Izolacja związków

Otrzymane wyciągi do badań fitochemicznych poddano analizie TLC i na podstawie uzyskanych rezultatów wstępnie oceniono wyciągi pod względem różnorodności i ilości zawartych w ekstraktach metabolitów wtórnych. Pomogło to w wyborze ekstraktów do badań i wskazało kierunek prowadzenia prac fitochemicznych, w przebiegu których wykorzystano różną metodykę.

4.3.3.1. Chromatografia preparatywna cienkowarstwowa (PTLC)

Chromatografię preparatywną cienkowarstwową wykonano dla wyciągów acetonowych z H. physodes i H. scalaris, a zastosowana technika pozwoliła na izolację związków Hp_2 (kwas fyzodalowy) i Hs_1 (kwas lekanorowy).

Faza stacjonarna

 płytki szklane pokryte żelem krzemionkowym bez znacznika fluorescencji (PCTLC); (izolacja Hp_2)

 płytki szklane pokryte żelem krzemionkowym ze wskaźnikiem fluorescencji (PLC 60 F254, 2 mm); (izolacja Hs_1)

Faza ruchoma

 F₂: toluen:octan etylu:kwas octowy lodowaty (60:30:5); (izolacja Hp_2)  F₅: eter dietylowy:kwas octowy lodowaty (100:1); (izolacja Hs_1)

98

4.3.3.2. Chromatografia kolumnowa preparatywna (CC)

Chromatografię na kolumnie przeprowadzono dla wyciągu acetonowego z H. physodes, a zastosowana metoda pozwoliła na izolację związku Hp_1 (kwas fyzodowy). Faza stacjonarna

 żel krzemionkowy do chromatografii kolumnowej Faza ruchoma  F6: heksan:octan etylu (75:25)  F7: toluen:heksan (75:35)  F8: toluen:octan etylu (90:30)  F9: toluen:octan etylu (75:30) 4.3.3.3. Krystalizacja

Metodą krystalizacji otrzymano atranorynę i chloroatranorynę z H. physodes, kwas lekanorowy z H. scalaris, kwas salazynowy z P. sulcata i kwas usninowy oraz skwamatowy z C. uncialis.

4.3.3.4. Izolacja związków z Hypogymnia physodes Izolacja związku Hp_1 (kwas fyzodowy)

Wyciąg acetonowy z H. physodes poddano chromatografii kolumnowej (CC; rozdział 4.3.3.2.). Prace prowadzono w kolumnie szklanej o długości 50 cm i średnicy 2,5 cm, wypełnionej żelem krzemionkowym. W celu wypełnienia kolumny fazą stacjonarną przygotowano zawiesinę podłoża i układu F6 (rozdział 4.3.3.2.). Sporządzony wcześniej wyciąg acetonowy (350 mg) rozpuszczono w jak najmniejszej ilości rozpuszczalnika i naniesiono na żel krzemionkowy (około 500 mg). Tak przygotowaną próbkę nakładano delikatnie na szczyt kolumny. Kolumnę rozwijano fazami o wzrastającej polarności F6-F9 (tabela 3). Jakościową kontrolę składu zebranych z kolumny roztworów przeprowadzono wykonując analizę TLC stosując fazy ruchome F1, F2 (rozdział 4.3.2.1.) i w zależności od rezultatów łączono poszczególne frakcje.

W wyniku chromatografii kolumnowej otrzymano 105 eluatów, które następnie odpowiednio połączono. Kontrola TLC wykazała we frakcjach 24-29 obecność jednej plamy o Rf = 0,50, co sugerowało obecność w nich jednego związku (rycina 12, tabela 3). Pozostałe frakcje były kilkuskładnikowe i zawierały przypuszczalnie (analiza TLC) mieszaninę atranoryny i chloroatranoryny (1-12) oraz pochodne kwasu fyzodowego (31-105), których nie udało się rozdzielić.

99 Rycina 12. Chromatogram frakcji zawierających związek Hp_1 (kwas fyzodowy) zebranych w procesie

izolacji z kolumny chromatograficznej.

Układ rozwijający: F2 toluen-octan etylu-kwas octowy lodowaty (60:30:5); płytki: żel krzemionkowy 254

nm.

Tabela 3. Otrzymywanie metodą chromatografii kolumnowej związku Hp_1 (kwas fyzodowy)

Układ rozwijający ^Otrzymane

frakcje ^TLC Łączenie frakcji Współczynnik Rf F6: heksan:octan etylu (75:25) (500 ml) 1-17 ^1-12 13-18 19-23 24-30 31-65 66-105 0,57 i 0,40 0,50 0,52 i 0,45 F7: toluen: heksan (75:35) (100 ml) 18-22 F1 (1-12)

F8: toluen: octan etylu (90:30)

(1000 ml) 23-90 _{F2 (13-105)}

F9: toluen: octan etylu (75:30)

(260 ml) 91-105

Układ rozwijający: F1 heksan-octan etylu (75:25); F₂ toluen-octan etylu-kwas octowy (60:30:5); płytki: żel krzemionkowy 254 nm.

