Chromatografia cienkowarstwowa

Termin chromatografia cienkowarstwowa (TLC) został wprowadzony przez E. Stahla w 1956 i oznacza proces chromatograficzny prowadzony na cienkiej warstwie fazy stacjonarnej, naniesionej na podłoże z płytek szklanych lub z folii aluminiowych czy polimerowych (por.roz. III.1.1, rysunek 2). TLC jest rodzajem chromatografii cieczowej planarnej.

Zaletą chromatografii cienkowarstwowej jest przede wszystkim możliwość analizy substancji nielotnych lub o małej lotności, zarówno substancji niepolarnych, polarnych lub o średniej polarności, a także w formie zjonizowanej. Jednak przede wszystkim głównymi zaletami tej techniki wciąż pozostają prostota i niska cena sprzętu, niewymagającego dostępu do elektryczności. Warunki analiz TLC mogą być łatwo modyfikowane z możliwością stosowania realtywnie reaktywnych rozpuszczalników jak i próbek, co jest ograniczeniem w chromatografii kolumnowej (niektóre próbki czy reaktywne rozpuszczalniki mogą zniszczyć lub uszkodzić kolumnę GC lub HPLC). Kolejną zaletą jest również łatwość detekcji, dzięki której wszystkie składniki próbki mogą być monitorowane, co jest ważne przy sprawdzaniu czystości próbki. Obecnie chromatografię cienkowarstwową stosuje się powszechnie w:

Wzrost zawartości wody w fazie ruchomej powoduje wydłużenie czasów retencji związków rozdzielanych i odwrotnie – wzrost zawartości modyfikatora organicznego (metanolu lub acetonitrylu) w fazie ruchomej powoduje skrócenie czasów retencji związków rozdzielanych w chromatografii w odwróconym układzie faz.

Elucja izokratyczna jest to rodzaj elucji, podczas której skład jakościowy i ilościowy fazy ruchomej pozostaje stały.

Elucja gradientowa jest to rodzaj elucji, w którym skład fazy ruchomej zmienia się w sposób ciągły lub stopniowo.

154

• analizie farmaceutycznej, głównie przy identyfikacji analitów, testach czystości, oznaczaniu składników aktywnych, pomocniczych i konserwantów oraz kontroli procesu produkcji,

• analizie medycznej, kryminalistycznej i biochemicznej przy oznaczaniu aktywnych substancji i ich metabolitów w matrycach biologicznych oraz przy diagnostyce chorób,

• analizie kosmetycznej przy analityce surowców i produktów, konserwantów, środków powierzchniowo-czynnych, kwasów tłuszczowych, składników perfum i innych,

• analizie żywności przy oznaczaniu pestycydów i środków grzybobójczych w wodzie pitnej, oznaczaniu substancji zakazanych w warzywach, mięsie, oznaczaniu witamin i innych,

• analizie zanieczyszczeń środowiska (sporadycznie). 2.2.2. Proces chromatograficzny

Proces chromatograficzny przeprowadza się w odpowiednich komorach chromatograficznych (rysunek 20). Próbkę nanosi się na płytkę TLC w postaci roztworu o bardzo małej objętości, tworząc małą plamkę w punkcie startowym (rysunek 2). Płytki umieszcza się w komorze chromatograficznej, w której na dnie znajduje się faza ruchoma. W wyniku działania sił kapilarnych faza ruchoma wędruje w górę płytki. Jest to proces rozwijania chromatogramu metodą wstępującą.

Oddziaływanie substancji znajdujących się w próbce z adsorbentem oraz z poruszającym się rozpuszczalnikiem powoduje rozdzielenie się składników próbki na płytce. W wyniku rozdzielenia poszczególne składniki tworzą oddzielne plamki. W przedstawionym na rysunku 2 rozdziale TLC, plamka z lewej strony nie uległa rozdzieleniu (lub jest pojedynczą substancją) natomiast plamka z prawej strony uległa rozdzieleniu.

Chromatogramy wywołuje się najczęściej odczynnikami chemicznymi, które tworzą barwne związki z analitami. Często ogląda się chromatogramy TLC oświetlane nadfioletem, aby zobaczyć substancje wykazujące właściwości fluorescencyjne pod wpływem promieniowania UV.

W chromatografii cienkowarstwowej stosuje się takie same fazy ruchome, jak w kolumnowej chromatografii cieczowej, dlatego dobór fazy ruchomej jest oparty na tych samych zasadach (por.roz.III.2.3.4.). Fazy stacjonarne stosowane w TLC są również podobne, jak w kolumnowej chromatografii cieczowej i są opisane w następnych rozdziałach. Najbardziej popularną fazą stacjonarną stosowaną w TLC jest żel krzemionkowy (por.roz. III.2.3.3.). Średni rozmiar cząstek złoża fazy stacjonarnej to 11 µm w analitycznej TLC i 5 µm w wysokosprawnej chromatografii cienkowarstwowej (HPTLC), natomiast w preparatywnej TLC - powyżej 20 µm. W chromatografii cienkowarstwowej stosuje się również złoża chemicznie zmodyfikowane, np. grupami NH2 (normalny układ faz) lub grupami oktadecylowymi C-18 (odwrócony układ faz).

