Aparatura

Analizę związków chemicznych techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej wykonuje się przy użyciu chromatografów cieczowych. Schemat chromatografu cieczowego przedstawiono na rysunku 31. Podstawowymi częściami każdego chromatografu cieczowego są:

• zbiornik fazy ruchomej, • pompa,

• dozownik, • kolumna, • detektor,

171 • komputer lub rejestrator.

Zasada działania chromatografu cieczowego jest następująca. Faza ruchoma jest pobierana przez pompę (3) ze zbiorników (1 lub/i 2) i następnie tłoczona pod ciśnieniem poprzez dozownik (4) do kolumny chromatograficznej (5) i dalej do detektora (6). Próbkę (x) w postaci roztworu wprowadza się do strumienia fazy ruchomej w dozowniku. Składniki próbki wraz z fazą ruchomą przedostają się do kolumny, gdzie są rozdzielane, po czym trafiają wraz z fazą ruchomą do detektora. Detektor wykrywa składniki próbki w fazie ruchomej i wysyła sygnał do komputera (7), w którym jest on zapisywany w postaci pików chromatograficznych, tworząc chromatogram (8). Kolumna dodatkowo może być umieszczana w termostacie.

Rysunek 31. Schemat blokowy chromatografu cieczowego HPLC. 1, 2 – zbiorniki składników fazy ruchomej, 3 – pompa, 4 – dozownik, 5 – kolumna, 6 – detektor, 7 – komputer lub rejestrator (linia zielona pokazuje drogę fazy ruchomej, linia czerwona – drogę rozdzielanej próbki; obie drogi łączą się

w dozowniku)

Chromatografy cieczowe są wyposażone w dozowniki umożliwiające wprowadzenie ciekłych próbek pod ciśnieniem atmosferycznym do kolumny, w której panuje zwiększone ciśnienie nawet rzędu kilkudziesięciu MPa. Próbkę dozuje się przy użyciu szklanej mikrostrzykawki (rysunek 32), której igła ma tępo zakończony koniec.

Rysunek 32. Mikrostrzykawka do odmierzania małych objętości cieczy (Uwaga! Koniec igły mikrostrzykawki stosowanej do dozowania próbki w HPLC jest tępo zakończony)

!

Próbka Tłoczek Igła strzykawki x 8 6 7 5 1 2 4 3

172

Najczęściej stosuje się sześciodrożne zawory dozujące (rysunek 33). Kierunek przepływu fazy ruchomej przez dozownik zależy od położenia dźwigni zaworu:

• pozycja A (LOAD) – faza ruchoma omija pętlę dozującą, można ją przepłukać i napełnić za pomocą szklanej mikrostrzykawki; w pętli panuje ciśnienie atmosferyczne,

• pozycja B (INJECT) – faza ruchoma przepływa przez pętlę dozującą i zabiera ze sobą znajdującą się w pętli próbkę wprowadzając ją jednocześnie do kolumny; jest to początek analizy chromatograficznej.

Ciekawą animację pokazującą proces dozowania próbki na kolumnę za pomocą zaworu dozującego można obejrzeć w Internecie: http://www.restek.com/info_sixport.asp

Rysunek 33. Dozownik HPLC – zasada działania; (a) - wprowadzanie próbki za pomocą mikrostrzykawki do pętli oraz (b) - dozowanie do kolumny

Kolumna chromatograficzna jest zasadniczym elementem chromatografu – w niej zachodzi proces rozdzielenia składników wprowadzonej próbki. Kolumny stosowane w HPLC są wykonane ze stali i fabrycznie wypełnione fazą stacjonarną (rysunek 34). Używane są kolumny o różnych wymiarach, najczęściej o długości od 10 do 30 cm i o średnicy od 4 do 5 mm. Cząstki wypełnienia kolumny mają zazwyczaj średnicę około 3 do 6 µm. Współcześnie jednak coraz popularniejsze stają się zminiaturyzowane formy kolumn chromatograficznych, zwłaszcza przy zastosowaniu tzw. ultrasprawnej chromatografii cieczowej (UPLC), gdzie długość kolumn nie przekracza 2,5 cm, a cząstki wypełnienia mają średnicę poniżej 2µm.

173

Rysunek 34. Kolumny HPLC

W chromatografii cieczowej stosuje się różne typy detektorów do wykrywania określonych grup związków chemicznych. Są to przede wszystkim detektory spektrofotometryczne. Ich zasada działania polega na rejestrowaniu różnicy właściwości fazy ruchomej oraz poszczególnych składników chromatografowanej próbki. Faza ruchoma opuszczając kolumnę chromatograficzną przepływa przez przepływową komórkę pomiarową w detektorze. Pojemność takiej komórki jest bardzo mała, rzędu 0,01 – 10 µl.