Izolacja związku Hp_2 (kwas fyzodalowy)

Acetonowy wyciąg z H. physodes poddano także chromatografii preparatywnej na płytkach żelowych (PTLC). Odważony dokładnie (około 5 mg) ekstrakt rozpuszczano w acetonie (około 3 ml) i nakładano pasmami na płytki do chromatografii preparatywnej (pokryte żelem krzemionkowym bez znacznika fluorescencji) wielkości 5 cm x 10 cm (5 mg na 5-6 płytek). Przygotowane w ten sposób płytki rozwijano w układzie F2 (tabela 4). Chromatogramy, po rozwinięciu suszono w ciemnym miejscu przez okres kilkunastu godzin, a następnie oglądano w świetle lampy UV λ = 365 nm. Z płytek zdrapywano szerokie pasma związku o ciemnofioletowej fluorescencji (Rf < 0,40 < 0,45). Zebrany żel z zaadsorbowanym na nim związkiem wymywano

100 w temperaturze pokojowej octanem etylu przez wytrząsanie (trzykrotnie) na wytrząsarce, a następnie w łaźni ultradźwiękowej (sześciokrotnie). Uzyskane roztwory sączono pod zmniejszonym ciśnieniem przez sączek ze szkła spiekanego i zagęszczono. Kontrola TLC wykazała, że uzyskane eluaty zawierają jeden związek. Warunki izolacji przedstawiono w tabeli 4.

Tabela 4. Otrzymywanie metodą PTLC związku Hp_2 (kwas fyzodalowy)

Gatunek porostu

(wyciąg) (wyciąg acetonowy) ^{H. physodes}

Masa naniesionego wyciągu 26,5 mg

Faza ruchoma toluen-octan etylu-kwas octowy lodowaty

(F2:60:30:5)

Warunki wymywania

z podłoża wytrząsanie

temp. pokojowa ^{ultradźwięki 35°C}

Czas wymywania 3 x 1h 6 x 20 minut

Rozpuszczalnik octan etylu

Objętość rozpuszczalnika 3 x 25 ml 6 x 25 ml

Zagęszczanie wyciągu pod zmniejszonym ciśnieniem

temp. 35-40ºC

Otrzymanie związków Hp_3 i Hp_4 (atranoryna i chloroatranoryna)

Uzyskane w wyniku kilkukrotnej ekstrakcji heksanem wyciągi z H. physodes łączono i zagęszczano pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze około 31ºC. Zagęszczony prawie do suchej pozostałości ekstrakt przemywano kilkukrotnie świeżymi porcjami heksanu, w celu odmycia zanieczyszczeń. Pozostałe w kolbie drobne kryształki o barwie kremowobiałej, pozostawiono do wyschnięcia.

4.3.3.5. Izolacja związków z Parmelia sulcata Izolacja związku Ps_1 (kwas salazynowy)

Zagęszczony do suchej pozostałości wyciąg acetonowy, przemyto mieszaniną dichlorometan:chloroform:aceton (2:2:1). W tym celu do kolby z zagęszczonym wyciągiem wlano przygotowaną wcześniej mieszaninę rozpuszczalników i mieszano energicznie przez około 30 minut w temperaturze 39°C (łaźnia wodna). Nadsącz oddzielono, a białawą pozostałość zostawiono do odparowania rozpuszczalnika. Następnie do małej kolby stożkowej odważano niewielkie porcje uzyskanej substancji i rozpuszczano w mieszaninie acetonu i wody (8:2). Otrzymany roztwór zostawiono

101 z dala od światła w temperaturze pokojowej i nieszczelnie przykryto. Po czasie 24-48 h na spodzie kolbki pojawiły się drobne, białe kryształki, które oddzielono zbierając fazę płynną pipetą Pasteur’a, a następnie przemyto metanolem i wysuszono. Warunki prowadzonej izolacji przedstawiono w tabeli 5.

Tabela 5. Otrzymywanie metodą krystalizacji związku Ps_1 (kwas salazynowy)

Gatunek

porostu ^{Typ wyciągu Rozpuszczalnik}

Masa wyciągu do krystalizacji [mg] Objętość rozpuszczalnika [ml] P. sulcata _{(oczyszczony)} ^{acetonowy aceton:woda} _(8:2)

16 10

14,5 5

30 20

Suma 60,5 35

4.3.3.6. Izolacja związków z Hypocenomyce scalaris Izolacja związku Hs_1 (kwas lekanorowy)

Otrzymany z H. scalaris wyciąg acetonowy (rozdział 4.3.1.1.) odmyto eterem, uzyskując nadsącz oraz nierozpuszczalny w eterze dietylowym osad. Nadsącz oddzielono, zagęszczono do suchej pozostałośći i wykorzystano w metodzie krystalizacji. Nierozpuszczony osad posłużył do prac izolacyjnych z wykorzystaniem PTLC.

