Jednym z głównych problemów zdrowotnych współczesnych społeczeństw są różnego rodzaju dolegliwości bólowe, szczególnie silnie odczuwane przez osoby starsze, oraz pacjentów ze zdiagnozowanymi nowotworami. Nieprawidłowe uśmierzanie bólu jest przyczyną niepotrzebnego cierpienia i pogorszenia jakości życia. Podstawową metodą leczenia bólu jest odpowiednia farmakoterapia. Zgodnie z wytycznymi Światowej Organizacji Zdrowia w leczeniu bólu przewlekłego stosowane są opioidy, m.in. morfina. Lek ten wywołuje analgezję poprzez bezpośrednie działanie na ośrodkowy układ nerwowy, na skutek łączenia się z receptorem opioidowym μ. Stosowanie opioidów w leczeniu bólu budzi często obawy o skutki uboczne, związane głównie z możliwością nadużywania tych leków i doprowadzenia pacjenta do uzależnienia. Ważną rolę w procesach związanych z aktywnością opioidów odgrywają również endogenne peptydy opioidowe występujące w układzie nerwowym oraz inne neuropeptydy. Związki te łączą się z receptorami opioidowymi, bądź z własnymi receptorami i stanowią potencjalne, alternatywne źródło nowych leków do zastosowania m.in. w terapii leczenia bólu.
W niniejszej pracy doktorskiej przedstawiono wyniki badań peptydów wywodzących się z układu NPFF. Wiele prac wskazuje na istotną rolę systemu NPFF (a zwłaszcza neuropeptydu FF) w mechanizmach przewodzenia bodźców bólowych, głównie poprzez modulację systemu opioidowego [Roumy, 1998].
Do tej pory dobrze opisano funkcję trzech amidowanych peptydów, wywodzących się z prekursora NPFFA: NPFF, NPSF oraz NPAF. Ostatnio wykazano, że pomiędzy peptydami NPFF i NPSF istnieje jeszcze jedna aktywna farmakologicznie sekwencja – krypteina: NPNA (szczurza) i NPSA (mysia) [Dylag, 2008]. Peptyd ten, jak również jego krótszy odpowiednik – krypteina NPSS (mysia) wstrzyknięte domózgowo, odwracają analgezję wywołaną morfiną podaną obwodowo [Kotlinska, 2012b]. Odkrycie w/w kryptein postawiło wiele pytań odnośnie ich fizjologicznej roli, czy mechanizmów konwersji enzymatycznej prowadzących do uwalniania aktywnych farmakologicznie peptydów. Przeprowadzone w ramach niniejszej pracy badania miały na celu próbę odpowiedzi na większość z tych pytań. Przedmiotem analiz była także zależność aktywności od struktury poprzez badania aktywności kryptein modyfikowanych glikolem polietylenowym różnej długości.
Dyskusja
90
Badania in vitro metabolizmu krypteiny NPNA w homogenacie kory mózgowej szczura
Przeprowadzone badania potwierdzają obecność enzymów, które degradują krypteinę NPNA do krótszych peptydów. W wyniku metabolizmu peptydu NPNA powstają ściśle określone fragmenty. Hydroliza wiązania peptydowego następuje po karboksylowej stronie aminokwasów Trp3
,6 oraz Leu11.
Eksperymenty wskazują na proces uwalniania, pod wpływem peptydaz obecnych w homogenacie kory mózgowej, ściśle określonych metabolitów. Szczególnie interesujący jest fakt trawienia peptydu po C-końcowej stronie aminokwasu hydrofobowego – tryptofanu. W bazie danych MEROPS nie zidentyfikowano żadnego enzymu, którego specyficzność byłaby dokładnie taka sama, jak w uzyskanych wynikach. Fakt ten, jak również obecność wielu produktów metabolizmu krypteiny NPNA zidentyfikowanych na widmach masowych, sugeruje obecność kilku proteaz biorących udział w tych procesach. Uzyskane wyniki wymagały dalszego potwierdzenia, w związku z czym przeprowadzono proces izolowania enzymów z homogenatu kory mózgowej szczura. Zastosowano serię eksperymentów in vitro oraz wykorzystano platformę proteomiczną w celu scharakteryzowania enzymów biorących udział w procesie degradacji kryptein.
