SPIS TREŚCI
PODZIĘKOWANIA 6
STRESZCZENIE 8
ABSTRACT 10
INDEKS SKRÓTÓW i OZNACZEŃ STOSOWANYCH W PRACY 12
I. WPROWADZENIE 16
II. PRZEGLĄD LITERATUROWY 20
2.1. Ograniczenia zdolności regeneracyjnych tkanki kostnej 20 2.2. Rola biomateriału w regeneracji ubytków kostnych 21
2.3. Inżynieria tkanki kostnej 31
III. CEL I ZAKRES PRACY 40
IV. CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA 42
4.1. Materiały i metody 42
4.1.1. Materiały 42
4.1.2. Metody wytwarzania materiałów kompozytowych 43 4.1.3. Metody charakterystyki materiałów kompozytowych 44
4.2. Omówienie wyników 48
4.2.1. Mikrostruktura i parametry powierzchni materiałów 48
4.2.2. Właściwości mechaniczne 51
4.2.3. Stopień krystaliczności osnowy polimerowej 52
4.2.4. Bioaktywność w warunkach in vitro 53
4.2.5. Degradacja hydrolityczna w warunkach in vitro 56
4.2.6. Odpowiedź komórkowa w warunkach in vitro 57
4.2.7. Materiały jako nośnik substancji biologicznie aktywnych 58
4.3. Podsumowanie i najważniejsze osiągnięcia 59
4.4. Perspektywy badawcze 61
BIBLIOGRAFIA 62
ZAŁĄCZNIK 1. Zbiór publikacji 72
W trakcie realizacji pracy doktorskiej uzyskano finansowanie z Narodowego Centrum Nauki obejmujące projekt badawczy PRELUDIUM nr 2015/17/N/ST8/00226 oraz stypendium doktorskie ETIUDA nr 2017/24/T/ST8/00041
P O D Z I Ę K O W A N I A | 6
PODZIĘKOWANIA
Szczególne podziękowania kieruję do dr hab. inż. Katarzyny Cholewy-Kowalskiej za to, że otworzyła przede mną drzwi świata naukowego, będąc moim niestrudzonym przewodnikiem, a jednocześnie pozwalając na samodzielną pracę i umożliwiając tym samym realizację moich pomysłów i planów naukowo-badawczych. Przede wszystkim jestem niezmiernie wdzięczny za przekazanie ogromu wiedzy teoretycznej oraz praktycznej, niezbędnej w planowaniu i przeprowadzaniu badań, a także analizie i interpretacji uzyskanych wyników. Dziękuję również za przyjacielską i pełną wsparcia atmosferę towarzyszącą realizacji pracy doktorskiej.
Jestem ogromnie wdzięczny Pani dr Elżbiecie Menaszek za przekazanie wiedzy i umiejętności niezbędnych przy prowadzeniu badań biologicznych biomateriałów oraz pomoc w ich planowaniu i realizacji, a także interpretacji uzyskanych wyników. Dziękuję również za twórczą i przyjazną atmosferę, dzięki której praca w Zakładzie Cytobiologii Uniwersytetu Jagiellońskiego była zawsze czystą przyjemnością.
Dziękuję mgr inż. Basi Zagrajczuk za pomoc w przeprowadzeniu analiz biologicznych i materiałowych, wsparcie w zakresie korekty językowej podczas redagowania publikacji, a także za wszystkie twórcze dyskusje.
Podziękowania kieruję również do dr inż. Magdaleny Ziąbki za wytrwałość i cierpliwość przy analizie SEM niezliczonej liczby próbek, a także za wsparcie i zawsze ciepłe słowo.
Podziękowania należą się także wszystkim osobom, bez których powstanie niniejszej pracy byłoby niemożliwe: Pani prof. dr hab. inż. Marii Borczuch-Łączce, dr inż. Justynie Pawlik, dr inż. Ewie Stodolak-Zych, dr inż. Barbarze Szaraniec, dr Timothy Douglasowi, Pani mgr inż. Barbarze Trybalskiej, dr inż. Aleksandrze Benko, dr inż. Magdalenie Leśniak, mgr inż. Aleksandrze Wajdzie.
Szczególne podziękowania za ogromne pokłady cierpliwości, wsparcie i nieustającą wiarę we mnie należą się mojej Żonie, Kindze.
S T R E S Z C Z E N I E | 8
STRESZCZENIE
Głównym celem niniejszej rozprawy było wykazanie, że bioaktywne szkła w postaci cząstek, zastosowane jako faza modyfikująca bioresorbowalną matrycę polimerową, stanowią efektywne narzędzie do sterowania właściwościami kompozytów istotnymi z punktu widzenia zastosowania ich w medycynie regeneracyjnej i inżynierii tkanki kostnej. Drugim, równie ważnym celem badań było opracowania wielofunkcyjnych, kompozytowych nośników związków pochodzenia roślinnego (polifenoli), wykazujących kontrolowaną aktywność biologiczną.
W toku prowadzonych badań zastosowano szereg metod wytwarzania kompozytów na bazie poli(ε-kaprolaktonu), otrzymując materiały w postaci folii, membran i rusztowań. Zmiennymi parametrami fazy modyfikującej był skład chemiczny (A2 - szkło wysokowapniowe oraz S2 - szkło wysokokrzemionkowe), frakcja ziarnowa (<3 µm, <45 µm) oraz udział modyfikatora w tworzywach (12 %obj., 21 %obj.). Wytworzone materiały kompozytowe scharakteryzowano pod kątem mikrostruktury, parametrów powierzchni, właściwości mechanicznych, krystaliczności osnowy polimerowej, bioaktywności, degradacji hydrolitycznej oraz odpowiedzi komórek osteoblastycznych w warunkach in vitro. Kompozytowe nośniki związków polifenolowych wytworzono w postaci folii, a fazę modyfikującą w tym przypadku stanowiły cząstki bioaktywnych szkieł otrzymanych metodą topienia oraz techniką zol-żel. Badania uzyskanych materiałów obejmowały przede wszystkim ocenę kinetyki uwalniania związków polifenolowych, właściwości przeciwutleniających oraz aktywności przeciwnowotworowej.
W ramach realizacji pracy udowodniono, że wprowadzenie do bioresorbowalnej matrycy polimerowej modyfikatora w postaci cząstek bioaktywnych szkieł o zróżnicowanej charakterystyce (koncentracji, wielkości i składzie chemicznym) stanowi skuteczne narzędzie pozwalające na sterowanie szeregiem właściwości fizykochemicznych, mechanicznych oraz biologicznych materiałów kompozytowych. Wykazano również, że zastosowanie różnorodnych metod wytwarzania oraz ich modyfikacja stanowi drugą, równie efektywną drogę otrzymywania kompozytów o kontrolowanych właściwościach, dodatkowo zróżnicowanych pod względem formy. Przeprowadzenie kompleksowych badań pozwoliło na stwierdzenie, że nie tylko powszechnie analizowane parametry fazy modyfikującej, takie jak koncentracja, czy kształt/wielkość, ale także jej skład chemiczny determinują w znacznym stopniu wymienione wyżej właściwości materiałów. Innowacyjnym podejściem było zastosowanie opracowanych kompozytów jako nośników naturalnych związków biologicznie aktywnych. Pozwoliło to na uzyskanie bioresorbowalnych i bioaktywnych materiałów o kontrolowanych właściwościach przeciwutleniających i potencjalnym działaniu terapeutycznym (aktywności przeciwnowotworowej).
A B S T R A C T | 10
ABSTRACT
The primary goal of the presented thesis was to prove that bioactive glass particles, used as modifiers for bioresorbable polymer matrix, provide an efficient tool to control physicochemical, mechanical and biological properties of composite materials, relevant to bone tissue engineering and regenerative medicine. The second equally important goal of research was to develop multifunctional composite carriers for biological active plant-derived substances (polyphenols) with controlled biological activity.
A number of preparation techniques was applied to obtain poly(ε-caprolactone)-based composite materials in three various forms – films, porous membranes and three-dimensional scaffolds. Sol-gel-derived bioactive glass particles differ in chemical composition (calcium-rich and silica-(calcium-rich glasses), particle size (<3 µm, <45 µm), and content in materials (12 vol.%, 21 vol.%) were used. Obtained composite materials were characterized in terms of microstructure, surface parameters, mechanical properties, crystallinity of polymer matrix, in vitro bioactivity, hydrolytic degradation, and osteoblastic cell response. Composite carriers were prepared in the form of films modified with sol-gel-derived and melt-derived bioactive glass particles. In vitro bioactivity, kinetics of polyphenol release, antioxidant properties, and in vitro antiproliferative activity against cancer cells were evaluated. In the course of the studies, it had been proven that the incorporation of bioactive glass particles with different characteristics (particle composition, size, and content) into bioresorbable matrix provide an useful tool to control physicochemical, mechanical and biological properties of composite materials. Furthermore, it had been shown that different preparation methods and their variables afford second equally important avenue for obtaining composites with tunable properties, additionally in various forms. The results indicate that surface properties, chemical reactivity, and degradation process of composites are affected not only by commonly considered parameters of fillers, such as size/shape and content in material, but also by their chemical composition. The incorporation of polyphenolic compounds into composite matrix allow one to obtain bioresorbable and bioactive materials with tunable antioxidant and potential therapeutic activity (anticancer properties).
