Jednym z głównych celów współczesnej biomedycyny jest poszukiwanie nowych rozwiązań w terapii przeciwnowotworowej ograniczających toksyczność leków względem komórek zdrowych, a także ukierunkowanie badań na bezpośrednie podawanie leków do komórek nowotworowych. Aby ten cel osiągnąć, stosując znane i przebadane już terapie nowotworowe, konieczne jest stosowanie odpowiedich nośników leków.
Wśród wielu rodzajów nośników „inteligentne hydrożele,” ze względu na duże możliwości chłonięcia płynów, a przez to podobną strukturę do tkanek ludzkich, ale przede wszystkim na czułość środowiskową, mogą być dobrym materiałem do konstrukcji kontrolowanych systemów dostarczania leków. Modyfikacja hydrożeli materiałem biologicznym daje możliwość kontroli ich właściwości pod wpływem nowych czynników i wpływa bezpośrednio na ich biokompatybilność. DNA jako uniwersalny materiał budulcowy, posiadający zdolność zaprogramowanego parowania zasad, jest szeroko stosowany przez naukowców pod kątem tworzenia naturalnych biomateriałów. Dlatego też połączenie hydrożeli i oligonukleotydów może być dobrym kierunkiem w projektowaniu nowoczesnych systemów uwalniania leków.
Kontrolowane wywoływanie zmian strukturalnych w cząsteczkach DNA przyłączonych do sieci hydrożelu daje duże możliwości uwalniania leku pod wpływem różnorodnych bodźców środowiskowych. Dodatkowo, możliwość akumulacji cząsteczek leków na drodze interkalacji w helisie DNA pozwala na zwiększenie ilości leku zawartego w nośniku. Zależna od sekwencji zasad dynamiczna struktura nici DNA daje możliwość jej samoorganizacji, hybrydyzacji oraz denaturacji w zależności od środowiska, w jakim się znajduje.
Podstawowym celem mojej pracy doktorskiej była synteza i badanie właściwości wybranych nośników leków przeciwnowotworowych. Skupiłam się na syntezie materiałów hydrożelowych w skali makro i nano. Materiały żelowe modyfikowałam oligonukleotydami.
Analizie poddane zostały takie parametry nośników jak wydajność akumulacji i szybkość uwalniania substancji leczniczej.
Matrycą w układzie hydrożelowym był poli(N-izopropyloakryloamid) (PNIPA) zmodyfikowany kwasem akrylowym (AAc). Dzięki tej modyfikacji uzyskałam wyższe temperatury przejścia fazowego (VPT); zbliżone do temperatur fizjologicznych. Jednocześnie dodatek oligonukleotydów, jako silnie hydrofilowych składników, przesuwał również temperaturę VPT w kierunku wyższych wartości.
Głównym celem dokonanych modyfikacji żeli była zwiększona wydajność akumulacji leków-interkalatorów pomiędzy pary zasad dwuniciowej formy DNA. Istotne były również
11
odziaływania elektrostatyczne i powinowactwo leku do konkretnych par zasad. Użyte w matrycach polimery: akryloamidu oraz N-izopropyloakryloamidu posiadają możliwość chłonięcia dużych ilości rozpuszczalnika, co było pożądanym efektem uwzględnionym w projektowaniu nośników leków. Proste, niezmodyfikowane formy hydrożeli syntezowane w projekcie posiadają niski współczynnik akumulacji leków antracyklinowych. Wprowadzenie molekuł DNA zapewniło utworzenie miejsc wiązania się leku za pomocą niekowalencyjnej interakcji takiej jak interkalacja. Interkalacja pozwoliła na zwiększenie ilości leku wewnątrz nośnika; spowodowała również wydłużenie procesu uwalniania substancji leczniczej.
Mechanizm uwalniania leku z nośnika był wyzwalany za pomocą bodźców zewnętrznych.
Testowane były różne czynniki środowiskowe, których zmiana powodowała uwalnianie leku.
Te czynniki to temperatura, pH i obecność środka redukującego (np. glutationu). Przebadano różne warianty modyfikacji nanożeli obejmujące modyfikacje typu chemicznego i fizycznego.
Moim pierwszym zadaniem badawczym było zsyntezowanie hydrożeli w skali makro i ich fizykochemiczna modyfikacja natywną formą DNA. Modyfikacje te miały na celu udowodnienie, że możliwe jest trwałe wprowadzenie DNA do sieci hydrożelu w oparciu o oddziaływania elektrostatyczne. Planowałam badania związane z analizą procesu elektroutleniania zasad azotowych będących wewnątrz nanożelu jak i badanie zmian zachodzących w strukturze DNA pod wpływem zmiennych warunków środowiskowych.
Nadrzędnym celem było użycie tego typu matryc, jako nośników do akumulacji i uwalniania leków przeciwnowotworowych uwalnianych pod wpływem wzrostu temperatury.
Kolejnym etapem moich badan była synteza hydrożeli w skali nano. Nanożele ze względu na swoje niewielkie rozmiary charakteryzują się znacznie szybszą odpowiedzią na bodźce niż ich odpowiedniki w skali makro. Dzięki swoim małym rozmiarom mogą z łatwością penetrować tkanki i docierać bezpośrednio do celu. Daje to duże możliwości manipulacji ich właściwościami pod kątem uwalniania leków. Dlatego też w dalszej części mojej pracy skupiłam się na układach nano.
Pierwszy rodzaj zsyntezowanych przeze mnie nanonośników to nanożele z wprowadzonymi kowalencyjnie odcinkami DNA tworzącymi układ trzysegmentowej hybrydy przy zastosowaniu standardowo używanych środków sieciujących. Modyfikacje te miały na celu zmianę właściwości fizykochemicznych sieci polimerowej a co za tym idzie poprawienie akumulacji i uwalniania leków. Zakładałam, że tego typu materiały będą wykazywać przedłużone uwalnianie leku spowodowane odziaływaniem z podwójną nicią DNA.
12
Kolejnym zadaniem badawczym było stworzenie nano/mikro żeli degradowalnych pod wpływem działania podwyższonej temperatury. Założyłam, że oligonukleotydy będą pełniły funkcję środka sieciującego dodawanego bezpośrednio podczas syntezy, a proces hybrydyzacji będzie zachodził jednocześnie z procesem polimeryzacji sieci. Stworzenie tego typu układu miało na celu szybkie uwalnianie dużej ilości leku pod wpływem czynnika temperaturowego, powodującego skurczenie sieci hydrożelu i denaturację podwójnej nici DNA.
Ostatnim celem mojej pracy badawczej była synteza nanożeli zmodyfikowanych oligonukleotydami posiadającymi zdolność do rozkładu pod wpływem czynników redukujących takich jak glutation. Otoczenie komórek nowotworowych posiada dużo wyższe stężenie glutationu niż komórek zdrowych. Dlatego też wprowadziłam dodatkowy czynnik stymulujący wyższe uwalnianie leku w warunkach zbliżonych do panujących w komórkach nowotworowych (obniżone pH, wysokie stężenie glutationu). Nanożele zsyntezowane w ten sposób były jednocześnie wrażliwe na trzy rodzaje bodźców: temperaturę, pH i obecność glutationu. Podwyższenie temperatury stymulowało dodatkowo uwalnianie leku, co wykorzystano przy sterowanym pulsami temperaturowymi uwalnianiu leku.
13
C ZĘŚĆ T EORETYCZNA
14