgrywają w procesach chorobowych stanowi ważny obszar badań ostatnich trzech dekad. Neuropeptydy stanowią dużą grupę związków uczestniczących w modulacji sygnałów w OUN, co czyni z nich potencjalne źródło leków. Jednakże leczenie chorób centralnego układu nerwowego za pomocą leków peptydowych ma swoiste ograniczenia [Egleton, 2005]. Leki peptydowe są szybko usuwane z organizmu w wyniku działania. enzymów. proteolitycznych,. a. ponadto. mogą. wywoływać. odpowiedź. immunologiczną. Jednak główną przeszkodą, jaką neuropeptydy muszą pokonać to bariera krew-mózg (ang. blood-brain barrier-BBB). Bariera krew-mózg jest zbudowana z warstwy ściśle przylegających komorek nabłonka naczyń krwionośnych, która stanowi fizyczną przeszkodę ograniczającą przemieszczanie się związków polarnych pomiędzy mózgiem a krwiobiegiem. [Patrick, 2003]. BBB zabezpiecza układ nerwowy przed szkodliwymi czynnikami, a także umożliwia selektywny transport substancji z krwi do płynu mózgowordzeniowego. Pomimo badań nad molekularnym mechanizmem przenikania bariery krew28.

(29) Wstęp. mózg, jak również rozwojem nowoczesnych technik medycznych w przypadku bardzo wielu chorób centralnego układu nerwowego, nadal brakuje efektywnych metod terapii. Nie jest to spowodowane brakiem odpowiedniego leku, lecz wynika z trudności z transportem poprzez BBB,. bez. konieczności. używania. inwazyjnych. metod. jakimi. niewątpliwie. są. neurochirurgiczne iniekcje domózgowe lub dokanałowe [Chen, 2012]. Naukowcy opracowali kilka skutecznych metod modyfikacji neuropeptydów w celu zwiększenia ich zdolności do przenikania bariery krew-mózg. Większość z nich polega na zwiększeniu czasu półtrwania peptydu poprzez wzrost odporności na przemiany metaboliczne czy przez zwiększenie charakteru hydrofilowo-lipofilowego cząsteczki. Jednak nawet jeśli neuropeptyd dotrze do właściwego miejsca działania, to szereg enzymów obecnych w mózgu, takich jak m.in.: transpeptydaza γ-glutamylowa, fosfataza alkaliczna, dipeptydylo-peptydaza oraz aminopeptydazy A i N, może prowadzić do proteolizy i inaktywacji peptydu [Brasnjevic, 2009]. W przypadku modyfikowania neuropeptydów należy jeszcze wziąć pod uwagę fakt, że choroby centralnego układu nerwowego wywołują poważne zmiany w BBB, prowadzące do wzrostu przepuszczalności bariery oraz zaburzenia jej integralności. Znanych jest kilka nieinwazyjnych metod dostarczania neuropeptydów do mózgu przy użyciu białek transportowych, specyficznych receptorów lub za pośrednictwem adsorpcyjnej endocytozy. Metody te są połączeniem endogennego transportu używanego przez BBB oraz odpowiedniej modyfikacji neuropeptydów, poprzez utworzenie makromolekularnego koniugatu z liposomami, nanocząsteczkami lub chimerami peptydowymi [Chen, 2012]. Niniejsza praca skupia się przede wszystkim na badaniu neuropeptydów modyfikowanych w wyniku kowalencyjnego przyłączenia glikolu polietylenowego. Proces ten nazywany jest pegylacją.. 1.4.2. Budowa oraz właściwości koniugatów PEG-peptyd. Pegylację definiuje się jako modyfikację białek, peptydów lub związków niepeptydowych poprzez przyłączenie jednego lub więcej łańcuchów polimeru, najczęściej glikolu polietylenowego (PEG). Pegylacja po raz pierwszy została opisana w latach 70-tych ubiegłego wieku przez Davisa i Abuchowsky’ego, którzy w ten sposób zmodyfikowali albuminę i katalazę, zachowując przy tym aktywność białek [Abuchowski, 1977]. Derywatyzacja glikoli polietylenowych zapoczątkowana przez profesora Franka Davisa i współpracowników w tym samym czasie,. 29.