I N D E K S S K R Ó T Ó W i O Z N A C Z E Ń S T O S O W A N Y C H W P R A C Y | 12
INDEKS SKRÓTÓW i OZNACZEŃ STOSOWANYCH W PRACY
A2 - wysokowapniowe szkło bioaktywne z układu SiO2-CaO-P2O5ACP – amorficzny fosforan wapnia (ang. amorphous calcium phosphate) AFM - mikroskop sił atomowych
ALP - fosfataza alkaliczna (ang. alkaline phosphatase)
AS - powierzchnia folii/membran mająca kontakt z powietrzem/parami rozpuszczalnika AW-GC – szkło-ceramika apatytowo-wollastonitowa (ang. apatite-wollastonite glass ceramic) BCP – dwufazowa ceramika fosforanowo-wapniowa (ang. biphasic calcium phosphate) BMP - białka morfogenetyczne kości (ang. bone morphogenetic proteins)
CaP – fosforan wapnia
CDHA – hydroksyapatyt zubożony w wapń (ang. calcium deficient hydroxyapatite) CHA - hydroksyapatyt węglanowy (ang. carbonated hydroxyapatite)
da - gęstość pozorna
DCM – dichlorometan, CH2Cl2
DCPD – fosforan dwuwapniowy dwuwodny, bruszyt (ang. dicalcium phosphate dihydrate) DIOX - 1,4-dioksan, C4H8O2
DMEM - pożywka do celów hodowli komórkowych (Dulbecco's modified Eagle medium) DSC - różnicowa kalorymetria skaningowa
E- moduł Younga
ECM - macierz zewnątrzkomórkowa (ang. extracellular matrix) EDX - spektrometr dyspersji energii promieniowania rentgenowskiego FBS - płodowa surowica bydlęca (ang. foetal bovine serum)
F-C – odczynnik/metoda Folin–Ciocalteu
FGF – czynnik wzrostu fibroblastów (ang. fibroblast growth factor) FTIR - spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera GBR - sterowana regeneracja kości (ang. guided bone regeneration)
GS - powierzchnia folii/membran pozostająca w kontakcie ze szklanym podłożem HAp - hydroksyapatyt
HDPE – polietylen wysokiej gęstości
HIF-1α - czynnik indukowany hipoksją 1α (ang. hypoxia inducible factor 1α)
ICP-OES - atomowa spektrometria emisyjna ze wzbudzeniem w plazmie indukowanej Lhkl - wielkość krystalitów
MG-63 - linia komórek osteoblasycznych izolowanych z ludzkiego kostniakomięsaka MSC - mezenchymalne komórki macierzyste (ang. mesenchymal stem cells)
I N D E K S S K R Ó T Ó W i O Z N A C Z E Ń S T O S O W A N Y C H W P R A C Y | 13
NC - stopień polimeryzacji więźby krzemo-tlenowej szkła (ang. network connectivity) ne - porowatość efektywna
NHOst - ludzkie osteoblasty normalne (ang. normal human osteobasts)
NIPS - inwersja faz indukowana nierozpuszczalnikiem (ang. non-solvent induced phase separation) OCP - fosforan ośmiowapniowy (ang. octacalcium phosphate)
PBS - buforowana sól fizjologiczna (ang. phosphate buffered saline) PCL - poli(ε-kaprolakton)
PDLLA – poli(DL-laktyd) PDMS – polidimetylosiloksan PGA – poliglikolid
PHB – polihydroksymaślan
PI - inwersja faz (ang. phase inversion) PLA – polilaktyd
PLCL – kopolimer L-laktydu i ε-kaprolaktonu PLGA - kopolimer L-laktydu i glikolidu PLLA – poli(L-laktyd)
PMMA - polimetakrylan metylu
POM - mikroskopia optyczna w świetle spolaryzowanym PPh - związki polifenolowe (ang. polyphenols)
PTFE - poli(tetrafluoroetylen)
RGD - sekwencja aminokwasowa Arg-Gly-Asp
S2 – wysokokrzemionkowe szkło bioaktywne z układu SiO2-CaO-P2O5 SBF – sztuczne osocze (ang. simulated body fluid)
SC - odlewanie z roztworu (ang. solvent casting)
SCPL - odlewanie z roztworu z wymywaniem porogenu (ang. solvent casting particulate leaching) SEM - skaningowy mikroskop elektronowy
SLPS - inwersja faz w układzie ciało stałe-ciecz (ang. solid-liquid phase separation) TCP - ortofosforanu (V) wapnia (ang. tricalcium phosphate)
TEOS – tetraetoksysilan, Si(OC2H5)4 TEP - trietanolan fosforu, OP(OC2H5)3 Tg – temperatura zeszklenia
TGF-β - transformujący czynnik wzrostu β (ang. transforming growth factor β) THF – tetrahydrofuran, C4H8O
TIPS - inwersja faz indukowana termicznie (ang. thermally induced phase separation) Tm - temperatura topnienia
I N D E K S S K R Ó T Ó W i O Z N A C Z E Ń S T O S O W A N Y C H W P R A C Y | 14
VEGF - czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (ang. vascular endothelial growth factor) WAXS - szerokokątowa dyfrakcja rentgenowska
WM266-4 – nowotworowa linia komórek izolowanych z czerniaka ludzkiego εb - wydłużenie przy zerwaniu
σM - wytrzymałość na rozciąganie χc - stopień krystaliczności
W P R O W A D Z E N I E | 16
I. WPROWADZENIE
Inżynieria tkankowa, w najprostszym ujęciu, opiera się na indukowaniu procesów regeneracji tkanek poprzez dostarczenie do miejsca ubytku odpowiednich komórek, związków biologicznie aktywnych, a co najważniejsze, odpowiednio zaprojektowanych struktur w postaci biomateriałów umożliwiających wzrost nowej, funkcjonalnej tkanki [1]. W dużej mierze to właściwości biomateriału decydują o powodzeniu terapii, a co ważne, cechy jakimi powinien się on charakteryzować warunkowane są miejscem jego przeznaczenia. Dzisiejsza wiedza pozwala stwierdzić, że odpowiednio zaprojektowany materiał, dostarczając bodźców chemicznych, fizycznych, czy też mechanicznych, jest w stanie samodzielnie indukować procesy naprawcze organizmu. Wymaga to jednak precyzyjnego sterowania właściwościami materiałów na poziomie ich składu chemicznego, kinetyki rozpuszczania, czy degradacji, mikrostruktury, parametrów powierzchni w skali zarówno mikro jak również nanometrycznej, jak również parametrów mechanicznych.
Grupą materiałów, które dzięki kontrolowanemu rozpuszczaniu mogą aktywnie stymulować regenerację tkanki kostnej są bioaktywne szkła krzemianowe. Bodźcami chemicznymi, w tym przypadku, są uwalniane ze struktury materiału biologicznie aktywne jony, przede wszystkim Ca2+ i Si4+, które przy odpowiednim stężeniu w środowisku tkankowym indukują szereg procesów wewnątrzkomórkowych prowadzących do osteogenezy. Ponadto, bioaktywne szkła, z uwagi na wysoką reaktywność chemiczną powierzchni, zdolne są do tworzenia trwałego wiązania z tkanką kostną, co czyni je materiałami wysoce biozgodnymi [2].
Szczególne znaczenie w inżynierii tkanki kostnej odgrywają biodegradowalne kompozyty polimerowe. Dobór materiału oraz parametrów fazy modyfikującej, a także zastosowanie różnorodnych metod przetwarzania kompozytów na osnowie polimerowej pozwala na sterowanie szeregiem właściwości bezpośrednio warunkujących odpowiedź biologiczną, obejmujących parametry powierzchni, mikrostrukturę, wytrzymałość mechaniczną, czy szybkość degradacji. Ponadto, materiały tego typu mogą jednocześnie zostać zastosowane jako systemy dostarczania związków biologicznie aktywnych [3].
Biorąc powyższe pod uwagę tematyka pracy dotyczy możliwości modyfikacji bioresorbowalnej matrycy w postaci poli(ε-kaprolaktonu) cząstkami bioaktywnych szkieł o zróżnicowanej charakterystyce w celu uzyskania wielofunkcyjnych materiałów kompozytowych do potencjalnych zastosowań w medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkanki kostnej.
W P R O W A D Z E N I E | 17
Tezę pracy sformułowano następująco:
Bioaktywne szkła w postaci cząstek, zastosowane jako faza modyfikująca bioresorbowalną matrycę polimerową, stanowią efektywne narzędzie do sterowania właściwościami kompozytów istotnymi z punktu widzenia zastosowania ich w medycynie regeneracyjnej i inżynierii tkanki kostnej.
Rozprawa doktorska stanowi spójny tematycznie zbiór 8 artykułów, opublikowanych w czasopismach znajdujących się w bazie Journal Citation Reports (JCR), obejmujących jedną pracę przeglądową [D1] oraz siedem prac oryginalnych [D2-D8]. Rozdział II pracy stanowi przegląd literaturowy, którego integralną częścią jest publikacja D1. W rozdziale III sformułowano cel i zakres przeprowadzonych badań. W rozdziale IV, w celu zweryfikowania przyjętej tezy, omówiono wyniki zawarte w publikacjach D2-D8, a także przedstawiono najważniejsze osiągnięcia uzyskane w ramach realizacji pracy oraz dalsze perspektywy badawcze.