Metoda preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej (PTLC)

Na zaimpregnowane parami fazy ruchomej F5 (tabela 6) płytki o wymiarach 20 x 20 cm pokrytych żelem krzemionkowym, ze wskaźnikiem fluorescencji, nanoszono pasmami rozpuszczony w acetonie (11-14 mg/płytkę) odpowiednio przygotowany wyciąg acetonowy z H. scalaris (rozdział 4.3.3.6.). Płytki rozwijano w układzie F5 (tabela 6). Chromatogramy suszono w ciemnym miejscu w temperaturze pokojowej przez czas 48-72 godziny, a następnie oglądano w świetle lampy UV λ = 254 nm. Zaznaczono szerokie pasma związku wygaszającego fluorescencję (Rf = 0,57), zeskrobano żel krzemionkowy, przeniesiono do kolby stożkowej i zalano acetonem. Zebrane podłoże wytrząsano na wytrząsarce w temperaturze pokojowej, a następnie sączono przez sączek ze szkła spiekanego pod zmniejszonym ciśnieniem. Warunki prowadzonej izolacji przedstawiono w tabeli 6, a uzyskany chromatogram na rycinie 13.

102 Rycina 13. Chromatogram do izolacji metodą PTLC związku Hs_1 (kwas lekanorowy).

Układ rozwijający: F5 eter dietylowy-kwas octowy lodowaty (100:1); płytki żel krzmionkowy 254 nm

Tabela 6. Otrzymywanie metodą PTLC związku Hs_1 (kwas lekanorowy)

Gatunek porostu

(wyciąg) (wyciągg acetonowy) ^{H. scalaris}

Masa naniesionego wyciągu 71,2 mg

Faza ruchoma ^{eter dietylowy-kwas octowy lodowaty} _(F5:100:1)

Warunki wymywania

z podłoża temperatura pokojowa ^wytrząsanie

Czas wymywania 1h

Rozpuszczalnik aceton

Objętość rozpuszczalnika 25 ml

Zagęszczanie ^{pod zmniejszonym ciśnieniem} _{temperatura 35-40ºC}

Metoda krystalizacji

Odważone do małej kolby stożkowej próbki odpowiednio przygotowanego wyciągu acetonowego (rozdział 4.3.3.6.), rozpuszczono w mieszaninie acetonu i wody (8:2). Otrzymany roztwór umieszczono z dala od światła w temperaturze pokojowej i nieszczelnie przykryto. Po czasie 24-48 h na spodzie kolbki pojawiły się drobne, białe kryształki, które oddzielono zbierając nadsącz pipetą Pasteur’a. Otrzymane kryształki przemyto i wysuszono. Warunki prowadzonej izolacji przedstawiono w tabeli 7.

Tabela 7. Otrzymywanie metodą krystalizacji związku Hs_1 (kwas lekanorowy)

Gatunek

porostu ^{Typ wyciągu Rozpuszczalnik Masa wyciągu [mg]} rozpuszczalnika [ml] ^Objętość

H. scalaris acetonowy ^aceton:woda _(8:2) ^{10 5}

31 20

Suma 41 25

103

4.3.3.7. Izolacja związków z Cladonia uncialis

Izolacja kwasu usninowego

Kwas usninowy otrzymano z wyciągów heptanowych przygotowanych z C. uncialis dwiema metodami (tabela 1). Każdy z otrzymanych wyciągów zagęszczono w kolbie do suchej pozostałości a następnie odmyto kilkoma, małymi (10-20 ml) porcjami heptanu. Uzyskany w ten sposób nadsącz oddzielono od właściwego wyciągu pipetą Pasteur’a. Pozostałe w kolbie wyciągi rozpuszczono w mieszaninie heptanu i dichlorometanu (1:2), a następnie przeniesiono do krystalizatora. Kwas usninowy krystalizował, w miarę odparowywania rozpuszczalnika, w postaci drobnych, seledynowożółtych igiełek.

Izolacja kwasu skwamatowego

Kwas skwamatowy pozyskano z obu wyciągów acetonowych otrzymanych z plech C. uncialis, które wcześniej poddano ekstrakcji heptanem (tabela 1, rozdział 4.3.1.1.). Zagęszczony do sucha wyciąg przemyto kilkoma małymi (10-20 ml) porcjami dichlorometanu (odmycie pozostałości kwasu usninowego). Następnie wyciąg odmyto niewielkimi ilościami octanu etylu i acetonu, które oddzielono używając pipety Pasteur’a. Osad zalano niewielką porcją octanu etylu i umieszczono w łaźni ultradźwiękowej w temperaturze 30-35°C. Uzyskaną w ten sposób zawiesinę związku (osad nie rozpuścił się) przeniesiono pipetą do probówek. Po odparowaniu rozpuszczalnika otrzymano białą, jednorodną substancję w postaci bezpostaciowego proszku.