Najczęściej stosowanym detektorem jest detektor spektrofotometryczny UV. Mierzy on absorpcję promieniowania w zakresie UV/Vis zgodnie ze znanym prawem Lamberta-Beera:

bc

I

I = ₀⋅10^−ε (55)

gdzie:

I – natężenie promieniowania po przejściu przez komórkę pomiarową detektora, I0 – natężenie promieniowania przed komórką pomiarową detektora,

ε – współczynnik absorpcji,

b – długość celki pomiarowej,

c – stężenie badanej substancji w fazie ruchomej w komórce pomiarowej detektora.

Detektor rejestruje bezpośrednio absorbancję A i podaje ją jako wartość bezwymiarową:

I I A 0 log = (56) gdzie: A – absorbancja,

I – natężenie promieniowania po przejściu przez komórkę pomiarową detektora, I0 – natężenie promieniowania przed komórką pomiarową detektora.

Warunkiem stosowania detektora spektrofotometrycznego UV jest zdolność badanych substancji do pochłaniania promieniowania UV. Absorpcja promieniowania z zakresu UV/Vis przez cząsteczkę związku chemicznego związana jest z przejściami elektronów wiązań pojedynczych (σ), wiązań wielokrotnych (π) oraz elektronów wolnych par elektronowych (n) z orbitalu o niższej energii na wolny orbital o wyższej energii. Przejścia elektronów wiązań pojedynczych (σ → σ*) wymagają najwyższej energii, która odpowiada zakresowi fal poniżej 200 nm. W detektorach UV nie

174

wykorzystuje się zakresu promieniowania poniżej 190 nm, gdyż wymagałoby to układu próżniowego. W detektorach takich wykorzystuje się natomiast absorpcję promieniowania przez ugrupowania chromoforowe. Typowymi chromoforami są sprzężone wiązania podwójne węgiel i węgiel-heteroatom oraz ugrupowania aromatyczne, w których pochłanianie energii w zakresie UV/Vis związane jest z przejściami elektronów π oraz n na orbital π^*.

Aby możliwe było przeprowadzenie pomiaru detektorem UV/Vis w chromatografii cieczowej, faza ruchoma nie powinna absorbować promieniowania przy zastosowanej długości fali.

Najprostsze detektory umożliwiają wykrywanie rozdzielanych związków przy jednej długości fali – 254 nm, natomiast inne umożliwiają płynną regulację długości fali w zakresie UV/Vis. Popularne są również detektory z matrycą fotodiodową (ang. diode array detector, DAD). Detektor DAD umożliwia rejestrację całego widma badanej substancji w trakcie jej przechodzenia przez detektor, dzięki czemu można ją zidentyfikować.

Detektor spektrofotometryczny UV jest niewrażliwy na zmiany przepływu fazy ruchomej i zmiany temperatury. Może być także stosowany w elucji gradientowej.

Detektor refraktometryczny jest detektorem uniwersalnym. Wykonuje nim się pomiar różnicy między współczynnikiem załamania światła fazy ruchomej oraz rozdzielanych substancji. W detektorze refraktometrycznym znajdują się dwie komórki pomiarowe:

• przez jedną przepływa „czysta” faza ruchoma (eluent),

• przez drugą przepływa faza ruchoma opuszczająca kolumnę zawierająca substancje rozdzielane (eluat z kolumny).

Im większa jest różnica współczynników załamania światła między fazą ruchomą a substancją, tym lepsza jest czułość detektora. Im większe stężenie substancji rozdzielanej, tym większa różnica współczynników załamania światła i tym większy sygnał z detektora.

Detektor refraktometryczny może być stosowany jedynie w elucji izokratycznej, w elucji gradientowej ciągła zmiana składu fazy ruchomej powodowałaby ciągłą zmianę współczynnika załamania światła. Zmienność wartości współczynnika załamania światła powodują również zmiany przepływu fazy ruchomej i zmiany temperatury, dlatego detektor refraktometryczny musi być termostatowany. Detektory refraktometryczne stosuje się między innymi do analiz węglowodanów. Detektor konduktometryczny (przewodnościowy) stosuje się do detekcji związków obdarzonych ładunkiem. Detektor konduktometryczny mierzy zmiany przewodnictwa eluatu w porównaniu z eluentem, czyli „czystą” fazą ruchomą. Pomiar polega na zmierzeniu przewodności cieczy znajdującej się pomiędzy dwoma elektrodami, do których podłącza się zmienne napięcie. Przewodność właściwa jest liniową funkcją stężenia rozcieńczonego elektrolitu i dlatego detektor konduktometryczny znalazł zastosowanie w chromatografii jonowej. Zgodnie ze znanym prawem Kohlrauscha, przewodność elektryczna rozcieńczonych roztworów elektrolitów jest sumą przewodności poszczególnych jonów w roztworze pomnożonych przez ich wartościowości i stężenia:

∑ = 1000 0 i c i z i

λ

κ

₍₅₇₎ gdzie: κ – przewodność właściwa [µS/cm], λ0

175

zi – wartościowość jonu,

ci – stężenie molowe jonu [mol/L].

W dokumencie Techniki separacyjne (Stron 170-175)