Przedstawiona poniżej lista artykułów została sporządzona w kolejności ich cytowania w pracy, a kopie publikacji stanowią Załącznik 1. Oświadczenia współautorów określające ich wkład w powstanie poszczególnych publikacji zamieszczone są w Załączniku 2.
D1 M Dziadek, E Stodolak-Zych, K Cholewa-Kowalska, Biodegradable ceramic-polymer composites for biomedical applications: A review, Mater Sci Eng C 2017, 71:1175– 1191.
IF: 4.164, Punktacja MNiSW: 30
D2 M Dziadek, J Pawlik, E Menaszek, E Stodolak-Zych, K Cholewa-Kowalska, Effect of the preparation methods on architecture, crystallinity, hydrolytic degradation, bioactivity and biocompatibility of PCL/bioglass composite scaffolds, J Biomed Mater Res-B 2015, 103(8):1580–1593.
IF: 2.881, Punktacja MNiSW: 30
D3 M Dziadek, E Menaszek, B Zagrajczuk, J Pawlik, K Cholewa-Kowalska, New generation poly(ε-caprolactone)/gel-derived bioactive glass composites for bone tissue engineering: Part I. Material properties, Mater Sci Eng C 2015, 56:9–21.
IF: 3.420, Punktacja MNiSW: 25
D4 M Dziadek, B Zagrajczuk, E Menaszek, K Cholewa-Kowalska, A new insight into in vitro behaviour of poly(ε-caprolactone)/bioactive glass composites in biologically related fluids, J Mater Sci 2018, 53(6):3939–3958.
W P R O W A D Z E N I E | 18
D5 M Dziadek, B Zagrajczuk, M Ziabka, K Dziadek, K Cholewa-Kowalska, The role of solvent type, size and chemical composition of bioactive glass particles in modulating material properties of poly(ε-caprolactone) based composites, Compos Part A-Appl S 2016, 90:90–99.
IF: 4.075, Punktacja MNiSW: 50
D6 M Dziadek, B Zagrajczuk, E Menaszek, K Dziadek, K Cholewa-Kowalska, Poly(ε-caprolactone)-based membranes with tunable physicochemical, bioactive and osteoinductive properties, J Mater Sci 2017, 52(22):12960–12980.
IF: 2.599, Punktacja MNiSW: 30
D7 M Dziadek, K Dziadek, B Zagrajczuk, E Menaszek, K Cholewa-Kowalska, Poly(ε-caprolactone)/bioactive glass composites enriched with polyphenols extracted from sage (Salvia officinalis L.), Mater Lett 2016, 183: 386–390.
IF: 2.572, Punktacja MNiSW: 35
D8 M Dziadek, K Dziadek, A Kopec, B Zagrajczuk, K Cholewa-Kowalska, Antioxidant activity of novel PCL/bioactive glass composites enriched with polyphenolic compounds extracted from fruits and leaves of sweet cherry (Prunus avium L.), Mater Lett 2017, 203: 28–31.
P R Z E G L Ą D L I T E R A T U R O W Y | 20
II. PRZEGLĄD LITERATUROWY
2.1. Ograniczenia zdolności regeneracyjnych tkanki kostnej
Tkanka kostna jest jedną z niewielu tkanek ludzkiego organizmu zdolną do gojenia bez tworzenia tkanki bliznowatej (tkanki łącznej włóknistej), dzięki czemu odbudowana kość nie różni się strukturalnie ani funkcjonalnie od tkanki natywnej. Proces gojenia się złamań, bez interwencji chirurgicznej, zachodzi głównie na podłożu łącznotkankowym (w przypadku kości płaskich), a także chrzęstnym (w przypadku kości długich) i obejmuje poszczególne etapy obserwowane w okresie płodowym rozwoju kości, w związku z czym można uznać go za formę regeneracji [4].
Pomimo dużych zdolności regeneracyjnych tkanki kostnej szacuje się, że 5 – 10% wszystkich złamań zaliczyć można do uszkodzeń, w których zrost kostny jest opóźniony, nie występuje lub prowadzi do rozwoju stanu patologicznego jakim jest staw rzekomy [5]. Do czynników mogących przyczynić się do zaburzeń zrostu kostnego zaliczyć można wiek (wraz z wiekiem zdolność regeneracyjna kości znacznie spada), płeć (zmienioną gospodarkę hormonalną u kobiet po 55 roku życia), układowe choroby towarzyszące (cukrzycę, osteoporozę), infekcje bakteryjne, czy rozległe uszkodzenia naczyń krwionośnych upośledzające ukrwienie uszkodzonych obszarów [6]. Duży problem kliniczny stanowią również ubytki krytyczne, to jest niezdolne do spontanicznej regeneracji, powstałe na skutek urazów, resekcji guzów nowotworowych, zabiegów rewizyjnych po nieudanej alloplastyce, czy aseptycznej martwicy kości [5]. Ponadto, ubytki kości żuchwy i szczęki stanowią poważne ograniczenie w szybko rozwijającej się implantologii stomatologicznej [7].
Obecnie „złotym standardem” wypełniania ubytków kostnych zarówno w chirurgii ortopedycznej, jak również szczękowo-twarzowej są przeszczepy autologiczne, obejmujące pobranie tkanki kostnej z obszarów, które nie przenoszą obciążeń (np. grzebienia talerza kości biodrowej) i przeszczepienie jej w miejsce ubytku. Obarczone są one jednak licznymi ograniczeniami, do których zaliczyć należy często niewystarczającą objętość przeszczepu, a także konieczność przeprowadzenia dodatkowej operacji pobrania przeszczepu, będącej źródłem powikłań okołooperacyjnych, w tym dużej śmiertelności, a także wydłużającej całkowity czas zabiegu. Ponadto, w przypadku dużych ubytków kostnych (>5 cm) często obserwuje się resorpcję przeszczepu bez uzyskania zamierzonego efektu. Alternatywnym podejściem są alloprzeszczepy oraz ksenotransplantacje, jednak ich zastosowanie jest ograniczone przede wszystkim ze względu na ryzyko wywołania odpowiedzi immunologicznej prowadzącej do odrzucenia przeszczepu, a także transmisji patogenów [5, 8]. Biorąc pod uwagę powyższe ograniczenia, jak również rosnące oczekiwania społeczeństwa w zakresie jakości życia, obserwowany proces starzenia się społeczeństw oraz wzrastającą średnią długość życia poszukiwane są nowe, skuteczniejsze strategie regeneracji tkanki kostnej.
P R Z E G L Ą D L I T E R A T U R O W Y | 21
Obiecujące i obecnie coraz częściej stosowane rozwiązania oparte są na stosowaniu różnego typu biomateriałów.
2.2. Rola biomateriału w regeneracji ubytków kostnych
W 2002 roku L.L. Hench i J.M. Polak [9] zaproponowali podział stosowanych biomateriałów klasyfikując je do jednej z trzech grup: biomateriałów inertnych (I generacja), biomateriałów bioaktywnych lub biodegradowalnych (II generacja), biomateriałów zarówno bioaktywnych, jak również biodegradowalnych indukujących regenerację tkanki (III generacja). Kryterium tego podziału wynika wprost z ewolucji wymagań stawianych biomateriałom, a także oczekiwanych właściwości jakimi miały się one charakteryzować. Oznacza to, że materiały wszystkich trzech grup stosowane są w klinice do dnia dzisiejszego, w zależności od zastosowania. Należy tutaj podkreślić, że w medycynie regeneracyjnej i inżynierii tkanki kostnej największe znaczenie mają biomateriały II i III generacji.
