Atranoryna

Atranoryna jest szeroko rozpowszechnionym w porostach depsydem. Jej częste występowanie w plechach lichenizowanych grzybów przełożyło się na intensywność prac nad jej aktywnością biologiczną. Przeciwdrobnoustrojowe właściwości atranoryny badał Yilmaz i wsp. Za pomocą metody dyfuzyjno-krążkowej określił minimalne stężenie hamujące rozwój drobnoustrojów (MIC). Otrzymane wyniki wahały się w zależności od użytego szczepu między 15 a 500 µg związku naniesionego na krążek. Atranoryna była aktywna wobec Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Listeria monocytogenes, oraz Aeromonas hydrophila, natomiast inne testowane drobnoustroje cechowała mniejsza wrażliwość [Yilmaz i wsp. 2004]. Badano również działanie atranoryny wobec laseczek Gram-dodatnich z rodzaju Bacillus. Wartość wyznaczonego MIC wynosiła 31,0 µg/ml, natomiast dla stosowanej jako wzorzec streptomycyny MIC = 7,8 µg/ml. Określono równocześnie działanie atranoryny na szczepy Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae i Staphylococcus aureus (MIC = 31,0 µg/ml) [Rancović i wsp. 2008]. Wykazano też, że atranoryna nie wpływała w istotny sposób na rozwój Mycobacterium aurum i Mycobacterium tuberculosis [Ingólfsdóttir i wsp. 1998, Honda i wsp. 2010]. Atranoryna nie działała na komórki grzybów strzępkowych [Türk i wsp. 2006].

Działanie atranoryny po 24-godzinnej inkubacji ze szczepami bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych oraz komórkami grzybów oceniano metodą seryjnych rozcieńczeń. Atranorynę testowano wobec 10 typów drobnoustrojów (Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas vulgaris, Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Sarcinia lutea, Candida albicans, Cryptococcus diffluens), a charakteryzująca siłę działania wartość MIC wynosiła 5,0-70,7 µg/ml. Atranoryna okazała się najsilniej działającą substancją spośród 7 testowanych w tym eksperymencie metabolitów porostów. Co ciekawe, wyniki badań wskazywały, że atranoryna wykazywała najsilniejsze działanie na szczepy Gram-ujemnych bakterii (E. coli i P.vulgaris; MIC = 8,3 µg/ml i 5,0 µg/ml, odpowiednio). Było ono porównywalne z powszechnie stosowanymi antybiotykami: erytromycyną i gentamycyną (4,7 i 4,6 µg/ml oraz 5,1 i 4,6 µg/ml, odpowiednio). Atranorynę cechowałą również wysoka aktywność wobec badanych grzybów drożdżoidalnych (C. albicans i C. diffluens MIC = 17,0 µg/ml i 15,7 µg/ml, odpowiednio) [Neeraj i wsp. 2011]. Aktywność atranoryny wobec szczepów Gram-dodatnich (Micrococcus luteus, S. aureus, B. subtilis) i Gram-ujemnych (E. coli, Pseudomonas aeruginosa) określono również w innym badaniu za pomocą metody dyfuzyjno-krążkowej. Stężenie testowanych roztworów

56 wynosiło 1 oraz 2 mg/ml. Roztwory w ilości 50 µl zostały naniesione na krążki o średnicy 6,0 mm. Po inkubacji w odpowiednich warunkach, odczytano wielkość strefy zahamowania wzrostu. Otrzymane rezultaty pokazały, że atranoryna działała jedynie w wyższych stężeniach i tylko wobec S. aureus i M. luteus (12 i 9 mm, odpowiednio). W pozostałych przypadkach związek był nieaktywny. Dla stosowanej w stężeniu 0,5 µg/ml lewofloksacyny jako substancji referencyjnej, strefa zahamowania wzrostu drobnoustrojów była równa 27 mm (dla S. ureus) i 38 mm (dla B. subtilis), natomiast dla badanego równocześnie kwasu usninowego w stężeniu 2 mg/ml, wielkość strefy inhibicji wzrostu badanych szczepów wynosiła 13 mm i 22 mm, odpowiednio [Nóbrega i wsp. 2012].

