Prowadzone badania obejmowały izolację i identyfikację związków o charakterze depsydów, depsydonów oraz pochodnej dibenzofuranu z wyciągów przygotowanych z plech czterech gatunków porostów rosnących w Polsce. Prace fitochemiczne prowadzono w celu pozyskania wyciągów i związków do badań aktywności biologicznej. W wyciągach acetonowych i metanolowych z badanych porostów określono całkowitą zawartość polifenoli, natomiast w wyciągach heptanowym, eteru dietylowego, acetonowym i metanolowym z C. uncialis oceniono
zawartość kwasu usninowego metodą z wykorzystaniem wysokosprawnej
chromatografii cieczowej (HPLC). W zakres prac wchodziła też ocena aktywności
przeciwutleniającej, cytotoksycznej i przeciwdrobnoustrojowej wybranych
wyciągów oraz niektórych wyizolowanych związków. Przebieg prowadzonych badań ilustruje rycina 11a i 11b (strona 87 i 88).
6.1. Ekstrakcja
W pierwszym etapie badań z zebranych ze stanu naturalego plech porostów przygotowano wyciągi z zastosowaniem łaźni ultradźwiękowej (H. physodes, P. sulcata, H. scalaris, C. uncialis) lub aparatu Soxhleta (C. uncialis). Masa ekstrahowanego surowca była uzależniona możliwością zbioru ze stanu naturalnego i charakterem badań, do których przeznaczono przygotowywane wyciągi. Ograniczenie to dotyczyło szczególnie H. scalaris, gdyż plecha tego gatunku jest bardzo drobna i trudno ją pozyskać w większej ilości. Objętość rozpuszczalnika użyta do ekstrakcji była w przypadku każdego gatunku porostu uzależniona od objętości plechy i dobierana w ten sposób aby całkowicie przykrywała rozdrobniony surowiec. Spowodowało to różnice w zastosowanych objętościach ekstrahenta.
W zależności od późniejszego przeznaczenia wyciągów surowiec ekstrahowano kolejno rozpuszczalnikami o wzrastającej polarności (wyciągi do badań fitochemicznych) lub stosowano ekstrakcję oddzielnych partii surowców rozpuszczalnikami o różnej polarności (wyciągi do badań aktywności biologicznej). W przypadku otrzymywania wyciągów do badań fitochemicznych stosowanie kolejno odczynników o wzrastającej polarności, pozwoliło na uzyskanie wyciągów różniących się ilością obecnych w nich związków, co ułatwiło izolację metabolitów wtórnych. Ekstrakty do badań aktywności biologicznej, z uwagi na ekstrahowanie surowca jednym
198 rozpuszczalnikiem, charakteryzowała większa różnorodność związków czynnych. Rozpuszczalniki do ekstrakcji danego gatunku wybrano na podstawie przeprowadzonych prac wstępnych. W celu zwiększenia wydajności prowadzonych ekstrakcji warunki w jakich otrzymywano wyciągi do badań różniły się w zależności od gatunku porostu. Zastosowanie ultradźwięków pozwoliło skrócić czas otrzymywania wyciągów i obniżyć stosowaną temepraturę ekstrakcji, co jest korzystne, gdyż zmniejsza ryzyko zmian w strukturze lub rozpadu znajdujących się w wyciągu związków. Ekstrakcja w aparacie Soxhleta, zastosowana dla C. uncialis, nieznacznie zwiększyła wydajność procesu (tabela 13). Jednak konieczność stosowania wyższych temperatur (temp. wrzenia danego rozpuszczalnika: heptan 98°C, aceton 56°C, metanol 65°C) i dłuższego czasu ekstrakcji wpłynęła na skręcalność optyczną obecnego w surowcu kwasu (-)-usninowego (tabela 40, rozdział 5.4.6.).
Z danych piśmiennictwa wynika, że plechy niektórych gatunków porostów mogą zawierać duże ilości metabolitów wtórnych. Opisano, że ich zawartość może sięgać nawet pond 20% s.m. plechy [Bystrek 1997]. W prowadzonych pracach stopień ekstrakcji związków z badanych gatunków porostów był zróżnicowany. Dla ekstrakcji wykonanej kolejno odczynnikami o wzrastającej polarności wydajność wynosiła 1,68 – 18,86% (C. uncialis, H. scalaris, odpowiednio; tabela 13), natomiast w przypadku ekstrakcji wyłącznie jednym odczynnikiem wahała się od 0,4% dla rozpuszczalników o bardzo dużej lipofilności (heksan - H. physodes), do nawet 28% w przypadku esktrahentów bardziej polarnych (metanol - H. scalaris) (tabela 14). Analiza całkowitej wydajności ekstrakcji prowadzonych jednym rozpuszczalnikiem za pomocą ultradźwięków (tabela 14), pozwala wnioskować, że najwyższa była zawartość związków w H. scalaris, średnia w H. physodes > P. sulcata i najniższa w C. uncialis.
