Analiza objętościowego przejścia fazowego

Badanie wpływu temperatury na stopień spęcznienia, a co za tym idzie rozmiar nanożeli prowadziłam przy pomocy techniki dynamicznego rozpraszania światła. Dokładna analiza zmiany rozmiaru nanożeli od temperatury, mierzona za pomocą promieni hydrodynamicznych (Dh), jest przedstawiona na rysunku 45. Przedstawione zostały wartości Dh znormalizowane względem nanożeli spęczniałych w temperaturze pokojowej (25 °C) w funkcji temperatury.

Wpływ temperatury był zależny od rodzaju formy DNA wprowadzonego do sieci nanożelu.

Zauważyłam, że przejście fazowe pomiędzy stanem spęczniałym a skurczonym dla nanożeli zmodyfikowanych DNA zachodziło w temperaturze 37 °C, podczas gdy dla niezmodyfikowanych nanożeli PNIPA-AAc występowało w 35 °C. Przesunięcie temperatury przejścia fazowego nanożeli po modyfikacji DNA związane było z przesunięciem się

118

równowagi hydrofobowo - hydrofilowej sieci polimerowej, co skutkowało usunięciem wody z jej struktur. Przesunięcie takie jest korzystne z punktu widzenia zastosowania nanożeli do uwalniania substancji leczniczej w temperaturze fizjologicznej. Dla nanożeli PNIPA-AAcoligo123 kurczenie się sieci polimerowej przebiegało nieco później niż dla pozostałych nanożeli zmodyfikowanych DNA. Im wyższy był stopień hybrydyzacji, czyli im dłuższe były dwuniciowe odcinki DNA, tym nanożele ulegały skurczeniu w wyższych temperaturach. Ważne jest również, że nanożele zmodyfikowane kurczyły się finalnie do znacznie mniejszych rozmiarów niż nanożele niezmodyfikowane. Dodatkowo, w zakresie temperatur od 37 do 45 °C następowało dalsze kurczenie się nanożeli, co jest obiecujące pod kątem zwiększonego uwalniania leku w warunkach hipertermii (45 °C). Wszystkie opisane powyżej właściwości sprzyjały zastosowaniu nanożeli modyfikowanych oligonukleotydami jako czułych na temperaturę nośników leków.

25 30 35 40 45 50

Rys. 45. Znormalizowane zmiany Dh dla poszczególnych nanożeli. Rys. wstawiony: zależność rozmiaru w temp fizjologicznej od całkowitego stężenia wprowadzonego DNA w oczyszczonym roztworze/zawiesinie nanocząstek żelu.

Z kolei, na rysunku wstawionym prezentowana jest zależność rozmiaru mierzonego w warunkach temperatury fizjologicznej od stężenia wprowadzonych oligonukleotydów.

Obserwujemy, że wraz ze wzrostem stężenia DNA w sieci polimerowej rozmiar nanożelu maleje. Najmniejszy rozmiar wykazywały nanożele PNIPA-AAcoligo123. Interpretowałam to jako zacieśnianie się łańcuchów sieci polimerowej po dołączeniu się trzeciej nici DNA.

119

Sprawdzono również czy zmiana rozmiaru nanożeli po naprzemiennym grzaniu i chłodzeniu wybranych próbek jest odtwarzalna. W tym celu próbki ogrzewano i chłodzono cyklicznie stosując temperatury 37 - 45 °C. Wyniki pomiarów przedstawione są na rysunku 46.

Analizując przedstawione na rysunku dane widzimy, że każdy cykl temperaturowego grzania i chłodzenia nanożeli był odwracalny. Żele kurczyły się i wracały do swoich początkowych rozmiarów. Najszerszy zakres zmian rozmiarów występował dla nanożeli PNIPA-AAc-oligo123, kolejno dla PNIPA-AAc-oligo12 i PNIPA-AAc. Należy podkreślić, że zmiany temperatury od 37 do 45 °C dla nanożeli PNIPA-AAc-oligo123 nie powodują procesu denaturacji DNA; nie została przekroczona temperatura Tm. Mogą one jednak powodować lokalne zmiany przed denaturacyjne polegające na rozluźnianiu podwójnej nici DNA. Tego typu odziaływania mają korzystny wpływ na uwalnianie z nanożeli zaadsorbowanego w procesie interkalacji leku.

Rys 46. Zmiany promienia hydrodynamicznego Dh w cyklach grzania i chłodzenia nanożeli od temperatury fizjologicznej do 45 °C.

