Bioaktywność w warunkach in vitro

Jak wspomniano wcześniej, jedną z bardziej pożądanych właściwości materiałów dla inżynierii tkanki kostnej jest bioaktywność, to jest zdolność do tworzenia trwałego wiązania biomateriału z tkanką kostną, bez tworzenia pośredniej tkanki zmodyfikowanej (tkanki łącznej włóknistej). Powstanie wiązania wynika bezpośrednio z dużej reaktywności chemicznej biomateriału w kontakcie z płynami ustrojowymi, która skutkuje formowaniem się na jego powierzchni biologicznie aktywnej warstwy fosforanowo-wapniowej (w szczególności hydroksyapatytu węglanowego, HCA). Formująca się warstwa, z uwagi na duże podobieństwo chemiczne oraz strukturalne do nieorganicznej części tkanki kostnej (biomimetyzm), poza wspomnianą funkcją łączącą, zapewnia również poprawę biozgodności powierzchni biomateriału, a także stanowi korzystne podłoże stymulujące proliferację oraz aktywność komórek osteoblastycznych, sprzyjając odbudowie tkanki kostnej.

Zatem rozpoznanie czynników determinujących bioaktywność materiałów jest niezmiernie istotne z punktu widzenia możliwości projektowania materiałów implantacyjnych mogących znaleźć zastosowanie w regeneracji tkanki kostnej. O ile czynniki te są dość dobrze poznane dla materiałów ceramicznych (w szczególności dla bioaktywnych szkieł i szkło-ceramiki),

C Z Ę Ś Ć D O Ś W I A D C Z A L N A | 54

o tyle w literaturze istnieje pewna luka dotycząca uwarunkowań właściwości bioaktywnych tworzyw kompozytowych.

Metodą badania bioaktywności w warunkach in vitro, dającą przesłanki do stwierdzenia zdolności tworzenia trwałego wiązania biomateriału z tkanką kostną w warunkach in vivo, jest obserwacja formowania się warstwy CaP na powierzchni materiału w kontakcie ze sztucznymi płynami fizjologicznymi, o składzie zbliżonym do ludzkiego osocza. Jednym z tego typu płynów, popularnie wykorzystywanym w analizie bioaktywności materiałów, jest SBF opracowany przez Kokubo i in. [136]. Płyn ten jednak zawiera wyłącznie nieorganiczne składniki osocza. W pracy, oprócz zastosowania roztworu SBF, przeprowadzono inkubację kompozytów w pożywce hodowlanej DMEM-10%FBS, zawierającej dodatkowo składniki organiczne takie jak aminokwasy, czy białka, a zatem w większym stopniu naśladującej warunki panujące w organizmie [D4]. Przedstawione w literaturze wyniki wskazują, że warstwa składników organicznych zaadsorbowana na powierzchni bioaktywnej ceramiki hamuje uwalnianie oraz wymianę jonową, prowadząc do spowolnienia procesu formowania się warstwy CaP [22–24]. Podobnych spostrzeżeń dokonano w publikacji D4, zwracając dodatkowo uwagę na zróżnicowany mechanizm formowania się warstwy na powierzchni kompozytów w dwóch różnych płynach inkubacyjnych (DMEM-10%FBS i SBF). Wyniki te pozwalają jednoznacznie stwierdzić, że proces bioaktywności jest zależny nie tylko od właściwości kompozytu, co zostało opisane poniżej, ale także warunków przeprowadzenia eksperymentu, w tym przypadku, składu płynu inkubacyjnego.

Jak przedstawiono w Tabeli 5, w pracy analizowano szereg zmiennych zastosowanych w procesie otrzymywania kompozytów, w tym parametrów fazy modyfikującej, na ich bioaktywność. Z przeprowadzonych badań wynika, że jednym z parametrów warunkujących proces bioaktywności jest skład chemiczny wypełniacza (stosunek molowy CaO:SiO2 zastosowanych szkieł), co koreluje z danymi literaturowymi dotyczącymi materiałów szklistych i szkłopochodnych [20, 137]. Co ważne, w dostępnej literaturze jest niewiele doniesień wskazujących na wpływ składu chemicznego zastosowanego modyfikatora w postaci cząstek szkieł na bioaktywność kompozytów. Wprowadzenie zarówno do osnowy folii [D4], jak również przestrzennych rusztowań [D2] szkła A2 (wysokowapniowego) skutkowało wyraźnie szybszym formowaniem się warstwy CaP na powierzchni kompozytów w stosunku do tworzyw zawierających szkło S2 (wysokokrzemionkowe). Jak wykazała analiza ICP-OES płynów inkubacyjnych, wynikało to przede wszystkim ze znacznie szybszego uwalniania jonów wapniowych ze struktury szkła A2 [D4]. To z kolei prowadzi do szybszego przesycenia SBF i DMEM-10% FBS, a tym samym przyspieszonej nukleacji i krystalizacji warstwy fosforanu wapnia na powierzchni materiałów. Wykazano, że parametrem wpływającym w istotny sposób na kinetykę formowania się warstwy CaP jest udział fazy