Biomateriały I generacji
Wymagania stawiane biomateriałom I generacji ograniczały się przede wszystkim do jak najlepszego dopasowania właściwości fizycznych i mechanicznych materiału do tkanki, odporności na korozję/degradację, braku toksyczności, kancerogenności, czy właściwości uczulających, a także zredukowanej do minimum aktywacji układu immunologicznego, w tym reakcji około ciała obcego [10]. Właściwości te jednocześnie były wyznacznikiem biozgodności biomateriałów I generacji. Materiały dobierano, lub sporadycznie projektowano, w taki sposób aby wykazywały minimalną reaktywność chemiczną w środowisku biologicznym – inertność (bioobojętność). Do biomateriałów inertnych zaliczyć można przede wszystkim biomateriały metaliczne, ceramiczne i polimerowe. Znajdują one zastosowanie w ortopedii przede wszystkim jako elementy endoprotez stawów, elementy stosowane w osteosyntezie (np. płytki zespalające, gwoździe śródszpikowe - np. tytan i jego stopy, stal nierdzewna, pasywowane stopy kobaltowo-chromowe), cementy kostne (np. PMMA), czy też porowate wypełnienia ubytków kostnych (ceramika korundowa). Materiały bioobojętne (głównie PTFE), w postaci porowatych membran, stosowane są w sterowanej regeneracji kości (GBR, ang. guided bone regeneration), jednak coraz częściej zastępowane są materiałami biodegradowalnymi (kolagen, poliestry alifatyczne). Istotnych obserwacji dotyczących regeneracji ubytków kości dokonano na podstawie przypadku opisanego przez A.C. Masquelet’a w 1986 roku. W celu tymczasowego uzupełnienia krytycznego ubytku kości, pozwalającego na wygojenie się okolicznych tkanek miękkich, zastosowano cement kostny na bazie inertnego materiału jakim jest polimetakrylan metylu (PMMA). Skutkowało to uformowaniem się torebki otaczającej materiał, określanej później jako „induced membrane”. Po całkowitym wygojeniu tkanek miękkich, usunięciu cementu kostnego i wypełnieniu ubytku przeszczepem autologicznym zaobserwowano szybką
P R Z E G L Ą D L I T E R A T U R O W Y | 22
regenerację tkanki kostnej, co ważne, bez resorpcji przeszczepu. Ta przypadkowo odkryta metoda (znana jako „Masquelet technique” lub „concept of induced membranes”) jest stosowana do dzisiaj w regeneracji rozległych ubytków (≤25 cm) kości długich, przy wykorzystaniu przeszczepów auto-/allologicznych lub wypełnień na bazie syntetycznych materiałów kościozastępczych (np. hydroksyapatytu). Późniejsze badania histologiczne i immunohistochemiczne z wykorzystaniem modeli zwierzęcych wykazały, że uformowana torebka jest bogato unaczyniona i składa się głównie z kolagenu typu I oraz fibroblastów. Niska liczebność makrofagów oraz komórek olbrzymich około ciała obcego świadczyły o umiarkowanym stanie zapalnym, indukowanym obecnością PMMA. Dodatkowo w obrębie torebki zaobserwowano istotny wzrost wydzielania czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), transformującego czynnika wzrostu β (TGF-β), a także białka morfogenetycznego kości 2 (BMP-2), indukujących proliferację oraz różnicowanie mezenchymalnych komórek macierzystych, a zatem sprzyjających regeneracji tkanki kostnej [11]. Badania te po raz pierwszy wskazały na istotną rolę odpowiedzi immunologicznej wywołanej obecnością biomateriału w procesie regeneracji tkanki kostnej.
Zatem szybko dowiedziono, że żaden z dostępnych wówczas biomateriałów, wbrew początkowym oczekiwaniom, nie jest całkowicie bioobojętny, co więcej stwierdzono, że w zależności od zastosowania, nie jest to cecha konieczna. Duży postęp w zakresie badań nad biomateriałami, a przede wszystkim poznanie procesów zachodzących na granicy komórka/tkanka-biomateriał, a także szybko poszerzający się zakres stosowania biomateriałów skłoniły do poszukiwania i projektowania materiałów aktywnych biologicznie – zdolnych do indukowania pożądanej odpowiedzi organizmu oraz uczestniczących w procesie regeneracji tkanki. Nowe spojrzenie na biomateriały zaowocowało w 1987 roku zaktualizowaną definicją biozgodności, określaną jako zdolność materiału do spełniania funkcji biologicznych w określonym zastosowaniu, zgodnej z przeznaczeniem biomateriału, a także zapoczątkowało erę biomateriałów II generacji [12].
Biomateriały II generacji
Do grupy biomateriałów II generacji zaliczyć można ceramikę bioaktywną (ceramikę fosforanowo-wapniową, a także bioaktywne szkła i szkło-ceramikę). Materiały bioaktywne niewątpliwie zrewolucjonizowały metody leczenia ubytków kostnych, co wynika przede wszystkim z ich bardzo dobrych właściwości osteointegracyjnych. Właściwości te związane są ze zdolnością do tworzenia trwałego wiązania materiału z tkanką kostną poprzez krystalizującą na jego powierzchni warstwę biomimetycznego hydroksyapatytu węglanowego (CHA), bez formowania się łącznotkankowej torebki włóknistej, obserwowanej w przypadku materiałów inertnych, a także ich wysokim potencjałem osteokondukcyjnym.
P R Z E G L Ą D L I T E R A T U R O W Y | 23
Korzystne właściwości ceramiki fosforanowo-wapniowej (CaP), w tym hydroksyapatytu (HAp), β ortofosforanu (V) wapnia (β-TCP) i ceramiki dwufazowej (BCP), wynikają przede wszystkim z jej dużego podobieństwa chemicznego oraz fazowego do nieorganicznej części tkanki kostnej, co sprzyja procesom biologicznym ukierunkowanym na formowanie się nowej tkanki [13, 14]. Wykazano, że istotną rolę w mechanizmie powstawania połączenia pomiędzy syntetycznym hydroksyapatytem, a tkanką kostną odgrywa wzrost epitaksjalny CHA wynikający z podobieństwa struktur krystalicznych obu faz [15, 16]. Proces osteointegracji uwarunkowany jest również rozpuszczaniem się jonów fosforanowych (HPO42-, PO43-) i wapniowych (Ca2+) ze struktury materiału. Prowadzi to do lokalnego przesycenia środowiska tkankowego, co skutkuje wytrąceniem się warstwy fosforanowo-wapniowej na powierzchni materiału, a następnie przez włączenie innych jonów (np. Mg2+, Na+, CO
32-), obecnych w płynach fizjologicznych, krystalizacją CHA. Badania wskazują, że krystalizująca warstwa wzbogacona jest również w składniki organiczne, w tym białka [13, 14]. Zatem szybkość, a także intensywność formowania się na powierzchni ceramiki CaP warstwy CHA, a co za tym idzie wiązania się z tkanką kostną, w dużej mierze zależy od stopnia jej rozpuszczalności. Z kolei rozpuszczalność determinowana jest przede wszystkim stosunkiem Ca/P, składem fazowym, składem chemicznym (włączeniem do struktury innych jonów, np. Sr2+, Mg2+), a także pochodzeniem i metodą otrzymywania materiału. W szczególności ceramikę CaP, ze względu na stopień jej rozpuszczalności, można uszeregować w następujący sposób (od najbardziej rozpuszczalnej): β-TCP > HAp pozyskany z kości wołowych > HAp pozyskany z koralowca > HAp syntetyczny. Rozpuszczalność ceramiki dwufazowej BCP zależy od udziału poszczególnych faz krystalicznych tworzących materiał - β-TCP lub α-TCP i HAp [17]. Z uwagi na wysoką stabilność chemiczną hydroksyapatytu, proces formowania się warstwy CHA w warunkach in vivo na jego powierzchni przebiega za pośrednictwem aktywności osteoklastów, prowadzącej do lokalnego obniżenia pH i sprzyjającej tym samym rozpuszczaniu powierzchni materiału [14]. Obecnie ceramika fosforanowo-wapniowa, w szczególności HAp, szeroko stosowana jest w postaci proszków, granul oraz porowatych kształtek do wypełnień ubytków kostnych, a także jako pokrycia na implantach ortopedycznych i stomatologicznych.
Przełomowym odkryciem, dokonanym pod koniec lat 60’ XX wieku przez L.L. Hench’a, był syntetyczny biomateriał wykazujący zdolność do trwałego łączenia się z tkanką kostną – bioaktywne szkło, znane jako Bioglass® 45S5, o składzie (%mas.) 45% SiO
2, 24,5% Na2O, 24,5% CaO, 6% P2O5 [18]. Późniejsze badania wykazały, że szkło 45S5 tworzy wiązanie również z tkanką łączną miękką, co związane jest przede wszystkim z dużą reaktywnością powierzchni prowadzącą do jej przebudowy, co sprzyja przyłączaniu się włókien kolagenowych, jak również różnicowaniu komórek progenitorowych. O ile procesy łączenia się bioaktywnych szkieł z tkanka kostną są szeroko opisane w literaturze, o tyle mechanizm
P R Z E G L Ą D L I T E R A T U R O W Y | 24
wiązania się z tkanką miękką nie jest w pełni poznany [19, 20]. Należy podkreślić, że materiał ten, w odróżnieniu od ceramiki CaP, charakteryzuje się odmiennym w stosunku do mineralnej części kości składem chemicznym oraz fazowym. Odmienny jest także mechanizm wiązania się bioaktywnego szkła z tkanką kostną. Również zachodzi on poprzez formowanie się na jego powierzchni biomimetycznej warstwy hydroksyapatytu węglanowego, jednak proces ten związany jest z przebudową warstwy wierzchniej materiału. Mechanizm ten został przedstawiony przez Hench’a w 11 kolejnych etapach, przy czym pierwszych 5 jest rozpatrywanych jako faza przemian chemicznych i strukturalnych materiału, a kolejne 6 jako faza procesów biologicznych. W pierwszym etapie dochodzi do szybkiej wymiany jonów Na+ i Ca2+ w strukturze szkła na jony H
3O+ pochodzące z płynów fizjologicznych (i), a także zrywania wiązań Si-O-Si związanego z lokalną alkalizacją środowiska, co skutkuje formowaniem się licznych grup silanolowych Si-OH (ii). Repolimeryzacja grup Si-OH prowadzi do powstawania żelu krzemionkowego zubożonego w jony Na+ i Ca2+ (iii) – silnie zmodyfikowanej chemicznie i strukturalnie warstwy wierzchniej szkła. Następnie migracja jonów Ca2+ oraz PO
43- przez porowatą warstwę żelu do jego powierzchni prowadzi do formowania amorficznej warstwy fosforanowo-wapniowej. Jednocześnie proces ten intensyfikowany jest chemisorpcją jonów wapniowych, a następnie fosforanowych pochodzących z płynu fizjologicznego, czemu sprzyja ujemnie naładowana powierzchnia żelu krzemionkowego (iv). Dalsze wzbogacanie powierzchni w jony Ca2+ oraz PO43-, a także OH- i CO32- skutkuje krystalizacją i wzrostem warstwy CHA (v). Następnie dochodzi do włączenia do formującej się warstwy składników organicznych (np. białek, czynników wzrostu, cytokin) (vi), a także przyłączenia się makrofagów (vii). Kolejne etapy obejmują adhezję komórek prekursorowych (viii), ich różnicowanie w kierunku osteoblastów, proliferację (ix), a także wydzielanie składników macierzy zewnątrzkomórkowej (x) i jej mineralizację (xi), prowadząc do formowania się tkanki kostnej [16, 21]. Przedstawiony proces jest mocno uproszczony i pozwala wyróżnić etapy (1-5), które mogą zostać zaobserwowane w warunkach in vitro, podczas inkubacji materiałów w różnych płynach buforowych (np. SBF, PBS, Tris-HCl), popularnie stosowanych w tak zwanym „teście bioaktywności in vitro”. W rzeczywistości, w warunkach in vivo, fazy „chemiczna” i „biologiczna” tworzenia się połączenia z tkanką kostną nie są rozdzielone w czasie. Mianowicie, pierwszym zjawiskiem zachodzącym niemal natychmiast po umieszczeniu biomateriału w środowisku tkankowym jest adsorpcja białek do jego powierzchni. Ponadto, włączanie składników organicznych (np. białek, czynników wzrostu, cytokin) do wysoko porowatej struktury żelu krzemionkowego zachodzi w sposób ciągły w trakcie jego formowania [21]. Procesy te w bezpośredni sposób rzutują na tworzenie się amorficznej warstwy CaP, a następnie jej krystalizację, a także determinują odpowiedź komórkową, wpływając tym samym na cały proces tworzenia wiązania. W związku
P R Z E G L Ą D L I T E R A T U R O W Y | 25
z powyższym, w celu wstępnej oceny bioaktywności materiałów, często wykorzystywane są płyny inkubacyjne zawierające, obok jonów występujących w osoczu krwi, również składniki organiczne, w tym białka, aminokwasy, witaminy itp. (np. pożywka do celów hodowli komórkowych wzbogacona surowicą, czy SBF wzbogacony konkretnymi białkami – albuminą, fibronektyną itp.). Badania wskazują, że obecność białek w medium inkubacyjnym może działać hamująco/opóźniająco na krystalizację warstwy CHA, z jednej strony zmniejszając rozpuszczalność bioaktywnej ceramiki w wyniku adsorpcji białek na jej powierzchni, a z drugiej poprzez chelatujące właściwości składników organicznych wobec jonów Ca2+. Ponadto, zaadsorbowana warstwa białek może modyfikować potencjał zeta powierzchni materiału lub też stanowić miejsca heterogenicznego zarodkowania CHA [22–24].