Badania cytotoksyczności atranoryny, przeprowadzone w warunkach in vitro

wskazywały na brak działania toksycznego na komórki keratynocytów ludzkich (HaCaT)

[Kumar i Müller 1999a] i słabą aktywność na komórki chłoniaka histiocytowego (U937)

oraz białaczki promielocytowej (HL-60) [Toledo i wsp. 2003]. Ponadto atranoryna działała słabiej od kolchicyny na izolowane limfocyty szczurze (5,21 dpm i 3,5 dpm, odpowiednio) [Correché i wsp. 2002]. Badano również antyproliferacyjne/cytotoksyczne właściwości atranoryny dziewięciu różnych liniach komórek wywodzących się z nowotworów: jajnika (A2780), szyjki macicy (HeLa), piersi (MCF-7 i SK-BR-3), okrężnicy (HT-29), jelita grubego (HCT-116 P53+/+

i HCT-116 P53^-/-), białaczki promielocytowej (HL-60) oraz na ludzkiej linii nowotworowej limfoblastoidalnej T (Jurkat). Otrzymane wyniki wskazywały na zróżnicowane właściwości toksyczne depsydu, w zależności od stężenia i czasu ekspozycji. W badaniu stwierdzono, że atranoryna działa na komórki białaczki promielocytowej (HL-60; IC50 = 93,5 µM), a także (choć słabiej), na komórki raka jajnika, jelita grubego i Jurkat (IC50 około 200 µM). Dla pozostałych linii komórkowych wartość IC50> 200 µM [Bačkorova i wsp. 2010].

Aktywność antyoksydacyjną atranoryny i kwasu lekanorowego wyizolowanych z Parmotrema stuppeum badano mierząc zdolność związków do utleniania cząsteczek β-karotenu. Oba związki, w stężeniu 200 µg/ml (534 i 628 µM) wykazywały podobny, lecz niski - w porównaniu z BHA, poziom aktywności antyoksydacyjnej (14% i 12% oraz 93%, odpowiednio) [Jayaprakasha i Rao 2000].

W celu oceny przeciwbólowych właściwości atranoryny wykonano tzw. test przeciągania u myszy. Skurcze brzucha u zwierząt wywoływano podając dootrzewnowo: 10 ml/kg 1% kwasu octowego. Atranorynę stosowano w stężeniu 25 mg/kg. Substancją odniesienia był kwas acetylosalicylowy aplikowany w dawce 50 mg/kg. Otrzymane

57 rezultaty wykazały, że atranoryna hamuje skutki działania kwasu octowego w 87%, natomiast aspiryna, chociaż stosowana w dwukrotnie w wyższych stężeniach hamowała skurcze tylko w 68%. Dodatkowo atranorynę charakteryzowała niska toksyczność (LD50 > 500 mg/kg), co stanowiło dawkę ponad 20-krotnie wyższą od wywołującej efekt przeciwbólowy [Maia 2002]. Wyniki kolejnych badań potwierdzające antynocyceptywne działanie depsydu zostały opublikowane przez Melo i wsp. W tym celu przeprowadzono na myszach test przeciągania oraz test formalinowy. Rezultaty uzyskane w teście przeciągania, w którym atranorynę aplikowano zwierzętom doustnie w dawkach 100, 200 i 400 mg/kg m.c., natomiast związek referencyjny (aspiryna) w dawce 200 mg/kg m.c. ukazały, że ból wywołany podaniem dootrzewnowym 10 ml/kg m.c. 0,85% roztworu kwasu octowego, był przez atranorynę hamowany zależnie od dawki (13,4%, 52,6% i 61,3%, odpowiednio). Właściwości przeciwbólowe aspiryny wyniosły natomiast 90,7%. W tych samych badaniach zwierzętom podano podskórnie do tylnej łapy 20 µl 1% roztworu formaliny. W przebiegu tzw. testu formalinowego, obserwowano zachowanie zwierząt w dwóch fazach: po 5 i po 15-30 minutach od podania roztworu formaliny. W pierwszej fazie doświadczenia podanie atranoryny nie powodowało zmian w zachowaniu gryzoni w porównaniu z grupą kontrolną. Po 15-30 minutach działanie atranoryny w dawce 400 mg/kg masy ciała okazało się porównywalne z użytym jako substancja referencyjna kwasem acetylosalicylowym (64,8% i 69,9% odpowiednio). Aktywność antynocyceptywna badanego depsydu była zależna od dawki [Melo i wsp. 2008].