Proces separacji składników próbki naniesionej na płytkę TLC nazywa się rozwijaniem chromatogramu.

Plamki rozdzielonych składników (o ile nie posiadają grup chromoforowych w zakresie widzialnym) uwidacznia się, czyli wywołuje.

155

Rysunek 20. Komora do chromatografii cienkowarstwowej

Podstawowym parametrem w chromatografii cienkowarstwowej, który określa położenie substancji na chromatogramie, jest współczynnik opóźnienia RF. Jest to stosunek drogi migracji substancji (a) do drogi przebytej przez fazę ruchomą (b):

b a

R_F = ₍₅₁₎

Sposób jego wyznaczania jest pokazany na rysunku 21.

Rysunek 21. Sposób pomiaru współczynnika opóźnienia RF

Jeżeli dana substancja ma tą samą wartość współczynnika opóźnienia, jaką ma wzorzec, wyznaczoną w takich samych warunkach chromatograficznych, to prawdopodobnie jest identyczna ze wzorcem. Najczęściej analizę jakościową wykonuje się w ten sposób, że na jedną płytkę TLC nanosi się badaną

Współczynnik opóźnienia przyjmuje wartości od 0 do 1. Jest charakterystyczny dla danej substancji w danych warunkach chromatograficznych i może służyć do jej identyfikacji.

156

próbkę oraz obok nanosi się również wzorzec. Po rozwinięciu płytki sprawdza się, która plamka badanej próbki ma taką samą wartość współczynnika opóźnienia jak wzorzec. Na rysunku 22 przedstawiono chromatogram TLC ekstraktu barwników wyizolowanych ze szpinaku. W punkcie E naniesiono cały ekstrakt, w punkcie 1 – wzorzec, którym jest czysty β-karoten a w punkcie 2 – jedną z frakcji, wydzieloną z ekstraktu metodą niskociśnieniowej chromatografii preparatywnej. β-karoten stanowi pomarańczową plamkę o wartości RF bliskiej jedności. Podobna plamka znajduje się w całym ekstrakcie, natomiast wydzielona frakcja nie zawiera β-karotenu.

Rysunek 22. Przykładowy chromatogram TLC ekstraktu barwników ze szpinaku (E), wzorca β-karotenu (1) i frakcji ekstraktu wydzielonej metodą niskociśnieniowej chromatografii preparatywnej

(2)

Wyróżniamy następujące sposoby rozwijania chromatogramów:

• metoda wstępująca (rysunek 2 i 22), która jest najczęściej stosowana,

• metoda zstępująca (spływowa), polegająca na tym, że rozpuszczalnik podawany jest od góry płytki TLC; w metodzie tej ruch fazy ruchomej wywoływany jest siłami kapilarnymi i dodatkowo siłą ciążenia (w praktyce bardzo rzadko używana),

• metoda dwukierunkowa (dwuwymiarowa), 2D-TLC (rysunek 23),

• metoda horyzontalna, polegająca na rozwijaniu chromatogramu na płytkach ułożonych poziomo w specjalnej komorze.

Niekiedy mieszaniny związków są trudne do rozdzielenia za pomocą jednowymiarowych technik TLC. Często ma to miejsce w przypadku mieszanin związków naturalnych. Aby uzyskać pełne rozdzielenie związków o podobnych właściwościach chemicznych stosuje się technikę dwuwymiarową (2D-TLC). Pojedynczą próbkę nanosi się w jednym rogu płytki TLC, którą następnie rozwija się w pierwszym kierunku (rys. 23), uzyskując częściowe rozdzielenie składników próbki (cztery frakcje).

157

Chromatogram po wysuszeniu i obróceniu o 90° jest rozwijany ponownie, ale w drugim kierunku (prostopadłym do pierwszego) i z użyciem fazy ruchomej o innym składzie. Tym samym cztery uzyskane frakcje (plamki) stanowią punkty startowe. W wyniku drugiego procesu rozdzielenia, każda z frakcji ma możliwość separacji na pojedyncze składniki: frakcje pierwsza, trzecia i czwarta (od prawej) są mieszaniną 3 substancji, frakcja druga jest pojedynczym związkiem.

Sposób wyznaczania obu współczynników przedstawiony jest na rysunku 23.