W 1991 roku L.L. Hench po raz pierwszy zastosował metodę zol-żel w celu otrzymania bioaktywnych szkieł, co przyniosło zaskakujące rezultaty. Przeprowadzone badania pozwoliły stwierdzić, że trójskładnikowe szkła (SiO2-CaO-P2O5) pochodzenia żelowego zawierające nawet do 90 mol% SiO2 wykazują bioaktywność [20, 25]. Należy podkreślić, że w przypadku szkieł topionych, zawartość 60 mol% SiO2 jest zawartością graniczną skutkującą zahamowaniem procesu bioaktywności. Co więcej, wykazano, że formowanie się warstwy CHA na powierzchni szkieł otrzymanych na drodze syntezy zol-żel zachodzi szybciej w porównaniu do szkieł topionych o tym samym składzie tlenkowym. Właściwości te związane są z czynnikami chemicznymi, a także teksturalnymi wynikającymi ze specyfiki metody zol-żel, w tym zastosowania niskotemperaturowej obróbki żelu (poniżej 800ºC). Materiały pochodzenia żelowego wykazują relatywnie duże rozwinięcie powierzchni właściwej, wynikające z obecności mezoporów, co bezpośrednio warunkuje ich wysoką rozpuszczalność. Dodatkowo, nie w pełni usunięte w procesie obróbki termicznej żelu grupy hydroksylowe (połączone z Si) obecne w materiale, dzięki ujemnemu ładunkowi, stanowią efektywny nukleator krystalizacji CHA [26, 27]. Najlepiej przebadanymi i opisanymi w literaturze trójskładnikowymi szkłami bioaktywnymi pochodzenia żelowego są 58S (60 mol% SiO2, 36 mol% CaO, 4 mol% P2O5) oraz 77S (80 mol% SiO2, 16 mol% CaO, 4 mol% P2O5) [28]. Metoda zol-żel pozwoliła na otrzymanie również dwuskładnikowego szkła 70S30C (70 mol% SiO2, 30 mol% CaO). Wykazano, że szybkość formowania się warstwy CHA na jego powierzchni, w trakcie inkubacji w SBF, jest porównywalna do szybkości obserwowanej dla szkła topionego 45S5 oraz żelowego 58S [29, 30]. Stosunkowo niedawno, metodę zol-żel zastosowano również do otrzymania czteroskładnikowego szkła 45S5. Jednak z uwagi na dużą tendencję układu do krystalizacji, nawet niskotemperaturowa obróbka żelu (700ºC) prowadzi do otrzymania materiału szklano-krystalicznego [31, 32]. Analiza bioaktywności w SBF wykazała, że materiał ten charakteryzuje się podobną w odniesieniu do materiału amorficznego uzyskanego klasyczną metodą topienia kinetyką krystalizacji warstwy CHA [31]. Zatem dowiedziono, że metoda zol-żel jest niezwykle uniwersalną techniką
P R Z E G L Ą D L I T E R A T U R O W Y | 26
pozwalającą na uzyskanie szkieł bioaktywnych w szerokim zakresie składów chemicznych, a co ważne, dzięki wprowadzeniu modyfikacji na etapie syntezy, również mocno zróżnicowanej postaci materiału – monolitów, porowatych kształtek, (nano)sfer, (nano)proszków, (nano)włókien, materiałów mezoporowatych o uporządkowanej strukturze porów (ang. mesoporous template glasses), czy powłok na powierzchniach metalicznych. Kolejnym wyzwaniem było uzyskanie wysoce bioaktywnego materiału o polepszonych w stosunku do szkieł oraz syntetycznego hydroksyapatytu właściwościach mechanicznych. W 1982 roku T. Kokubo, poprzez kierowaną krystalizację szkła z układu MgO–CaO–SiO2–P2O5 z dodatkiem 0,5 %mas. CaF2, otrzymał szkło-ceramikę apatytowo-wollastonitową (AW-GC, Cerabone®), zawierającą 38 %mas. oksyfluoroapatytu, 34 %mas. β-wollastonitu oraz 28 %mas. fazy szklistej [33]. Dzięki obecności rozpuszczalnej matrycy szklistej materiały szklano-ceramiczne zachowują dobre właściwości osteointegracyjne, z kolei faza krystaliczna zapewnia relatywnie wysokie parametry mechaniczne. Innym przykładem jest szkło-ceramika otrzymana na bazie topionego szkła 45S5 (z niewielkimi modyfikacjami w składzie chemicznym: 48,5% SiO2, 23,75% Na2O, 23,75% CaO, 4% P2O5, %mas.), zawierająca obok matrycy szklistej dwie fazy krystaliczne w postaci krzemianu i fosforanu sodowo-wapniowego (Na2CaSi2O6, NaCaPO4), znana jako Biosilicate®. Materiał ten wykazuje najwyższy stopień bioaktywności spośród wszystkich dostępnych komercyjnie materiałów szkło-ceramicznych [34].
W odniesieniu do odpowiedzi biologicznej wywołanej obecnością w organizmie biomateriału o kontrolowanej reaktywności powierzchni, wyróżniono dwie klasy bioaktywności. Materiały klasy A cechuje zdolność to tworzenia trwałego wiązania z tkanką kostną, jak również łączną tkanką miękką, ponadto posiadają one właściwości osteokondukcyjne, zapewniając rusztowanie dla proliferujących osteoblastów, a także właściwości osteoindukcyjne, stymulując komórki w kierunku formowania nowej tkanki kostnej. Do grupy materiałów bioaktywnych klasy A należy szkło 45S5 Bioglass®. Z kolei materiały klasy B są zdolne do wiązania wyłącznie z tkanką kostną, a także wykazują właściwości ostekondukcyjne. Do tej grupy materiałów zaliczyć można syntetyczny hydroksyapatyt oraz szereg szkieł bioaktywnych (Rysunek 1) [35, 36].
Najnowszą grupę biomateriałów II generacji stanowią szkła boranowe z podstawowego układu Na2O/K2O-CaO-B2O3. Bioaktywność tych materiałów polega na konwersji w hydroksyapatyt podczas inkubacji w SBF, przy czym proces ten zachodzi w krótkim czasie (ok. 48 h) ze względu na wysoki stopień ich rozpuszczania. W warunkach in vivo również następuje przebudowa szkła w HAp, pomimo zaobserwowanej cytotoksyczności materiałów w warunkach statycznej hodowli komórkowej (spowodowanej obecnością grup BO33-) [37, 38].