Przeprowadziłam również badania potencjału zeta w funkcji temperatury. Na rysunku 47 zostały przedstawione krzywe obrazujące zmiany potencjału zeta w zakresie temperatur od 25 do 45 °C. Badania te pozwoliły stwierdzić, że zmiany wartości potencjału zeta są ściśle związane ze spadkiem rozmiaru nanożeli w poszczególnych temperaturach, a więc z przejściem fazowym. Wraz ze wzrostem temperatury dla wszystkich badanych nanożeli potencjał zeta przyjmował wartości bardziej ujemne. Natomiast dla nanożeli PNIPA-AAc-oligo123 występował najmniejszy zakres zmian potencjału zeta od temperatury. Sugeruje to, że są one najbardziej odporne na zmianę warunków środowiska. Należy podkreślić, że wszystkie

120

nanożele w zadanych temperaturach posiadają optymalny zakres potencjału zeta (powyżej 20 mV).

Na rysunku wstawionym do rys. 47 została przedstawiona zależność pomiędzy potencjałem zeta a stężeniem oligonukleotydów zawartych w nanożelach. Widzimy, że wraz ze wzrostem stężenia DNA następuje wzrost (w kierunku bardziej ujemnych wartości)

Rysunek wstawiony: zależność potencjału zeta w warunkach fizjologicznych od stężenia wprowadzonego DNA.

Zbadałam również czy zmiany potencjału zeta w cyklach grzania i chłodzenia nanożeli będą miały charakter odwracalny. Na rysunku 48 zestawione są wartości potencjałów zeta dla cykli temperaturowych 37 – 45 °C. Zmiany potencjału zeta po skurczeniu i spęcznieniu nanożeli były odwracalne dla wszystkich typów nanożeli. Dla nanożeli zmodyfikowanych DNA zakres zmian potencjału zeta był znacznie mniejszy niż dla nanożeli niezmodyfikowanych. Dla nanożeli z wprowadzonymi oligonukleotydami obserwujemy mniejsze zmiany potencjału zeta w zakresie badanych temperatur, co świadczy o stabilności struktury nanożeli w tych warunkach.

121

Rys. 48. Zmiany potencjału zeta w cyklach grzania i chłodzenia nanożeli od temperatury fizjologicznej do temperatury 45 °C.

Kolejnym etapem było zbadanie zmian absorbancji nanożeli przy λ= 260 nm po nagłych zmianach temperatury. Na rysunku 49A zostały przedstawione zmiany absorbancji w funkcji czasu po dodaniu równo objętościowych ilości gorącej wody do danej próbki nanożelu.

Obserwowałam szybki wzrost absorbancji spowodowany kurczeniem się nanożelu, a co za tym idzie mętnieniem i utratą przejrzystości próbki. Zaobserwowałam, że po pewnym czasie próbki wracały do początkowego stanu; faktyczna absorbancja była o połowę niższa, ponieważ następowało rozcieńczenie roztworu. Zakres czasu, w którym następował proces rozkurczania się był inny dla poszczególnych typów nanożeli. Proces pęcznienia i powrotu do wartości początkowej nastąpił po 10 minutach dla nanocząstek PNIPA-AAc i PNIPA-Acc-oligo12 oraz po 8 minutach dla nanocząstek NPP PNIPA-AAc-oligo123. Obecność trzysegmentowej hybrydy w nanożelu PNIPA-AAc-oligo123 spowodowała szybszą przemianę fazową ze stanu skurczonego do stanu rozpęczniałego. Dane te nie pozwalają jednak na dokładną ocenę zmian, jakie zaszły w strukturze DNA. W uzyskanym zakresie temperatur możliwe było lokalne rozplatanie nici DNA. Natomiast powrót absorbancji do stanu początkowego sugeruje, że jeśli zaszły jakieś zmiany struktury podwójnej nici DNA to były one odwracalne.

122 absorbancji trzysegmentowej hybrydy DNA w temperaturze 70° C w nanożelu i w roztworze.

Aby ocenić jak zachowuje się trzysegmentowa hybryda DNA wbudowana w nanożel po zastosowaniu wysokiej temperatury (powyżej temperatury topnienia oligonukleotydów tj.

70 °C) przeprowadzono specjalny eksperyment. Wyniki jego zostały przedstawione na rysunku 49B. Roztwory były podgrzewane do zadanej temperatury bez ich rozcieńczania. Dla porównania, proces ten został przeprowadzony dla takiej samej hybrydy DNA jednak utworzonej w roztworze. Wyniki sugerują, że w żelu może następować regeneracja dwuniciowej formy hybrydy, gdyż następuje nagły wzrost absorbancji. Jednak po pewnym czasie wraca ona do stanu początkowego. Inaczej jest w roztworze gdzie po podgrzaniu do 70° C absorbancja nie wraca do stanu początkowego tylko przyjmuje wyższe wartości. Wyniki tych pomiarów w nanożelach były powtarzalne w kolejnych cyklach ogrzewania i chłodzenia.

