W niniejszej pracy doktorskiej podjęłam się zadania stworzenia systemów uwalniania leków opartych na hydrożelach zmodyfikowanych materiałem genetycznym w różnych formach. Bezpośrednim celem pracy była dokładana analiza fizykochemiczna zsyntezowanych nośników oraz zbadanie akumulacji i uwalniania wybranego leku przeciwnowotworowego.
W swojej pracy zsyntezowałam makrożele oraz nanożele. Ze względu na korzystniejsze cechy nośników w skali nano, większa część mojej pracy skupia się właśnie na nanohydrożelach.
W badaniach wykorzystano zjawisko objętościowego przejścia fazowego i jego zmianę pod wpływem dodatku oligonukleotydów. Istotne było uwalnianie leku w warunkach fizjologicznych. Badane były również zmiany zachodzące w niciach DNA przyłączonych do matrycy polimerowej pod wpływem zmiennych warunków środowiskowych. Zsyntezowałam nanożele o przedłużonym uwalnianiu substancji, nanożele degradowalne pod wpływem temperatury oraz nanożele multiresponsywne, czułe na glutation. Praca zawiera dokładną
176
doświadczalną i teoretyczną analizę procesu uwalniania leku z otrzymanych matryc polimerowych.
Rozprawa rozpoczyna się wstępem oraz celem badań, następnie występuje część literaturowa. W rozdziale drugim zawarłam wprowadzenie w tematykę nośników leków oraz przedstawiłam pokrótce różne rodzaje nośników leków opisane w literaturze. W rozdziale trzecim przybliżyłam definicję oraz charakterystykę objętościowego przejścia fazowego hydrożeli polimerowych ze szczególnym uwzględnieniem hydrożeli czułych na bodźce zewnętrzne. Przestawiłam również dokładną analizę hydrożeli czułych na temperaturę, pH oraz substancje biologicznie aktywne takie jak: glukoza, enzymy czy glutation. Na koniec skupiłam się na opisaniu dotychczasowych prac przedstawiających modyfikację hydrożeli molekułą DNA.
W rozdziale czwartym przybliżyłam dokładnie tematykę hydrożeli w skali nano oraz przedstawiłam ich zalety w stosunku do ich makro odpowiedników. W tej części pracy skupiłam się również na teoretycznym opisie najczęściej stosowanych metod syntezy oraz modyfikacji nanożeli materiałem biologicznym.
W rozdziale piątym opisałam rolę DNA w systemach kontrolowanego uwalniania leków.
Została tutaj dokładnie opisana budowa cząsteczki kwasu nukleinowego, czynniki wpływające na zmiany jego struktury oraz oddziaływania z lekami antracyklinowymi. Opisałam również różne metody detekcji DNA ze szczególnym naciskiem na omówienie metod elektrochemicznych.
Część eksperymentalna składa się z pięciu rozdziałów. Na początku znajduje się szczegółowy opis oraz charakterystyka wykorzystanych w pracy odczynników i aparatury.
Następnie opisałam dość szczegółowo techniki badawcze stosowane przeze mnie w pracy doświadczalnej.
W rozdziale ósmym opisałam początkowe etapy mojej pracy badawczej związanej z modyfikacją hydrożeli biomolekułą DNA w skali makro. Przedstawiłam tutaj dokładnie proces syntezy oraz oczyszczania hydrożeli z niekowalencyjnie związanym natywnym DNA.
Zbadana została wydajność wprowadzania podwójnych oraz pojedynczych nici DNA do sieci oraz morfologia powstałych matryc. Ważnym etapem w tej części pracy była dokładna analiza zmian zachodzących w DNA wprowadzonego do hydrożelu za pomocą metod elektrochemicznych. Udowodniono, że techniki elektrochemiczne pozwalają na bezpośrednie monitorowanie lokalnych zmian strukturalnych w DNA związanych z rozluźnianiem nici i zmianą konformacji. Ważnym krokiem było monitorowanie zmian utleniania zasad azotowych w DNA obecnych w hydrożelu w zależności od temperatury. Końcowym efektem
177
pracy była analiza akumulacji i uwalniania leku pod wpływem bodźca temperaturowego.
Podstawową ideą tego typu nośników było wykorzystanie nici DNA obecnej w hydrożelu jako rezerwuaru leku zakumulowanego na drodze interkalacji. Wyniki uzyskane w tej części pracy stały się podstawą do utworzenia bardziej złożonych układów i zminiaturyzowania nośników tworząc nanożele polimerowe.
Rozdział dziewiąty jest obszerny, ponieważ zawiera większość moich wyników eksperymentalnych. W tym rozdziale skupiłam się na syntezie nanożeli na bazie monomeru NIPA oraz kwasu akrylowego. Nanożele były zmodyfikowane różnymi formami DNA.