P R Z E G L Ą D L I T E R A T U R O W Y | 27
Rysunek 1. Reaktywność w warunkach in vivo bioaktywnych szkieł z układu SiO2-CaO-Na2O-P2O5
otrzymanych tradycyjną metodą topienia (zawartość P2O5 - 6 %mas.). Na podstawie [35]
Innym rodzajem aktywności biomateriałów należących do II generacji jest biodegradacja (bioresorpcja), która przebiegając w kontrolowany sposób pozwala na stopniowe zastępowanie materiału przez nowo powstającą tkankę. Do grupy materiałów II generacji zaliczyć można polimery pochodzenia naturalnego (biopolimery) w postaci białek (np. kolagen, elastyna, fibryna) i polisacharydów (np. kwas hialuronowy, siarczan chondroityny, chitozan, alginian), jak również polimery syntetyczne (np. polilaktyd – PLA, poliglikolid – PGA, poli(ε-kaprolakton) – PCL, polihydroksymaślan – PHB, a także kopolimery L-laktydu i glikolidu – PLGA; L-laktydu i ε-kaprolaktonu - PLCL). Materiały te w środowisku biologicznym ulegają degradacji (biodegradacji) na skutek hydrolizy prowadzącej do powstania niskocząsteczkowych produktów (oligomerów, monomerów). W przypadku polimerów syntetycznych obserwuje się degradację nieenzymatyczną w środowisku wodnym wynikającą z obecności w ich łańcuchu wiązań podatnych na hydrolizę (np. wiązań estrowych). Z kolei dla większości polimerów naturalnych proces ten przebiega z udziałem enzymów (z grupy hydrolaz). Wśród polimerów biodegradowalnych wyróżnić można grupę materiałów ulegających bioresorpcji w środowisku in vivo, co oznacza, że produkty ich degradacji usuwane są z organizmu na drodze przemian biochemicznych (np. poprzez włączenie do cyklu kwasu cytrynowego). Do polimerów tych należą przede wszystkim poliestry alifatyczne (np. PCL, PGA, PLA). Ze względu na szybkość degradacji, można uszeregować je w następujący sposób (od degradującego najszybciej): PGA > PDLLA > PLLA > PCL. W przypadku kopolimerów PLGA i PLCL czas degradacji zależy od udziału poszczególnych merów [3, 39–41].
P R Z E G L Ą D L I T E R A T U R O W Y | 28
Polimerem, który jest szeroko badany pod kątem zastosowania w inżynierii tkanki kostnej, przede wszystkim jako matryca kompozytów modyfikowanych fazą ceramiczną, jest poli(ε-kaprolakton) [42]. Poli(ε-poli(ε-kaprolakton) jest semikrystalicznym polimerem o temperaturze zeszklenia (Tg) około -60ºC i temperaturze topnienia (Tm) około 60ºC. Ze względu na wysoki stopień krystaliczności (nawet do 70%), hydrofobowy charakter związany z obecnością pięciu grup metylenowych w każdej z powtarzających się jednostek strukturalnych oraz stosunkowo niewielką liczbę wiązań estrowych podatnych na hydrolizę w łańcuchu, PCL charakteryzuje się długim czasem degradacji w warunkach in vivo (>2 lat) [43–46]. Dzięki temu uwalnianie kwasowych produktów degradacji PCL, które mogą prowadzić do stanu zapalnego, czy retencji płynów ustrojowych w miejscu wczepu, jest zredukowane [46]. W pierwszym etapie PCL ulega wyłącznie degradacji hydrolitycznej, a kiedy masa cząsteczkowa osiągnie wartość poniżej 3 kDa, wysoko krystaliczne produkty degradacji są fagocytowane przez makrofagi oraz fibroblasty, a następnie metabolizowane do 6-hydroksylowego kwasu kapronowego. Podlega on β-oksydacji, której produktem końcowym jest acetylokoenzym A, włączany do cyklu kwasu cytrynowego [43, 44]. Ze względu na długi czas degradacji zastosowanie PCL w inżynierii tkankowej jest ograniczone. W celu przyspieszenia jego degradacji stosowane są dwie strategie: (i) łączenie PCL z innymi, szybciej degradującymi poliestrami alifatycznymi (np. PLLA, PDLLA) poprzez kopolimeryzację lub tworzenie blend [47–49] lub (ii) modyfikację PCL hydrofilowymi wypełniaczami ceramicznymi (np. cząstkami nano-HAp, β-TCP, bioaktywnego szkła, krzemianowo-wapniowymi) [50–52]. Dobre rezultaty przynosi również łączenie wymienionych strategii w celu bardziej precyzyjnego sterowania kinetyką degradacji materiału, a także polepszenia jego właściwości mechanicznych [53, 54]. Z uwagi na niską temperaturę zeszklenia, w temperaturze ludzkiego organizmu PCL wykazuje wysoką elastyczność oraz przepuszczalność dla leków, dzięki czemu z powodzeniem jest testowany i stosowany (Capronor®) w systemach dostarczania substancji aktywnych [43, 44, 55]. W porównaniu do innych poliestrów alifatycznych PCL cechuje się relatywnie wysokimi parametrami mechanicznymi [56].
Materiały pochodzenia naturalnego na bazie białek, szczególnie w formie włóknistej, zdolne są do naśladowania funkcji naturalnej macierzy zewnątrzkomórkowej. Obecność w ich strukturze specyficznych sekwencji aminokwasowych wiążących receptory integrynowe, obecne w błonach komórkowych, umożliwiają adhezję komórek do powierzchni biomateriału oraz przekazywanie sygnałów regulujących procesy proliferacji, migracji i różnicowania, podobnie jak ma to miejsce w przypadku odziaływania komórka-ECM w tkance natywnej. Jednym z głównych ograniczeń stosowania polimerów naturalnych w inżynierii tkankowej jest niska powtarzalność właściwości materiału, a także możliwość wywołania niepożądanej odpowiedzi układu immunologicznego oraz transmisji patogenów. Ponadto, kinetyka degradacji biopolimerów w warunkach in vivo jest trudna do przewidzenia, ponieważ
P R Z E G L Ą D L I T E R A T U R O W Y | 29
w dużej mierze zależy od dostępności i ilości enzymów biorących udział w procesie degradacji [41]. Polimery syntetyczne, w przeciwieństwie do biopolimerów, nie wykazują zdolności do specyficznego oddziaływania z komórkami. Jednak, doskonała powtarzalność, duże możliwości przetwórcze, a także możliwość manipulacji właściwościami w szerokim zakresie czynią je doskonałymi kandydatami do zastosowań biomedycznych. Czas degradacji polimerów syntetycznych jest łatwiejszy do przewidzenia i możliwy do regulowania na poziomie strukturalnym (zmiana masy cząsteczkowej, czy stopnia krystaliczności), a także poprzez modyfikację powierzchni, czy jak wcześniej wspomniano łączenie polimerów o zróżnicowanej kinetyce degradacji (blendy polimerowe, kopolimery) [53, 54, 57].
Do grupy biomateriałów II generacji należy również ceramika resorbowalna, w tym materiały na bazie fosforanów wapnia oraz szkła i szkło-ceramika fosforanowa. Pojęcie resorpcji w tym przypadku odnosi się do stopniowego zastępowania implantu przez nowo powstającą tkankę. Proces resorpcji ceramiki fosforanowo wapniowej w środowisku in vivo oparty jest na trzech mechanizmach: (i) rozpuszczaniu materiału, (ii) dezintegracji tworzywa, której towarzyszy fagocytoza powstałych cząstek (<10 µm) przez makrofagi oraz wspomnianej wcześniej (iii) aktywności osteoklastów, biorących udział w przebudowie tkanki kostnej [58, 59]. Szybkość rozpuszczania ceramiki w dużej mierze zależy od stosunku molowego Ca/P, a także struktury krystalograficznej, stopnia krystaliczności, wielkości krystalitów, jak również porowatości, czy rozwinięcia powierzchni tworzywa. Materiały o stosunku Ca/P <1, z uwagi na wysoką rozpuszczalność w środowisku tkankowym, prowadzącą do znacznego obniżenia pH, nie znajdują zastosowania w medycynie. Największe znaczenie mają β-TCP (Ca/P 1,5) oraz ceramika dwufazowa BCP, stosowane jako bioaktywne, a zarazem resorbowalne wypełnienia ubytków kostnych [60, 61]. Ceramika w postaci α-TCP oraz DCPD (bruszytu, CaHPO4·2H2O), ze względu na wyższą rozpuszczalność, używana jest jako składniki cementów kostnych. W przypadku bruszytu, szybkość resorpcji dodatkowo determinowana jest kinetyką przemian (ACP-OCP-HAp/CHA/CDHA) w kontakcie z płynami fizjologicznymi, prowadzących do powstania bardziej stabilnej termodynamicznie fazy w postaci apatytu [59]. Z kolei, rozpuszczalność szkieł fosforanowych, których więźbę tworzą tetraedry PO4, rośnie wraz ze wzrostem zawartości P2O5. W szczególności wyróżnić można szkła ultrafosforanowe (>50 mol% P2O5), metafosforanowe (50 mol% P2O5), a także polifosforanowe (<50 mol% P2O5). Podobnie jak w przypadku ceramiki CaP, szybka degradacja szkieł o wysokim stopniu rozpuszczania może prowadzić do niepożądanego zakwaszenia środowiska tkankowego. Najczęściej analizowanymi w literaturze szkłami fosforanowymi są tworzywa dwuskładnikowe (P2O5-CaO, P2O5-Na2O), trójskładnikowe (P2O5-CaO-Na2O, P2O5-CaO-K2O) lub też szkła wieloskładnikowe zawierające dodatkowo takie tlenki jak MgO, ZnO, SrO [62, 63]. W celu zmniejszenia stopnia rozpuszczalności szkieł fosforanowych stosowany jest dodatek tlenków modyfikujących o wyższym potencjale jonowym (Fe2O3, Al2O3, TiO2), co skutkuje
P R Z E G L Ą D L I T E R A T U R O W Y | 30
wzrostem charakteru kowalencyjnego wiązań w strukturze szkła [64]. Zastosowanie kierowanej krystalizacji szkieł fosforanowych pozwala na redukcję stopnia ich rozpuszczania, przez co zyskują one właściwości bioaktywne w kontakcie z płynem fizjologicznym [65]. W przeciwieństwie do ceramiki fosforanowo-wapniowej, szkła fosforanowe ulegają resorpcji na drodze rozpuszczania, bez udziału aktywności komórkowej osteoklastów [66].