Izolacja oraz identyfikacja enzymów degradujących krypteiny NPNA z homogenatu kory mózgowej szczura
Procedura homogenizacji tkanki mózgowej prowadzi do uwolnienia nie tylko białek lecz również soli, kwasów nukleinowych, polisacharydów i lipidów, które ze względu na złożoność budowy, duże masy cząsteczkowe, jak również tworzenie kompleksów z białkami utrudniają analizę i identyfikację białek. Dobór strategii oczyszczania próbki na tym etapie wymagał zachowania jego aktywności biologicznej. Materiał poddano wirowaniu w celu usunięcia stałych cząstek, a następnie zastosowano chromatografię jonowymienną w gradiencie soli. Frakcje wykazujące aktywność proteolityczną w stosunku do krypteiny NPNA oczyszczono metodą dializy (z membraną o punkcie odcięcia składników wysokocząsteczkowych próbki 12-14 kDa). Zidentyfikowano 3 główne frakcje, których inkubacja z peptydem NPNA prowadziła do powstawania zupełnie odmiennych metabolitów. Badania wpływu inhibitorów różnych klas proteaz na proces degradacji peptydu NPNA wykazały, że proces powstawania charakterystycznych dla każdej frakcji fragmentów ulegał
91 zahamowaniu w wyniku działania kilku inhibitorów. Potwierdza to wcześniejsze przypuszczenia, że wyizolowane frakcje zawierają kilka enzymów, które biorą udział w procesie hydrolizy krypteiny, a zidentyfikowane fragmenty peptydowe są wynikiem ich wspólnego działania. Zestawienie wszystkich klas proteaz, których wpływ stwierdzono na podstawie badań in vitro znajdują się w tabeli 5.1.
Frakcja 23 Frakcja 26 Frakcja 35 aminopeptydaza proteaza cysteinowa metaloproteaza proteaza cysteinowa proteaza serynowa * metaloproteaza aminopeptydaza proteaza cysteinowa* proteaza serynowa metaloproteaza aminopeptydaza
Tabela 5.1. Typy enzymów biorących udział w metabolizmie peptydu NPNA na podstawie badań in vitro z
inhibitorami protez. Gwiazdką zaznaczono typy proteaz, których nie zidentyfikowano za pomocą narzędzi proteomiki.
W celu identyfikacji enzymów za pomocą narzędzi proteomiki, frakcje wykazujące aktywność proteolityczną w stosunku do krypteiny NPNA zagęszczono, a następnie rozdzielono za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym w SDS. Kolejnym krokiem była analiza map peptydowych metodą nanoLC-MS/MS.
Jednym z głównych problemów jaki ma miejsce w przypadku poszukiwania białek o określonej specyficzności w próbkach biologicznych, to ogromna ilość białek w mieszaninie, znacznie różniących się stężeniem. W pojedynczych prążkach otrzymanych w wyniku rozdziału SDS-PAGE zlokalizowanych było kilka białek, co potwierdza złożoność próbek. Wiele enzymów występuje w bardzo małej ilości w próbkach biologicznych. Dlatego też ilość materiału użytą do rozdziału SDS-PAGE dobrano w taki sposób, aby stężenie analizowanych białek mieściło się w przedziale, w którym możliwa jest identyfikacja cząsteczek o niskiej zawartości w próbce, przy równoczesnym uniknięciu maskowania ich obecności przez białka o największej koncentracji. Jeśli poszukuje się białek, które występują w małych ilościach w próbce, zwykle stosuje się odpowiednie techniki separowania, frakcjonowania, chromatografię powinowactwa, mające na celu usunięcie białek o wysokim stężeniu w próbce (np. albumin z osocza). Stosuje się również metody wzbogacania związków o małym stężeniu w próbce. Problem identyfikacji białek występujących w niskich stężeniach to jedno z wyzwań współczesnej proteomiki, gdyż od rodzaju zastosowanych metod przygotowania
Dyskusja
92 materiału biologicznego zależy efektywność i rzetelność uzyskanych wyników [Drabik, 2010].
Dzięki zastosowanej platformie proteomicznej, w niniejszej pracy udało się wykryć ponad 400 białek, z których 13 to enzymy proteolityczne. Biorąc pod uwagę uzyskane wyniki z badań in vitro oraz właściwości zidentyfikowanych proteaz (m.in. specyficzność substratową oraz optymalne warunki działania) wytypowano kilka interesujących enzymów, które mogą brać udział w trawieniu krypteiny NPNA.