6.2. Analiza jakościowa
Uzyskane z porostów wyciągi i związki poddawano analizie jakościowej z wykorzystaniem chromatografii cienkowarstwowej (TLC). Z uwagi na zdolność pochłaniania promieniowania UV w zakresie długości fali λ 200-400 nm przez opisywane w pracy depsydy i depsydony do badań wykorzystano płytki żelowe ze znacznikiem fluorescencji F254. Używane do TLC fazy ruchome charakteryzowała mała, bądź średnia polarność (rozdział 4.3.2.1.), co wynikało z charakteru chemicznego związków obecnych w wyciągach. W badaniach użyto faz rozwijających zwykle stosowanych w analityce porostów (rozdział 4.3.2.), za wyjątkiem faz oznaczonej jako
199 F2 (toluen-octan etylu-kwas octowy lodowaty 60:30:5) oraz F5 (eter dietylowy-kwas octowy lodowaty 100:1) zastosowanych do izolacji lub badań ilościowych. Obie fazy nie zostały dotąd opisane w literaturze, gdyż dobrano je eksperymentalnie na potrzeby niniejszej pracy. W przypadku wyciągów otrzymanych metodą ekstrakcji rozpuszczalnikami o wzrastającej polarności, skład jakościowy różnił się w zależności od zastosowanego odczynnika. Wyciągi mniej polarne (heptanowe, heksanowe) zawierały niewielką liczbę metabolitów wtórnych, jednak ich procentowy udział w ekstrakcie był znaczący. W wyciągu heksanowym z H. physodes i P. sulcata występowała mieszanina dwóch związków (atranoryny i chloroatranoryny), wyciąg heptanowy z C. uncialis obfitował w kwas usninowy. Stwierdzono również, że w przypadku ekstrakcji jednym typem odczynnika (zastosowanej w celu pozyskania wyciągów do badań aktywności biologicznej), wyciągi acetonowe i metanolowe otrzymane z badanych gatunków porostów mają bardziej zróżnicowany skład od pozostałych. Typ faz rozwijających, jak i wartości Rf, charakteryzujące zaobserwowane na płytce związki sugeruje, że większość obecnych w badanych wyciągach substancji posiada stosunkowo niską polarność (również w wyciągach acetonowych czy metanolowych) (ryciny 16-19), rozdział 5.2.).
6.3. Izolacja związków
Z analizowanych gatunków porostów stosując własną metodykę otrzymano znane metabolity wtórne, których obecność w badanych porostach była już wcześniej opisywana. W izolacji związków wykorzystano technikę preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej (kwas lekanorowy, kwas fyzodalowy) oraz kolumnowej (kwas fyzodowy), natomiast niektóre ze związków otrzymano z wyciągu przez krystalizację (kwas lekanorowy, kwas usninowy, kwas salazynowy, kwas skwamatowy, mieszanina atranoryny i chloroatranoryny). Metodyka izolacji związków techniką PTLC i CC (kwas fyzodalowy, kwas lekanorowy i kwas fyzodowy), została ustalona doświadczalnie podczas realizacji niniejszej pracy doktorskiej i nie była do tej pory nigdzie opisywana. Dla otrzymywania kwasu salazynowego zastosowano prostą metodę krystalizacji, zaczerpniętą z pracy Ingólfsdóttir i wsp. (1998), którą zmodyfikowano przez odpowiednie oczyszczenie wyciągu. Sposób oczyszczania ekstraktu opracowano w trakcie prowadzenia badań i jest prezentowany po raz pierwszy. Metoda otrzymywania kwasu lekanorowego z H. scalaris przez krystalizację frakcji eterowej uzyskanej z wyciągu acetonowego nie była do tej pory nigdzie przedstawiana.
200 W przypadku kwasu lekanorowego, krystalizacja była szybszym i bardziej wydajnym sposobem otrzymania depsydu, w porównaniu z zastosowaną wcześniej chromatografią preparatywną (obliczona wydajność obu metod wynosiła 46,1% i 18,7% - odpowiednio). Kwas usninowy uzyskano z wyciągów heptanowych C. uncialis, metodą krystalizacji. Wyciągi heptanowe sporządzono za pomocą różnych typów ekstrakcji (ultradźwięki i aparat Soxhleta). Okazało się, że wyciąg otrzymany metodą z zastosowaniem ultradźwięków zawierał kwas (-)-usninowy, natomiast uzyskany przez ekstrakcję w aparacie Soxhleta zawierał mieszaninę racemiczną obu izomerów optycznych kwasu usninowego (rozdział 6.4.). Do przeprowadzanych w ramach pracy doktorskiej badań biologicznych posłużył czysty kwas (-)-usninowy. Zastosowana w pracy metoda izolacji kwasu skwamatowego nie była do tej pory nigdzie opisywana. Warto podkreślić, że w wyniku prowadzonych prac udało się uzyskać stosunkowo duże ilości związków (tabela 65), co umożliwiło poddanie ich wybranym badaniom aktywności biologicznej w warunkach in vitro.
Tabela 65. Masy otrzymanych związków z badanych gatunków porostów
Związek fyzodowy Kwas fyzodalowy Kwas salzynowy Kwas lekanorowy Kwas usninowy Kwas skwamatowy Kwas Atranoryna i
chloroatranoryna
Masa
[mg] 15,0 6,0 25,6 32,2 284,9 207,5 35,0
.
6.4. Identyfikacja związków
W celu zidentyfikowania związków otrzymanych w wyniku prac izolacyjnych przeprowadzono analizy z wykorzystaniem: chromatografii cienkowarstwowej (TLC), metod spektroskopowych (NMR 1H i 13C, UV), spektrometrycznych (MS) oraz polarymetrycznej w przypadku oznaczenia typu enancjomeru kwasu usninowego. Uzyskane rezultaty porównywano z wartościami literaturowymi, co ułatwiło interpretację otrzymanych wyników. Spójność danych otrzymanych w toku prowadzonych badań i literaturowych, potwierdziła tożsamość związków i ich duży stopień czystości.