C Z Ę Ś Ć D O Ś W I A D C Z A L N A | 55

modyfikującej w kompozytach [D4]. Uzyskane wyniki wskazują, że zasadniczą rolę w procesie bioaktywności materiałów odgrywa również frakcja ziarnowa zastosowanego wypełniacza, rzutująca między innymi na jego rozmieszczenie w matrycy folii i membran [D5,D6]. Równomierna dystrybucja cząstek szkła A2 o wielkości <3 µm w matrycy folii polimerowej prowadziła do krystalizacji warstwy fosforanowo-wapniowej w SBF na obu jej powierzchniach (AS oraz GS). Jednocześnie sedymentacja większych cząstek (<45 µm) tego wypełniacza przy powierzchni GS podczas procesu otrzymywania folii, skutkowała zahamowaniem właściwości bioaktywnych powierzchni AS poprzez ograniczoną ekspozycję szkła na tej powierzchni [D5]. Co ważne, obie powierzchnie (AS oraz GS) wysoko porowatych membran kompozytowych, niezależnie od zastosowanej frakcji szkła A2, wykazywały wysoką bioaktywność, pomimo zaobserwowanej sedymentacji większych cząstek modyfikatora (szczególnie w przypadku membran otrzymanych metodą TIPS) [D6]. Sugeruje to, że ważną rolę w procesie bioaktywności odgrywa porowatość tworzyw. Podobne wnioski można wysunąć analizując wyniki testów bioaktywności przestrzennych rusztowań otrzymanych różnymi technikami (SCPL, TIPS, NIPS), a zatem różniących się w znaczący sposób architekturą (porowatością, wielkością porów) [D2]. Co więcej, przeprowadzone badania pokazały, że proces formowania się warstwy CaP na powierzchni membran zachodzi na skutek szeregu przemian fazowych ACP–OCP–CDHA–CHA, a ich szybkość zależy zarówno od wielkości cząstek szkła (<3 µm, <45 µm), jak i metody otrzymywania materiałów (TISP, NIPS) [D6]. Należy podkreślić, że do tej pory taki przebieg mineralizacji materiału obserwowano wyłącznie dla mezoporowatych szkieł bioaktywnych. Z kolei, jak wykazano w publikacji D5, zastosowanie różnych rozpuszczalników w procesie otrzymywania folii, prowadziło do krystalizacji warstw CaP o różnej morfologii w kontakcie z SBF, co prawdopodobnie związane było ze zróżnicowaną topografią/porowatością powierzchni materiałów.

Wyniki przeprowadzonych badań jednoznacznie wskazują, że wprowadzenie do matrycy polimerowej cząstek bioaktywnych szkieł indukuje proces formowania się warstwy fosforanowo-wapniowej na powierzchni kompozytów w kontakcie ze sztucznymi płynami fizjologicznymi. Pojawienie się warstwy CaP nie tylko wskazuje na potencjalną zdolność kompozytów do tworzenia wiązania z tkanką, ale również może okazać się czynnikiem warunkującym odpowiedź komórek kostnych, w tym ich adhezję do powierzchni materiału. Wykazano, że kinetyka tego procesu zależy od parametrów fazy modyfikującej, takich jak skład chemiczny, jej udział w kompozycie, frakcja ziarnowa, rozmieszczenie w matrycy, a także właściwości materiału kompozytowego – jego mikrostruktury, porowatości, czy topografii powierzchni. Dowiedziono, że na etapie przeprowadzania wstępnych testów bioaktywności w warunkach in vitro materiałów kompozytowych istotną kwestią jest dobór płynu inkubacyjnego.

C Z Ę Ś Ć D O Ś W I A D C Z A L N A | 56