Frakcja 23:
We frakcji 23 zidentyfikowano katepsynę B. Pomimo swoistości trawienia analogicznej jak w peptydzie NPNA (hydroliza wiązania między Leu11
-Ser12), enzym ten jest aktywny w pH niższym od tego stosowanego podczas inkubacji. Można jednak założyć, że nawet w tych warunkach katepsyna wykazują szczątkową aktywność, która jest wystarczająca do metabolizmu krypteiny prawdopodobnie ze względu na wysoką aktywność enzymu w wyizolowanej frakcji.
Frakcja 26:
We frakcji nie zidentyfikowano żadnej proteazy serynowej, której wpływ na proces trawienia peptydu sugerowały wcześniejsze badania z inhibitorami proteaz. Może to być spowodowane występowaniem tej klasy proteaz w bardzo małym stężeniu w próbce. Enzym może wykazywać swoją aktywność w badaniach in vitro, natomiast jego ilość może nie mieścić się w wybranym przedziale identyfikacji białek za pomocą SDS-PAGE.
Enzymami, które prawdopodobnie odpowiadają za hydrolizę wiązania Trp3
-Gly4, Trp6 -Ser7 oraz Leu11-Ser12 są: peptydaza dipeptydylowa III (DPPIII), hydrolaza bleomycyny (BLMH) oraz oligopeptydaza thimet (TOP).
Porównanie wyników uzyskanych z zastosowaniem eksperymentów in vitro z identyfikacją za pomocą narzędzi proteomiki sugeruje przypuszczalną rolę w/w enzymów na proces degradacji krypteiny NPNA. Trudno jednak w sposób jednoznaczny ocenić ich wpływ na proces powstawania konkretnych fragmentów uzyskanych w badaniach. Hydroliza peptydu z wyizolowanymi enzymami czy też mieszaniną enzymów również mogłaby się okazać niewystarczająca w rozstrzygnięciu tej kwestii. Produkty hydrolizy peptydu powstałe w wyniku działania wyizolowanych enzymów, mogłyby być zupełnie inne od sumarycznych efektów obserwowanych podczas hydrolizy mieszaniną tych peptydaz, jak to prawdopodobnie zachodzi w układach biologicznych.
93 Frakcja 35:
We frakcji 35 wyróżniono 2 enzymy, które mogą wpływać na degradację peptydu NPNA i powstawanie fragmentu będącego wynikiem hydrolizy wiązania Trp3
-Gly4. Są to: cytozolowa aminopeptydaza alanylowa (PSA) oraz peptydaza dipeptydylowa II (DPPII).
We frakcji nie zidentyfikowano żadnej proteazy cysteinowej, której wpływ na proces trawienia peptydu sugerowały wcześniejsze badania z udziałem inhibitorów proteaz, co może być spowodowane, podobnie jak ma to miejsce we frakcji 26, zbyt małym stężeniem tego enzymu (w przeliczeniu na białko), które jest maskowane przez białka o większej intensywności.
Liczba enzymów, która bierze udział w degradowaniu neuropeptydów w OUN jest zwykle ograniczona, jednakże proteazy te wykazują szeroką specyficzność działania. Neuropeptydy mogą być trawione zarówno przez enzymy błonowe jak i cytozolowe.
Wpływ na degradację krypteiny ma kilka proteaz obecnych w wyizolowanych frakcjach z grupy aminopeptydaz i endoproteaz. Jako że enzymy te hydrolizują również inne peptydy, w tym peptydy opioidowe (Tabela 5.2), może to sugerować istnienie pewnej grupy endogennych enzymów regulujących poziom kryptein w mózgu. Warto jednak podkreślić, że nie wszystkie enzymy, których aktywność w stosunku do peptydu NPNA wykazały badania in vitro, zostały zidentyfikowane za pomocą narzędzi proteomicznych (Tabela 5.1).
W procesie proteolizy krypteiny mogą więc uczestniczyć jeszcze inne enzymy, których nie udało się wyizolować ze względu na złożoność próbek.
Zidentyfikowana proteaza Metabolizowane peptydy opioidowe
Hydrolizowane
wiązanie Literatura
Peptydaza dipeptydylowa III [Leu5]-enkefalina Gly-Gly McDonald, 1998
Hydrolaza bleomycyny - - -
Oligopeptydaza thimet dynorfina A (1-8) nocyceptyna Gly-Phe, Leu-Arg, Phe-Gly, Ala-Arg Dando, 1993 Montiel, 1997 Peptydaza dipeptydylowa II - - - Cytozolowa aminopeptydaza alanylowa [Leu5]-enkefalina [Met5]-enkefalina Tyr-Gly Tyr-Gly Hui, 1998 Hui, 1998
Tabela 5.2. Udział enzymów zidentyfikowanych w rozdzielonych frakcjach w procesie degradacji/konwersji
Dyskusja
94
Wpływ modyfikacji NPNA za pomocą glikoli polietylenowych na proces metabolizmu kryptein in vitro
W niniejszej pracy zbadano również wpływ modyfikacji za pomocą różnej długości łańcuchów polimerowych na aktywność kryptein w badaniach in vitro oraz in vivo (testy analgetyczne).