Biomateriały III generacji
W 2000 roku pionierskie badania grupy I.D. Xynos, J.M. Polak i L.L. Hench’a wykazały, że składniki uwalniane ze szkła topionego 45S5 Bioglass® regulują cykl komórkowy komórek progenitorowych w warunkach in vitro. Mianowicie w obecności produktów degradacji szkła, komórki niezdolne do różnicowania w kierunku dojrzałych osteoblastów, a następnie terminalnego różnicowania w kierunku osteocytów (dojrzałych komórek kostnych), są eliminowane z populacji na drodze programowanej śmierci – apoptozy. Z kolei osiągnięcie fenotypu dojrzałych osteoblastów zdolnych do wydzielania składników macierzy zewnątrzkomórkowej i mineralizacji następuje już po kilku godzinach hodowli, bez dodatku czynników wzrostu takich jak BMP czy deksametazon. Dowiedziono, że mechanizmy te oparte są na aktywacji 7 grup genów odpowiedzialnych za syntezę białek regulujących procesy różnicowania i proliferacji osteoblastów, to jest: czynników transkrypcyjnych i regulatorów cyklu komórkowego; regulatorów apoptozy; białek biorących udział w syntezie, naprawie oraz rekombinacji DNA; czynników wzrostu i cytokin; receptorów powierzchniowych komórki; cząsteczek sygnałowych; a także komponentów ECM. Wykazano, że składnikami stymulującymi odpowiedź wewnątrzkomórkową, prowadzącą do osteogenezy, są jony Ca2+ i Si4+. Ustalono, że efekt osteostymulacji obserwowany jest przy odpowiednim stosunku jonów i w odpowiednim zakresie ich stężeń (15-30 ppm Si oraz 60-90 ppm Ca) [36, 67–69]. Dalsze badania przeprowadzone z wykorzystaniem embrionalnych komórek macierzystych oraz ludzkich osteoblastów płodowych wykazały, że jony Ca2+ oraz Si4+, uwolnione ze szkła 58S otrzymanego na drodze syntezy zol-żel również indukują ekspresję szeregu genów związanych z osteogenezą [70–73].
Uzyskane wyniki dały początek idei projektowania materiałów zdolnych do indukowania pożądanej odpowiedzi komórkowej na poziomie molekularnym – biomateriałów III generacji. W 2008 roku D.F. Wiliams zaproponował nową definicję biozgodności, podkreślając, że obok zdolności materiału do spełniania funkcji biologicznych w określonym zastosowaniu medycznym, powinien on wywoływać najbardziej korzystną odpowiedź komórkową oraz tkankową dla osiągnięcia założonych efektów stosowanej terapii, nie powodując przy tym miejscowych, jak również ogólnoustrojowych działań niepożądanych [74].
P R Z E G L Ą D L I T E R A T U R O W Y | 31
W kolejnych badaniach wykazano nie tylko osteogenny, ale także angiogenny potencjał bioaktywnych szkieł w warunkach in vitro i in vivo, w szczególności szkła 45S5 Bioglass® [75]. Dowiedziono, że jony uwalniane ze struktury szkła 45S5 znacząco zwiększają ekspresję oraz sekrecję czynników proangiogennych (VEGF, FGF) przez fibroblasty w warunkach hodowli. Z kolei uwolnione czynniki stymulują proliferację komórek endotelialnych, a także formowanie struktur naczyniopodobnych [76]. Szczególną uwagę zwrócono na rolę jonów Si4+ uwalnianych z biomateriałów ceramicznych, w tym przede wszystkim szkieł krzemianowych, w indukowaniu osteo- i angiogenezy [77, 78]. Wskazano, że właściwości te prawdopodobnie związane są ze zdolnością jonów Si4+ do stabilizacji HIF-1α – czynnika transkrypcyjnego regulującego homeostazę tlenową i odgrywającego istotną rolę w procesach regeneracyjnych tkanek [79]. W ostatnich latach, w celu zwiększenia oraz bardziej precyzyjnego kontrolowania aktywności biologicznej bioaktywnych szkieł i nadania im zupełnie nowych właściwości (np. antybakteryjnych) stosuje się szereg modyfikacji składu chemicznego poprzez włączenie do ich struktury różnorodnych jonów (np. Zn, Sr, Mg, Ag, Ce, Cu, Co, Li) [80, 81].
W świetle przedstawionych powyżej prac kluczowe dla wywołania pożądanej odpowiedzi komórkowej jest uzyskanie biologicznie aktywnego stężenia jonów terapeutycznych w środowisku tkankowym, co może zostać osiągnięte dzięki projektowaniu materiałów o kontrolowanym profilu ich uwalniania. Efektywną drogą kontrolowania kinetyki uwalniania jonów ze struktury bioaktywnych szkieł jest sterowanie ich składem chemicznym, wielkością cząstek, czy właściwościami strukturalnymi oraz teksturalnymi poprzez zastosowanie różnych metod (topienia, żel) oraz warunków otrzymywania (szczególnie w metodzie zol-żel) [82]. Inną strategią, mającą szczególnie istotne znaczenie w inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej, jest włączenie bioaktywnych wypełniaczy do biodegradowalnych matryc polimerowych [3].
2.3. Inżynieria tkanki kostnej
Opracowanie materiałów łączących zarówno właściwości bioaktywne jak również biodegradowalność stanowiło punkt wyjścia dla rozwoju medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej. Idea inżynierii tkankowej opiera się przede wszystkim na wspomaganiu i/lub indukowaniu procesów regeneracji uszkodzonej tkanki. Zastosowany biomateriał, w postaci wysoko porowatego rusztowania, stanowi tymczasową macierz zewnątrzkomórkową zapewniającą przestrzeń do regeneracji tkanki. Biomateriały w tej strategii mogą być stosowane jako systemy bezkomórkowe lub też jako nośniki komórek i/lub substancji biologicznie aktywnych (leków/czynników wzrostu, cytokin) [5, 83]. Innym rodzajem materiałów, które stosowane są w celu wspomagania regeneracji tkanki kostnej, najczęściej w chirurgii szczękowo-twarzowej i stomatologicznej, są membrany [7, 84]. Taka
P R Z E G L Ą D L I T E R A T U R O W Y | 32
postać materiału, stosowana w tak zwanej sterowanej regeneracji kości (GBR), ma za zadanie przede wszystkim zapobiec migracji szybko proliferujących komórek tkanki miękkiej (głównie komórek epitelialnych oraz fibroblastów) w obszar ubytku kostnego, zapewniając przestrzeń do regeneracji tkanki twardej. Materiały membranowe stosowane są samodzielnie, lub wraz z wypełnieniem ubytku w postaci przeszczepu auto-/allogennego, proszku/granul ceramicznych (hydroksyapatyt, bioaktywne szkło), czy też porowatych rusztowań [7, 84]. Dla osiągnięcia założonego celu terapeutycznego, zarówno rusztowania, jak również membrany stosowane w regeneracji tkanki kostnej powinny spełniać szereg wymagań w zakresie porowatości, właściwości powierzchni, właściwości mechanicznych, biodegradacji, czy właściwości biologicznych.
Architektura rusztowania, obejmująca między innymi objętość, wielkość, kształt, a także stopień połączenia porów, jest jednym z istotniejszych parametrów decydujących o jego właściwościach osteokondukcyjnych. Determinuje ona migrację oraz proliferację komórek osteogennych oraz osteoblastów, przepływ składników odżywczych, produktów przemiany materii oraz cząsteczek sygnałowych (cytokin), a także wrastanie i formowanie się nowych naczyń krwionośnych – kluczowy etap regeneracji tkanki kostnej [85]. W przypadku membran dla sterowanej regeneracji tkanki kostnej porowatość zapewnia selektywną przepuszczalność. Z jednej strony umożliwia wczesne wrastanie naczyń krwionośnych, a także zapewnia swobodną wymianę substancji odżywczych oraz metabolitów, a z drugiej zapobiega migracji komórek tkanki miękkiej w miejsce ubytku kości [7, 84].