Materiał genetyczny w tym przypadku był włączany do sieci za pomocą wiązań kowalencyjnych pomiędzy ugrupowaniami obecnymi w nanożelu a odpowiednio zmodyfikowanymi (grupy akrylowe, ugrupowanie PEG2000) odcinkami DNA. Rozdział ten składa się z trzech podrozdziałów opisujących trzy niezależne rodzaje nanożeli zmodyfikowane oligonukleotydami w różny sposób.
Pierwszy podrozdział dotyczy nanożeli sieciowanych standardowym środkiem sieciującym BIS i modyfikowanych hybrydą DNA składającą się z dwóch odcinków przyłączonych do sieci i trzeciego komplementarnego w połowie do dwóch obecnych już w sieci. Synteza była prowadzona dwuetapowo. Przed wyborem konkretnych sekwencji nici DNA zostały przeprowadzone symulacje, które określiły prawdopodobieństwo hybrydyzacji.
Ważnym etapem w tym rozdziale była dokładna analiza parametrów fizykochemicznych nanożeli oraz zbadanie ich morfologii. Przeprowadzona została również dokładana analiza wydajności wprowadzenia DNA oraz jego hybrydyzacji; wykorzystano tu metody spektroskopowe oraz elektrochemiczne. Najważniejszym etapem badań, pod kątem aplikacyjnego zastosowania tego typu nanożeli, była analiza akumulacji i uwalniania leku przeciwnowotworowego. Wykazano, że tego typu układy charakteryzują się przedłużonym w czasie uwalnianiem substancji leczniczej. Badania komórkowe wykazały natomiast dobrą biokompatybilność nośników oraz wysoką skuteczność niszczenia komórek nowotworowych linii Hella i Insulinoma.
W podrozdziale drugim skupiłam się na syntezie nanożelu, który byłby degradowany pod wpływem wysokiej temperatury. Zsyntezowałam nanożele usieciowane jedynie trzysegmentową hybrydą DNA. Do syntezy zostały użyte te same sekwencje oligonukleotydów, co w poprzednim projekcie, jednak cały proces syntezy był jednoetapowy.
W tej sekcji została przedstawiona dokładnie synteza, morfologia oraz dokładna analiza parametrów fizykochemicznych uzyskanych nanożeli. Został również przenalizowany proces temperaturowej degradacji sieci spowodowany denaturacją trzysegmentowej hybrydy
178
wbudowanej w sieć hydrożelu. Wykazano dwie drogi uwalniania leku w temperaturze 45 °C oraz 70 °C. Dodatkowo udowodniono, że zmiana środowiska reakcji na lekko kwaśne (charakterystyczne dla tkanek nowotworowych) ma również wpływ na ilość uwalnianego leku.
Przeprowadzone badania komórkowe wykazały, że zarówno nanożele jak i produkty ich temperaturowej degradacji były bezpieczne dla komórek organizmu. Natomiast testy cytotoksyczności naładowanych doksorubicyną nośników wykazały wysoką skuteczność niszczenia komórek nowotworowych linii Insulinoma.
Ostatni podrozdział przedstawiał nieco inną koncepcję. Skupiłam się tutaj na syntezie nanożeli czułych na kilka rodzajów bodźców jednocześnie. Zostały zsyntezowane nanożele modyfikowane kowalencyjnie odcinkami DNA zawierającymi w swojej strukturze mostki disiarczkowe. Zastosowanie tego typu oligonukleotydów uwrażliwiało dodatkowo cząstki nanożelu na obecność silnych środków redukujących takich jak glutation. Pod wpływem glutationu następowało rozszczepienie nici DNA z jednoczesnym uwolnieniem leku.
Przeprowadzone w tej części badania potwierdziły dynamiczną reorganizację struktury DNA w syntezowanym nanożelu oraz utworzenie otoczki oligonukleotydowej na rdzeniu polimerowym. Wykazano, że procesy zachodzące w nanożelach są pomocne w skutecznym i kontrolowanym uwalnianiu leku oraz częściowej dezintegracji nanożelu. Współdziałanie zmian konformacyjnych rozluźniających strukturę DNA pod wpływem temperatury oraz redukacji grup disiarczkowych skutkowało zwiększoną wydajnością podczas pulsacyjnego uwalniania leku i zwiększonym uwalnianiem leku w komórkach nowotworowych.
Przeprowadzone badania komórkowe dają nadzieje, że dzięki obecności nanohydrożelowego nośnika zminimalizowane zostaną negatywne efekty wiązania doksorubicyny przez białka osocza. Niewątpliwie zwiększyła się skuteczność niszczenia komórek nowotworowych linii Insulinoma.
W rozdziale dziesiątym zostały przedstawione końcowe wnioski pracy doktorskiej i potwierdzenie skuteczności zsyntezowanych nośników pod kątem zaawansowanych terapii przeciwnowotworowych.
W pracy przedstawiony został również spis publikacji powstałych podczas realizacji mojej pracy doktorskiej. Natomiast w końcowym rozdziale przedstawiłam literaturę, z której korzystałam podczas pisania niniejszej rozprawy.
179