Transport peptydów poprzez barierę krew - mózg jest w organizmie ograniczony, ze względu na słabą przepuszczalność związków polarnych, o dużej masie i wysokim ładunku. Przyłączenie do związków o potencjalnym działaniu farmakologicznym odpowiednio modyfikowanych glikoli polietylenowych zmienia właściwości peptydów [Abuchowski, 1977, Suzuki, 1984]. Pegylowanie kryptein miało na celu zwiększenie ich odporności na działanie enzymów proteolitycznych, a tym samym wzrost okresu półtrwania takiego koniugatu w organizmie, jak również zmianę właściwości hydrofilowo-hydrofobowych modyfikowanych związków w celu umożliwienia przekroczenia bariery krew- mózg.
Krypteiny mają masę nieprzekraczającą 2000 Da, a do ich modyfikacji zastosowano glikole polietylenowe o masie zarówno niższej (PEG1000), jak i wyższej (odpowiednio PEG3000), zgodnie z przeprowadzonymi wcześniej badaniami [Huber, 2003]. Jako, że krypteiny nie posiadają, w przeciwieństwie do peptydu NPFF, amidowanej C-końcowej sekwencji PQRF, założono, że C-koniec nie bierze udziału w procesie wiązania do receptora i ten koniec wybrano do pegylacji. Poza tym, wiele badań potwierdza, że to N-koniec peptydów uwalnianych z endogennych prekursorów odpowiada za specyfikę ich wiązania z receptorem (tzw. domena ”address”), a reszta sekwencji jest konieczna do aktywacji całego peptydu (tzw. domena ”message”) [Goldstein, 1981; Guerrini, 1997].
Modyfikacji za pomocą glikolu polietylenowego dokonano poprzez przyłączanie kolejnych aminokwasów do odpowiednio aktywowanego polimeru zakotwiczonego na żywicy, zgodnie z metodyką syntezy na nośniku stałym. Zaletą tej metody jest przyłączenie jednego łańcucha polimerowego do jednej, C-końcowej grupy karboksylowej. Połączenie polimeru z peptydem w roztworze wymagałoby zastosowania ortogonalnych grup ochronnych dla pozostałych grup –COOH znajdujących się w łańcuchach bocznych aminokwasów. Przyłączenie polimeru do peptydu bezpośrednio na żywicy ogranicza więc ilość etapów samej syntezy i zwiększa jej efektywność. Zastosowane podejście niweluje również problem oczyszczania produktu syntezy z nadmiaru stosowanych reagentów. Podczas syntezy w roztworze kłopotliwe jest zwłaszcza rozdzielenie koniugatu polimeru z peptydem od nadmiaru użytego polimeru, ze względu na niewielką różnicę w masach cząsteczkowych
95 [Knudson, 2006]. Dzięki zastosowanej w niniejszej pracy metodyce, otrzymany produkt można łatwo wyizolować na drodze zwykłej filtracji.
Aktywność kryptein NPNA-PEG1000 i NPNA-PEG3000 określono poprzez badania metabolizmu koniugatów z wyizolowanymi wcześniej frakcjami homogenatu mózgu szczura i porównanie wyników z niemodyfikowanym peptydem NPNA. Obecność produktów hydrolizy pegylowanych peptydów obserwowano jedynie we frakcji 26. Inkubacja pegylowanych kryptein z frakcją 23 i 35 nie wykazała obecności produktów trawienia. Obecny na C-końcu peptydu NPNA glikol polietylenowy na skutek efektu sterycznego hamuje dostępność tego końca dla proteaz, o charakterze karboksypeptydaz, obecnych we frakcji 23. We frakcji 35 na widmie masowym nie obserwuje się powstawania fragmentu 1-3. Jednak metabolizm pegylowanego peptydu jest możliwy, a brak metabolitów na widmie masowym może być konsekwencją ich degradacji za pomocą aminoproteaz zidentyfikowanych w tej frakcji, podobnie jak miało to miejsce w przypadku niemodyfikowanego peptydu NPNA. Trawienie peptydów NPNA-PEG1000 i NPNA-PEG3000
przez proteazy obecne w tej frakcji wykazało powstawanie tylko N-końcowych fragmentów, związanych z hydrolizą wiązania peptydowego po C-końcowej reszcie Trp3,6
(produkty 1-3 oraz 4-6). Nie powstają inne produkty trawienia, które zidentyfikowano w wyniku inkubacji z peptydem NPNA (1-11, 7-11 i 12-15) bez przyłączonej cząsteczki PEG.