Opisano również fotoprotekcyjne właściwości atranoryny. Wykonano eksperyment, w którym po podaniu atranoryny oceniono stopień inhibicji wiązania się z białkami ludzkiego osocza 8-metoksyporalenu (8-MOP), znanego jako substancja fotouczulająca. Okazało się, że wzrost stężenia depsydu w badanej próbie po poddaniu jej promieniowaniu UVA, powodował spadek łączenia się 8-MOP z białkami i w stężeniu 10 mM stopień inhibicji wynosił 20,1%. Sugeruje to fotoprotekcyjne działanie związku

[Fernández i wsp. 1998].

Atranoryna posiada również właściwości hamujące enzymy. Rezulataty badań wskazują, że atranoryna wpływała hamująco na biosyntezę LTB4 poprzez blokowanie 5-LOX, w komórkach wielojądrzastych leukocytów bydlęcych (IC50 = 6 µM), co sugeruje potencjalnie przeciwzapalne właściwości związku. W tym samym eksperymencie wykazano, że mechanizm hamujący lipooksygenzę jest prawdopodobnie związany z bezpośrednim oddziaływaniem na enzym, nie zaś z właściwościami

oksydacyjno-58 redukcyjnymi atranoryny [Kumar i Müller 1999]. Z danych piśmiennictwa wynika, że atranoryna wpływała także na biosyntezę prostaglandyn w mikrosomach nerki królika i stymuluje porostowe enzymy: ureazę i arginazę [Proksa i wsp. 1994]. Bugni i wsp. badał właściwości atranoryny jako inhibitora cyklooksygenaz, enzymów uczestniczących w przebiegu procesów zapalnych. W prowadzonym eksperymencie oceniono też wpływ substancji badanej na poziom wytwarzanej przez COX prostaglandyny H2 (PGH2). Uzyskane wyniki wskazywały, że atranoryna hamowała COX-1 w zależny od dawki sposób, natomiast w stężeniu 17 µg/ml (45 µM) powodowała spadek aktywności enzymu o 50%. Zdolność blokowania COX-2 była mniejsza i w tym samym zakresie stężeń atranoryna powodowała spadek aktywności enzymu o 40%. W tym przypadku nie zaobserwowano zależnej od dawki relacji enzym-atranoryna. Substancją referencyjną w opisanym eksperymencie był kwas acetylosalicylowy, który w stężniu 50 µM hamował COX-1 i COX-2 w 59% i 42%, odpowiednio [Bugni i wsp. 2009]. Przeprowadzone badania świadczą również o właściwościach hamujących elastazę trzuskową świń (podana w stężeniu 100 µM atranoryna hamowała enzym w 88%) oraz hamujących trypsynę (atranoryna w stężeniu 500 µM powodowała inhibicję trypsyny w 76,7%; IC₅₀ 1,8x10^-4 mol/l) [Proksa i wsp. 1994]. Atranoryna okazała się również inhibitorem wzrostu roślin wyższych [Huneck 1999].