Liczne badania wskazują, że rusztowania dla inżynierii tkanki kostnej powinny charakteryzować się hierarchiczną architekturą, wysoką porowatością otwartą (>90%) [86, 87]. Mikroporowatość (pory wielkości <10 µm), poprzez zwiększenie rozwinięcia powierzchni materiału, sprzyja adsorpcji białek ECM oraz adhezji osteoblastów i komórek osteogennych [88, 89], a w przypadku materiałów ceramicznych oraz kompozytowych, zawierających bioaktywną fazę modyfikującą, przyczynia się do szybkiego uwalniania jonów oraz formowania się warstwy fosforanowo-wapniowej w kontakcie z środowiskiem biologicznym [5]. Z kolei makroporowatość (pory wielkości >100 µm) umożliwia z jednej strony migrację komórek, a z drugiej wrastanie naczyń krwionośnych oraz tkanki kostnej gospodarza, zapewniając dodatkowo stabilizację rusztowania w ubytku [5, 88]. Badania in vivo przeprowadzone dla materiału na bazie hydroksyapatytu w postaci rusztowań zawierających cylindryczne kanały o zróżnicowanej średnicy, wzbogaconego dodatkowo białkami morfogenetycznymi kości (BMP), wszczepionego podskórnie, wykazały, że mniejsza średnica kanałów (90-120 µm) skutkowała formowaniem się tkanki chrzęstnej, a następnie, w miarę pojawiania się unaczynienia, obserwowano ektopowy proces osteogenezy. Z kolei dla materiałów z kanałami o większej średnicy (350 µm), sprzyjających szybkiemu wrastaniu
P R Z E G L Ą D L I T E R A T U R O W Y | 33
naczyń krwionośnych, obserwowano bezpośredni wzrost tkanki kostnej [90]. Należy podkreślić, że makroporowatość negatywnie wpływa na parametry mechaniczne materiału [91]. W przypadku rusztowań degradowalnych, porowatość warunkuje również proces degradacji. Większe rozwinięcie powierzchni, a zatem większa powierzchnia kontaktu materiału ze środowiskiem tkankowym, może przyspieszyć procesy degradacji hydrolitycznej i enzymatycznej materiałów polimerowych lub rozpuszczania w przypadku materiałów ceramicznych [92].
Parametrem, który odgrywa istotną rolę w kształtowaniu odpowiedzi biologicznej jest zwilżalność powierzchni biomateriału. Badania wskazują, że powierzchnie o charakterze hydrofilowym sprzyjają adhezji, a także aktywności osteoblastów i komórek osteogennych [93, 94]. Wynika to prawdopodobnie z uprzywilejowanej adsorpcji odpowiednich białek (fibronektyny i witronektyny) do hydrofilowych powierzchni materiału, przy jednoczesnym zachowaniu konformacji zapewniającej aktywność sekwencji wiążących [95, 96].Białka te stanowią swoistą warstwę pośrednią umożliwiającą adhezję komórek do powierzchni biomateriału. Odziaływanie komórek z zaadsorbowanymi białkami macierzy zewnątrzkomórkowej zachodzi za pośrednictwem obecnych w błonie komórkowej receptorów transbłonowych (integryn), które wiążą się ze specyficznymi sekwencjami aminokwasowymi białek (np. RGD - Arg-Gly-Asp). Wiązanie integryn z sekwencjami aminokwasowymi prowadzi do powstania płytek przylegania (ang. focal adhesion), zapewniających strukturalne połączenie pomiędzy otoczeniem zewnętrznym (zaadsorbowanymi białkami macierzy zewnątrzkomórkowej), a wnętrzem komórki (filamentami aktynowymi cytoszkieletu). Płytki przylegania wraz z transbłonowymi receptorami czynników wzrostu odpowiedzialne są za aktywację szlaków sygnałowych regulujących procesy migracji, adhezji, rozpłaszczania, proliferacji i różnicowania komórek [97–100].
Kolejnymi parametrami powierzchni wpływającymi na odpowiedź biologiczną w warunkach in vitro i in vivo jest chropowatość i topografia. Analiza literatury jednoznacznie wskazuje, że powierzchnie o wyższej chropowatości, zarówno w skali mikro- jak również nanometrycznej sprzyjają adhezji komórek prekursorowych oraz osteoblastów w warunkach in vitro, a także integracji implantu z tkanką kostną warunkach in vivo [101–106]. Większe rozwinięcie powierzchni materiału, związane bezpośrednio z wyższą chropowatością, może sprzyjać adsorpcji białek biorących udział w adhezji komórek (np. fibronektyny) [101]. Chropowatość powierzchni ma wpływ także na proces różnicowania osteogennego. Liao i in. wykazali, że osteoblasty hodowane w kontakcie z mikrostrukturyzowaną powierzchnią polidimetylosiloksanu (PDMS) charakteryzowały się istotnie wyższym poziomem aktywności ALP oraz mineralizacji ECM w porównaniu do komórek w kontakcie z PDMS o gładkiej
P R Z E G L Ą D L I T E R A T U R O W Y | 34
powierzchni [102]. Analiza przeprowadzona dla osteoblastów hodowanych w kontakcie z powierzchnią tytanu, poddaną zróżnicowanej obróbce, wykazała istotny wpływ wzrostu jej chropowatości (0,6 µm < Ra < 5,2 µm) na ekspresję szeregu genów związanych z osteogenezą [107]. Badania You i in. dowiodły, że nanostrukturyzowana powierzchnia poliuretanu w połączeniu z czynnikami różnicującymi, obecnymi w pożywce hodowlanej, w znacznym stopniu przyspiesza osteogenne różnicowanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, powodując wzrost aktywności ALP oraz ekspresji osteokalcyny i osteopontyny [108]. Ponadto, badania dowodzą, że zastosowanie nanoteksturyzowanych powierzchni o zróżnicowanej geometrii, wpływających bezpośrednio na kształt komórki, daje możliwość kontroli kierunku różnicowania mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC), w tym ukierunkowania ich na proces różnicowania osteogennego (Rysunek 2) [106].
Rysunek 2. Wpływ powierzchni o zróżnicowanej nanotopografii, obejmującej nanorowki (a), matrycę
nanosłupków (b) oraz matrycę nonodołków (c), na kształt MSC. Mechanizm aktywacji szlaku sygnałowego Rho/ROCK prowadzący do różnicowania MSC w kierunku osteoblastów, adipocytów lub mioblastów/neurocytów, kontrolowany kształtem komórki (d) [106]
Innymi istotnymi parametrami materiałów stosowanych w regeneracji tkanki kostnej są właściwości mechaniczne. Idealne rusztowanie dla inżynierii tkanki kostnej powinno charakteryzować się parametrami mechanicznymi jak najbardziej zbliżonymi do właściwości mechanicznych tkanki kostnej. Z jednej strony, odpowiednia wytrzymałość mechaniczna rusztowania powinna gwarantować funkcję przenoszenia obciążeń, a odpowiednio dobrany moduł Younga nie powodować efektu przesztywnienia układu implant-kość, które może prowadzić do zahamowania procesów regeneracji lub nawet resorpcji tkanki kostnej wokół wszczepu. Odpowiednia wytrzymałość rusztowania powinna ograniczać również zmiany jego
P R Z E G L Ą D L I T E R A T U R O W Y | 35
kształtu i porowatości po umieszczeniu w organizmie, zapewniając przestrzeń do migracji komórek, a także wrastania naczyń krwionośnych i tkanki [5, 85, 109]. Z drugiej strony, liczne badania wskazują, że parametry mechaniczne rusztowania, takie jak sztywność, determinują odpowiedź komórkową, w tym morfologię, proliferację oraz proces różnicowania ludzkich meznchymalnych komórek macierzystych. Dowiedziono, że komórki hodowane na elastycznym podłożu (E ~ 1kPa) wykazywały różnicowanie w kierunku neuronów, z kolei komórki macierzyste pozostające w kontakcie ze sztywniejszym rusztowaniem (E ~ 10 kPa) różnicowały się w kierunku komórek gleju. Podłoże o najwyższej sztywności (25-40 kPa) indukowało różnicowanie osteogenne [86]. Większość obecnie badanych oraz stosowanych materiałów nie spełnia funkcji biomechanicznych, a ich stosowanie, w przypadku krytycznych ubytków kości długich, wymaga użycia dodatkowych stabilizatorów wykonanych z materiałów niedegradowalnych, najczęściej metalicznych. Wynika to przede wszystkim z podstawowego wymogu jaki muszą spełniać rusztowania dla inżynierii tkankowej – wysokiej porowatości (Rysunek 3) [3, 85]. W przypadku membran, odpowiednia wytrzymałość materiału ma przede wszystkim na celu zapewnienie poręczności chirurgicznej, a także utrzymanie przestrzeni do regeneracji tkanki kostnej [7, 84].
Rysunek 3. Moduł Younga oraz wytrzymałość na ściskanie materiałów polimerowych, ceramicznych
oraz kompozytowych znajdujących zastosowanie w regeneracji tkanki kostnej w odniesieniu do parametrów mechanicznych kości gąbczastej i korowej [85]
Biodegradowalność materiału jest kluczową właściwością pozwalającą na stopniowe zastępowanie rusztowania przez nowo formującą się tkankę, a przypadku membran pozwala na uniknięcie dodatkowego zabiegu usunięcia wszczepu. Kinetyka degradacji materiału powinna być dopasowana do tempa regeneracji tkanki kostnej i wynosić od kilku miesięcy do 2 lat, w zależności od miejsca implantacji [87]. Rusztowanie powinno zachować