Zbadano również wpływ długości łańcucha polimeru (PEG1000 i PEG3000) na szybkość hydrolizy koniugatów poprzez enzymy zawarte we frakcji 26. Potwierdzono zwiększoną odporność na działanie proteaz pod wpływem przyłączonego do peptydu polimeru, która jest tym większa, im dłuższy polimer jest przyłączony do peptydu NPNA.
Badania aktywności pegylowanych kryptein w testach analgetycznych u myszy
Modyfikacja kryptein pochodzenia mysiego NPSS i NPSA za pomocą glikolu polietylenowego, w wyniku podania dokomorowego, wywołuje zmiany w analgezji morfinowej, podobne do tych powodowanych przez niemodyfikowane peptydy NPSS, NPSA oraz NPFF. Obecność łańcucha polimerowego powoduje w przypadku NPSA-PEG3000
niewielki, a w przypadku NPSS-PEG3000, nieznacznie większy wzrost aktywności farmakologicznej. Jest to związane z wymienionymi wcześniej właściwościami pegylowanych związków: większą odpornością na działanie proteaz i zwiększonym okresem
Dyskusja
96 półtrwania koniugatów w organizmie [Abuchowski, 1977; Ho, 1986]. Czas działania pegylowanych peptydów w stosunku do niemodyfikowanych odpowiedników nie jest znacząco dłuższy, co jest prawdopodobnie limitowane okresem działania samej morfiny. Ocena efektów wywołanych przez ten opioid w teście zanurzenia ogona możliwa jest w czasie nie dłuższym niż 120 minut. Czas w którym obserwuje się hamowanie analgezji morfinowej przez pegylowane związki i blokowanie ich efektów przez RF9 był obserwowany również przez 120 minut.
Przeprowadzone badania nie wyjaśniły w pełni mechanizmu działania kryptein. Peptydy NPSS i NPSA nie zawierają bowiem amidowanej C-końcowej sekwencji PQRF, która jest niezbędna w procesie efektywnego wiązania agonistów do receptora NPFF2 [Kotlinska, 2012b], co stawia pytania odnośnie mechanizmu ich działania. W prezentowanej pracy peptydy NPSS i NPSA poddano modyfikacji za pomocą glikolu polietylenowego na ich C-końcu, a mimo to peptydy wykazywały właściwości antyopioidowe. Wskazuje to na udział N-końca kryptein w procesie wiązania do receptora, co determinuje aktywność farmakologiczną koniugatów. Równie ważną rolę spełnia N-koniec w neuropeptydzie FF. Choć amidowany C-koniec peptydu stanowi domenę ”message” i pełni kluczową rolę w procesie efektywnego wiązania agonistów do receptora NPFF, to istotną rolę spełnia również N-koniec tego peptydu [Mazarguil, 2001]. Badania aktywności farmakologicznej oraz powinowactwa do receptorów różnych analogów peptydu NPFF (różniących się długością bądź stopniem modyfikacji reszt aminokwasowych) wykazały, że N-koniec peptydu odgrywa ważną rolę w procesie rozpoznania, wiązania się do receptora, a także jego stymulacji. Utrata czterech N-końcowych hydrofobowych aminokwasów wyraźnie zmniejsza powinowactwo peptydu NPFF (4-8) do receptora. Inny fragment (3-8) wykazuje duże powinowactwo do receptora, a przy tym odwraca analgezję wywołaną działaniem morfiny [Gicquel, 1994].
Przeprowadzone badania nie dostarczają informacji, w jaki sposób krypteiny oddziałują na receptory NPFF. Ostatnie eksperymenty z zastosowaniem linii komórkowej CHO z ekspresją receptorów NPFF ludzkich, wykazały słabe powinowactwo kryptein do receptora NPFF2 pochodzenia ludzkiego [Kotlinska, 2012b]. Sugeruje to istnienie innego, niezidentyfikowanego miejsca w receptorze NPFF, które rozpoznaje N-koniec badanych peptydów. Możliwe jest także, że obserwowany efekt hamowania analgezji morfinowej następuje poprzez inny mechanizm, który jest jednocześnie blokowany przez antagonistę receptora NPFF [Suder 2008; Kotlinska, 2012b].