Celem kolejnych badań było określenie właściwości przeciwzapalnych oraz

cytotoksycznych atranoryny wobec fibroblastów mysich, a także toksyczności ostrej

(dawka pojedyncza) i podostrej (30 dni), po podaniu doustnym u gryzoni. Aktywność przeciwzapalna była badana na szczurach w modelu odczynu zapalnego wywołanego podaniem do prawej, tylnej łapy szczurów 1% roztworu karageniny. Badaną atranorynę aplikowano doustnie trzem grupom zwierząt w dawkach 50, 100 i 200 mg/kg m.c., na godzinę przed podaniem roztworu karageniny. Substancją referencyjną był kwas acetylosalicylowy (300 mg/kg m.c. p.o.). Efekt działania badanych związków sprawdzono 3 godziny po wstrzyknięciu karageniny. Okazało się, że atranoryna podana w dawce 100 i 200 mg/kg m.c., hamowała powstanie odczynu zapalnego o 29,3% i 32,9%. Stosowany dla porównania kwas acetylosalicylowy wykazywał działanie silniejsze (76,4%). W kolejnej części eksperymentu zbadano wpływ atranoryny na migrację leukocytów wywołaną podaniem dootrzewnonym samcom myszy 500 mg karageniny. Podanie doustne myszom atranoryny w dawkach 50, 100 i 200 mg/kg (godzinę przed iniekcją karageniny), powodowało inhibicję migracji leukocytów, a stopień hamowania obserwowany po 4 godzinach od włączenia substancji wywołującej odczyn zapalny

59 wynosił odpowiednio 31,9; 35,9; 42,5%. Substancją referencyjną był wstrzyknięty podskórnie deksametazon (2 mg/kg), który w 92,2% hamował migrację leukocytów w miejscu stanu zapalnego. Następnym etapem badań było określenie toksycznego działania atranoryny. Toksyczność podostra została oceniona na szczurach (20 samców i 20 samic). Przez 30 dni zwierzętom podawano atranorynę w dawce 50 mg/kg. Uzyskane wyniki wskazywały, że atranoryna, nie powodowała zmian w przyroście masy ciała zwierząt, w porównaniu z próbą kontrolną. Nie zauważono także różnic w masie płuc, żołądka, wątroby i serca, także makro- i mikroskopowy obraz organów był prawidłowy i odpowiadający płci gryzoni. Niewielkie różnice w masie organów dotyczyły jedynie nerek samic szczurów. U samic, którym podawano atranorynę, była ona niższa w porównaniu z nerkami samic grupy kontrolnej (1,54 g i 1,91 g, odpowiednio). Przeprowadzone badania hematologiczne i biochemiczne krwi oraz histopatologiczne (płuca, serce, wątroba, nerki, jelita) wskazywały na brak różnic między zwierzętami leczonymi i grupą kontrolną. Toksyczność ostrą badano na szczurach jako skutek jednorazowego podania 5 g atranoryny. Dawka ta nie spowodowała śmierci zwierząt przez 14 dni obserwacji. Przez ten czas nie odnotowano również żadnych objawów toksyczności lub zmian w zachowaniu się badanych zwierząt. Należy jednak zauważyć, że w pierwszych 24 godzinach po podaniu atranoryny zwierzęta charakteryzowała zmniejszona aktywność ruchowa i stan letargu. Wykonane badania hematologiczne i biochemiczne krwi jak również makro i mkroskopowe badania organów, nie wykazywały odchyleń. Kolejna faza eksperymentu zakładała ocenę cytotoksycznych właściwości atranoryny, wobec mysich fibroblastów (L929). Oznaczenie przeprowadzono korzystając z często stosowanej metody MTT. Otrzymane rezultaty wykazały, że atranoryna w stężeniu 0,01-0,16 mg/ml nie posiadała działania toksycznego na badaną linię L929. Wszytkie uzyskane wyniki wskazywały na przeciwzapalne właściwości atranoryny, których mechanizm może być związany z wpływem na mediatory stanu zapalnego. Brak objawów toksyczności ostrej i podostrej jak i działania cytotoksycznego na fibroblasty mysie, czyni atranorynę związkiem posiadającym korzystne cechy dla substancji o charakterze leczniczym [Melo i wsp. 2011].