(30) Wstęp. pozwoliła na otrzymanie wielu analogów tego polimeru, o różnych końcowych grupach funkcyjnych, które w wydajny sposób mogą łączyć się z peptydami, białkami, jak również przeciwciałami, hormonami, czy wirusami [Veronese, 2005]. Proces ten stanowi silnie rozwijającą się dziedzinę, a otrzymane koniugaty mają szerokie spektrum zastosowań jako leki. Glikol polietylenowy jest polimerem zbudowanym z powtarzających się jednostek tlenku etylenu o masie 44Da. Ilość N powtarzających się monomerów definiuje masę całego PEGu. Polimer zawiera dwie końcowe grupy hydroksylowe. Zazwyczaj jedną z nich przeprowadza się w grupę metoksylową, a drugą w grupę odpowiednią do połączenia z wybranym związkiem [Greenwald, 2001]. Peptydy zawierają wiele grup funkcyjnych w łańcuchach bocznych aminokwasów, które potencjalnie mogą brać udział w reakcji sprzęgania z polimerem. Mechanizm takiej reakcji polega na nukleofilowym ataku grupy funkcyjnej łańcucha bocznego konkretnego aminokwasu na centrum elektrofilowe odpowiednio aktywowanego polimeru. PEGi przyłączone w ten sposób do peptydów i białek noszą nazwę PEGów pierwszej generacji [Roberts, 2002]. Zazwyczaj do pegylacji polipeptydów stosuje się glikole polietylenowe aktywowane grupami wykazującymi reaktywność w stosunku do łańcuchów bocznych lizyny, ze względu na powszechność występowania tego aminokwasu w białkach (10% ogólnej zawartości). Inną popularną metodą jest koniugacja z N-końcem polipeptydu. Przyłączenie polimeru do grupy tiolowej cysteiny, która nie jest zaangażowana w tworzenie mostków siarczkowych ze względu na rzadkość występowania tego aminokwasu w białkach, jest jedną z najbardziej specyficznych metod modyfikacji. Zaprojektowano również glikole polietylenowe drugiej generacji w celu zwiększenia selektywności oraz stabilności wiązania polimer-peptyd, jak również zminimalizowania reakcji ubocznych. Są to glikole polietylenowe aktywowane aldehydami, tworzące redukowalne in situ zasady Schiffa lub aktywne estry PEGów. Nowe, dostępne na rynku glikole polietylenowe zawierają na obu końcach różne grupy aktywne, dzięki czemu mogą wiązać dwie różne makrocząsteczki [Veronese, 2001; Roberts, 2002, Zalipsky, 1995]. N-koniec neuropeptydów (w tym peptydów opioidowych) bierze udział w wiązaniu do receptora i jego modyfikacja często wywołuje utratę aktywności całego koniugatu [Gault 2008]. Dlatego w tym przypadku przyłączenie glikolu polietylenowego następuje najczęściej do grupy karboksylowej pochodzącej zarówno z C-końca jak i z łańcuchów bocznych reszt kwasu asparaginowego i glutaminowego. 30.

(31) Wstęp. Aby koniugat peptydu z polimerem wykazywał maksymalny efekt terapeutyczny należy wybrać odpowiednią długość polimeru. Jeśli będzie on zbyt krótki, wzmocni on tylko nieznacznie działanie docelowego związku, jeśli z kolei będzie zbyt długi, może powodować utratę aktywności biologicznej na skutek zawady sterycznej w procesie wiązania do receptora. Wykazano, że im większa masa cząsteczkowa polimeru, tym mniejsza aktywność in vitro ale większa aktywność in vivo [Roberts, 2002]. Badania dystrybucji PEGu w organizmie wykazały, że polimery o masie poniżej 50kDa łatwo przenikają błony biologiczne [Yamaoka, 1994]. Do modyfikowania białek i peptydów o masie poniżej 20kDa zwykle używa się PEGów o masie do 20kDa, przy czym najczęściej stosowane są polimery 500-5000Da [Huber, 2003]. Już kilka monomerów odpowiednio modyfikowanego polimeru powoduje zmianę właściwości fizycznych całego koniugatu [Grun, 2006].. 1.4.3. Funkcje oraz zastosowania pegylowanych białek i peptydów. Możliwości, jakie niesie ze sobą przyłączanie glikoli polietylenowych do związków aktywnych biologicznie, czyni z nich związki o szerokim spektrum zastosowań w biotechnologii i medycynie. Polimery te nie są toksyczne, nie wykazują właściwości immunogennych oraz antygenowych, są bardzo dobrze rozpuszczalne w wodzie, jak również w środowisku lipofilnym [Veronese 2001]. Pegylowane białka oraz peptydy wykazują wiele zalet. Przyłączenie glikolu polietylenowego do peptydu bądź białka tworzy specyficzną warstwę ochronną, powodującą zwiększoną stabilność modyfikowanego związku [Suzuki, 1984], oraz odporność na działanie proteaz [Abuchowski, 1977]. Wzrost masy cząsteczkowej redukuje filtrację nerkową związków i zwiększa tym samym okres półtrwania koniugatu w organizmie [Ho, 1986]. Przyłączenie PEGu do zwykle hydrofilowych peptydów bądź białek powoduje wzrost rozpuszczalności w środowisku hydrofobowym, a co za tym idzie, możliwość przekroczenia bariery krew-mózg [Chen, 1981].. 31.