Badania wpływu peptydu NPSS oraz NPSS-PEG3000 na analgezję morfinową po podaniu obwodowym (i.p.) wykazały, że oba peptydy hamują długotrwale analgetyczne działanie
97 morfiny. Prawdopodobnie oba peptydy: NPSS oraz NPSS-PEG3000 przenikają barierę krew-mózg. Wymaga to jednak potwierdzenia eksperymentalnego z zastosowaniem peptydu znakowanego izotopem promieniotwórczym lub znacznikiem fluorescencyjnym. Znanych jest kilka przykładów, zarówno peptydów (o masie powyżej 600Da) jak i białek, które mogą przechodzić do mózgu na drodze dyfuzji, w ilości wystarczającej do wywołania odpowiedzi OUN, m.in. analogi enkefalin. Zależy to w dużej mierze od ładunku peptydu czy charakteru hydrofilowo-lipofilnego badanego związku [Banks, 2009]. Poza tym opioidy powodują wzrost przepuszczalności BBB, na skutek zaburzenia mechanizmów transportu endogennego. Stawia to pod znakiem zapytania słuszność podejmowania modyfikacji tych peptydów, które prawdopodobnie same docierają do mózgu po podaniu obwodowym. Biorąc jednak pod uwagę wszystkie układy enzymatyczne jakie występują w warunkach fizjologicznych, pegylacja może się okazać właściwym procesem w celu uzyskania stabilności i wydłużenia okresu działania badanych koniugatów.
Badania in vivo pegylowanych kryptein mysich: NPSA-PEG3000 i NPSS-PEG3000
potwierdziły aktywność farmakologiczną peptydów w testach analgetycznych. Wykazano jednocześnie że pegylowana krypteina szczurza NPNA-PEG3000 ulega proteolizie w testach in
vitro, której produktem są 2 tripeptydy pochodzące z N-końca kryptein. Najprawdopodobniej
6 pierwszych aminokwasów krypteiny (odpowiednio SAWGSW dla krypteiny mysiej i NAWGPW dla krypteiny szczurzej) jest niezbędne do wywołania antyopioidowych efektów badanych związków. Potwierdza to również, że N-koniec kryptein bierze udział w procesie wiązania do receptora i jest niezbędny do wywołania efektów antyopioidowych. Należałoby jednak potwierdzić, które konkretnie aminokwasy biorą udział w procesie wiązania ligand – receptor i determinują efekt biologiczny badanych związków. Powinno się w tym celu przeprowadzić serię eksperymentów zależności pomiędzy strukturą peptydów a ich powinowactwem do receptorów i aktywnością (badania SAR). Zaprojektowanie w oparciu o badane krypteiny związków wykazujących selektywność w stosunku do receptora NPFF2 przyczyniłoby się do znacznego rozwoju badań nad mechanizmem wiązania się kryptein do receptora. Ostatnie takie badania przeprowadzono na dipeptydach RF-NH2, wywodzących się z neuropeptydu FF, których N-koniec modyfikowano za pomocą różnych grup funkcyjnych. Badania SAR doprowadziły do odkrycia fenylowej pochodnej RF-NH2 wykazującej wysokie powinowactwo w stosunku do receptora NPFF1, podobne jak innego endogennego liganda, peptydu NPVF. Pochodna fenylowa dipeptydu RF-NH2 w małych dawkach zapobiegała również hiperalgezji spowodowanej przyjmowaniem opioidów [Gealageas, 2012]. Odkrycie
Dyskusja
98 selektywnych ligandów dla każdego podtypu receptora NPFF jest niezwykle ważne w celu poprawy skuteczności przeciwbólowej opioidów [Elhabazi, 2012].
Uzyskane wyniki uzasadniają konieczność dalszych badań nad mechanizmem działania kryptein i ich fragmentów, szczególnie nad modulacyjną rolą tych peptydów na poziomie komórkowym. Interesującym zagadnieniem będzie ustalenie miejsc wiążących te peptydy w układzie nerwowym. Konieczne jest także przeprowadzenie szeregu eksperymentów, które dokładnie ustalą wszystkie aktywne sekwencje znajdujące się w prekursorze NPFFA, co pozwoli na określenie roli całego systemu NPFF w modulowaniu funkcji opioidowych i ewentualnie innych funkcji, pełnionych w organizmie.
99