Powyższe wyniki pozwalają dojść do wniosków, że podczas podgrzewania nanożeli nie zachodzą nieodwracalne zmiany w strukturze DNA. Mogą występować jedynie lokalne zmiany przeddenaturacyjne pozwalające na rozluźnienie nici, a co za tym idzie łatwiejsze uwolnienie zakumulowanego w niej leku.

9.1.4. Morfologia

Kolejnym etapem badań było porównanie morfologii zsyntezowanych nanomateriałów.

Zmiany po modyfikacji oligonukleotydami były widoczne tuż po syntezie poprzez obserwację wzrokową. Nanożele zmodyfikowane oligonukleotydami wykazywały większą transparentność w stosunku do nanożeli niezmodyfikowanych. Zmniejszenie zmętnienia roztworów nanożeli z wprowadzonymi odcinkami DNA spowodowane było zwiększoną akumulacją wody w sieci polimerowej, co możemy zaobserwować na rysunku nr 50A.

123

Aby uzyskać dokładny obraz analizowanych obiektów zastosowałam skaningową mikroskopię elektronową. Na rysunku 50B można zobaczyć zdjęcia SEM nanosystemów z pojedynczymi oraz podwójnymi nićmi DNA. Próbki oglądano po delikatnej liofilizacji oraz napyleniu stopem pallad/złoto. Kształty analizowanych nanożeli są podobne. Jednak nanocząstki PNIPA-AAcoligo12 wydają się być bardziej kuliste i jednorodne w porównaniu z nanocząstkami PNIPA-AAcoligo123. Związane może być to z tym, iż kształt nanożeli nieznacznie się zmienia po procesie hybrydyzacji i wprowadzeniu nici komplementarnej.

Drugim ważnym parametrem, który możemy oszacować ze zdjęć jest rozmiar nanożeli.

Pokrywa się on z rozmiarem mierzonym techniką DLS. Zakładamy jednak, że obrazowane nanożele znajdują się w stanie częściowo spęczniałym w związku z metodą liofilizacji, która powoduje, że część skrystalizowanych cząsteczek wody jest nadal obecna w nanożelu.

Więcej szczegółów na temat struktury wewnętrznej nanożeli uzyskano analizując mikrogramy transmisyjnej mikroskopii elektronowej, patrz rys. 50C-50E. Ze względu na proces przygotowywania próbek polegający na suszeniu ich w temperaturze 50 °C, a przez co znacznie niższą zawartość wody niż w próbkach liofilizowanych, rozmiary nanożeli w technice TEM ukazywały stan skurczony. Próbki przygotowywane były na siatkach poprzez nakrapianie i suszenie, a następnie były kontrastowane poprzez naniesienie 1% roztworu octanu uranylu.

Udowodnione jest, że jony UO²⁺dobrze oddziałują z grupami –COOH obecnymi w sieci nanożelu jak i z grupami fosforanowymi kwasów nukleinowych. Na zdjęciach TEM widzimy, że nanocząstki zmodyfikowane DNA są bardziej skontrastowane (ciemniejsze), co świadczy o większej akumulacji jonów uranylu w stosunku do nanożeli niezmodyfikowanych. Można zauważyć również, że nanocząstki PNIPA-AAc mają znacznie gładszą powierzchnię niż nanocząstki zmodyfikowane oligonukleotydami. Obecność pojedynczych nici DNA gwarantowała równomierne rozmieszenie jonów uranylu w nanożelu (rys. 50D). Jednak po dołączeniu nici komplementarnej dystrybucja DNA ulegała rozproszeniu i tworzeniu dwuniciowej struktury w powierzchniowej warstwie nanocząstki. Nastąpiło również tworzenie się otoczki hydratacyjnej związanej z obecnością wiązań wodorowych powstałych w skutek utworzenia podwójnej nici DNA.

124 PNIPA-AAc

A B

C

PNIPA-AAc-oligo123 PNIPA-AAc-oligo12 PNIPA-AAc-oligo123

100 nm 50 nm

200 nm 100 nm

D E

PNIPA-AAc PNIPA-AAc-oligo12

PNIPA-AAc-oligo12

Rys. 50. (A) Porównanie wyglądu nanożeli PNIPA-AAc i nanożeli PNIPA-AAc z unieruchomionymi odcinkami nici oligo1 i oligo2, T = 25 ° C. (B) Mikrografy SEM nanocząstek PNIPA-AAc-oligo12 i PNIPA-AAc-oligo123, uzyskane po łagodnej liofilizacji roztworu nanożeli. (C) Mikrografy TEM nanocząstek PNIPA-AAc. (D, E) Mikrografy TEM PNIPA-AAc-oligo12 i PNIPA-AAc-oligo123.