(32) Wstęp. Rys. 1.8. Idea pegylacji biocząsteczek ( na podstawie http://abp.co.kr/rnd_eng.htm). Dodatkową zaletą PEG-peptydów jest ograniczenie ich agregacji umożliwiające osiągnięcie wysokiego stężenia. Przyłączone łańcuchy polimerowe mogą ochraniać epitop na powierzchni makromolekuł, a tym samym redukować immunogenność potencjalnych leków [Davis, 1981; Veronese, 1985]. Pegylacja w krótkim czasie stała się efektywnym narzędziem badawczym w chemii farmaceutycznej prowadzącym do powstania nowych, homogenicznych oraz wysoce specyficznych w działaniu leków. Wśród koniugatów polimerowych, stosowanych już jako leki warto wspomnieć o pegylowanym analogu hormonu wzrostu (GH), wysoce selektywnym anatagonistą receptora GH stosowanym w leczeniu akromegalii [Trainer, 2000], czy o PEGylowanej. kamptotecynie. (CPT)-. jednym. z. najbardziej. nowoczesnych. leków. przeciwnowotworowych [Caiolfa, 2000]. Innym przykładem jest PEG-rHuMGDF – pegylowany czynnik wzrostu i różnicowania megakariocytów stosowany w leczeniu trombocytopenii [Basser, 1996]. W leczeniu wirusowego zapalenia wątroby typu C używa się obecnie pegylowanych interferonów PEG-α interferon 2a [Bailon, 2001], czy PEG-α 32.

(33) Wstęp. interferon 2b [Wang, 2002], których modyfikacja niweluje problem częstotliwości podawania leku. W odniesieniu do niniejszej pracy jedną z najważniejszych zalet jakie mają związki pegylowane jest fakt przenikania przez barierę krew- mózg i wydłużenie okresu działania leków w mózgu. Zastosowanie tej modyfikacji do peptydów wykazujących analgezję może skutecznie dostarczyć związki podane obwodowo do mózgu, by następnie znacząco wydłużyć okres latencji. Przeprowadzono modyfikację peptydu opioidowego – bifaliny, będącej analogiem enkefaliny. Pegylowana bifalina wykazywała silne właściwości antynocyceptywne w wyniku podania obwodowego, znacznie przewyższające efekty wywołane przez niezmodyfikowaną bifalinę [Huber, 2003; Bentley, 2004]. Podobny efekt zaobserwowano w przypadku DPDPE. Pegylowana pochodna enkefaliny również wykazuje wzrost analgezji w wyniku podania dożylnego (i.v.), aczkolwiek koniugat wiąże się nieco słabiej do receptora δopioidowego [Witt, 2001]. Pegylacja stanowi więc skuteczną metodą modyfikacji związków aktywnych biologicznie. Pozwala przezwyciężyć wiele problemów związanych z biodystrybucją leku w organizmie. Potrzebnych jest jednak sporo badań nad tymi związkami, a konkretnie nad efektami farmakodynamicznymi i farmakokinetycznymi jakie wywołuje połączenie polimeru z peptydem, bądź białkiem. W przypadku każdego nowego związku należy dobrać doświadczalnie odpowiedni linker łączący związek aktywny z polimerem, jak również długość PEGu. Wpływa to bowiem bezpośrednio na efekt farmakologiczny wywoływany przez te koniugaty.. 33.

(34) Cele pracy. 2. CELE PRACY Celem pracy doktorskiej było: I.. zbadanie farmakologicznych funkcji kryptein wywodzących się z prekursora NPFFA w mechanizmach bólu i porównanie działania tych sekwencji z analogami pegylowanymi na C-końcu;. II.. zbadanie wpływu modyfikacji chemicznej na właściwości farmakodynamiczne otrzymanych koniugatów peptyd-polimer w badaniach in vivo i in vitro;. III.. zbadanie procesu metabolizmu kryptein wywodzących się z prekursora NPFFA w homogenacie mózgu szczura oraz zidentyfikowanie enzymów odpowiedzialnych za ich degradację;. 34.