Rysunek 23. Dwuwymiarowa chromatografia cienkowarstwowa (2D-TLC); zasada rozwijania oraz sposób wyznaczania wartości współczynników opóźnienia w obu kierunkach rozwijania: RF1 = a1/b1

oraz RF2 = a2/b2

2.2.3. Zasady dobrej praktyki laboratoryjnej w TLC

Płytki TLC gotowe do użycia są dostępne komercyjnie. Płytki są pakowane i przechowywane w odpowiednich pudełkach. Można je łatwo uszkodzić, co negatywnie wpływa na proces

W dwuwymiarowej chromatografii cienkowarstwowej położenie substancji na

158

chromatograficzny. Przestrzeganie pewnych zasad pozwala poprawnie przeprowadzić rozdzielanie na płytkach TLC.

Nanoszenie próbki na płytkę TLC

Punkt startowy, gdzie nanosi się próbkę, nie powinien być za nisko na płytce TLC, aby plamka nie była zanurzona w fazie ruchomej. Z tego samego powodu, przy wkładaniu płytki do komory chromatograficznej, należy unikać gwałtownych ruchów. Należy ponadto pamiętać, że im mniejsza jest objętość naniesionego roztworu próbki tym lepiej. Przy analizie jakościowej nanosi się od 0,5 do 2,0 µl roztworu próbki, przy określaniu czystości próbki - około 10 µl nanoszonych w niewielkich porcjach. Plamka naniesionej próbki powinna być jak najmniejsza. Średnica plamki nie powinna przekraczać 2 mm. Należy także starannie wybrać rozpuszczalnik do rozpuszczenia próbki: im mniejsza siła elucyjna rozpuszczalnika tym lepiej, bo uzyskuje się plamkę o mniejszej średnicy, im lotniejszy rozpuszczalnik, tym łatwiej go usunąć. Z plamki naniesionej próbki należy usunąć rozpuszczalnik. W przypadku lotnych związków rozpuszczonych w lotnym rozpuszczalniku, pozostawia się płytkę na kilka minut w temp. pokojowej., Do suszenia nie powinno się stosować suszarki do włosów, choć jest dość powszechnie używana w większości laboratoriów (lotne związki mogą zostać usunięte ze strumieniem powietrza). W przypadku termicznie stabilnych substancji, rozpuszczonych w chloroformie lub metanolu płytkę pozostawia się na 20 minut w suszarce, w temperaturze bliskiej temperatury wrzenia rozpuszczalnika, tu stosowanie suszarki do włosów może być niewystarczające.

Zasady poprawnego rozdziału na płytkach TLC:

• powierzchni płytek nie wolno dotykać palcami,

• przy cięciu płytki nożyczkami nie wolno zniszczyć warstwy fazy stacjonarnej, • dobrze jest usunąć ukruszoną część fazy stacjonarnej z brzegu, który był płytki,

• dobrze jest wstępnie przemyć płytkę TLC metanolem lub innym rozpuszczalnikiem, używanym później do rozwijania chromatogramu, aby pozbyć się zanieczyszczeń zaabsorbowanych w fazie stacjonarnej; przemytą płytkę suszy się i przechowuje w szczelnie zamkniętym naczyniu,

• fazę stacjonarną (żel krzemionkowy) można aktywować, poprzez suszenie płytki TLC w ciągu 30 minut w temp. 120 °C dla usunięcia części zaadsorbowanej wody z żelu krzemionkowego, obniżającej jego aktywność (aktywowane płytki przechowuje się w szczelnie zamkniętym naczyniu),

• na płytce delikatnie zaznacza się miękkim ołówkiem jedynie punkt startowy i ewentualnie linię końcową czoła fazy ruchomej, za pomocą niewielkiej kreski o szerokości 0,5 cm z boku płytki. Opis nanoszonych próbek najlepiej zamieścić w zeszycie laboratoryjnym a nie na płytce TLC. Zniszczenie powierzchni fazy stacjonarnej poprzez rysowanie na płytce powoduje błędy w analizach TLC.

159

Rozwijanie chromatogramów TLC

W tym procesie niezbędne jest odpowiednie, wcześniejsze nasycenie komory chromatograficznej oparami fazy ruchomej.

Podczas chromatografowania może nastąpić zmiana składu fazy ruchomej, dlatego komorę należy napełniać świeżą fazą ruchomą przed rozwijaniem każdej płytki. Jeżeli faza ruchoma jest jednoskładnikowa, to sprawdza się jej czystość i ilość, i ewentualnie uzupełnia lub wymienia. Najlepiej używać świeżo przygotowanej fazy ruchomej. Przechowywane przez długi czas roztwory fazy ruchomej mogą zmieniać swój skład i w sposób negatywny wpływać na wynik analizy. Komora chromatograficzna nie powinna stać pod wyciągiem laboratoryjnym w trakcie rozwijania chromatogramu. Przepływ powietrza zmienia temperaturę, a to wpływa na rozdzielanie chromatograficzne. Nie wolno także poruszyć komory chromatograficznej w trakcie rozwijania chromatogramu.

2.3. Chromatografia kolumnowa niskociśnieniowa