Opracowanie materiałów łączących zarówno właściwości bioaktywne jak również biodegradowalność stanowiło punkt wyjścia dla rozwoju medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej. Idea inżynierii tkankowej opiera się przede wszystkim na wspomaganiu i/lub indukowaniu procesów regeneracji uszkodzonej tkanki. Zastosowany biomateriał, w postaci wysoko porowatego rusztowania, stanowi tymczasową macierz zewnątrzkomórkową zapewniającą przestrzeń do regeneracji tkanki. Biomateriały w tej strategii mogą być stosowane jako systemy bezkomórkowe lub też jako nośniki komórek i/lub substancji biologicznie aktywnych (leków/czynników wzrostu, cytokin) [5, 83]. Innym rodzajem materiałów, które stosowane są w celu wspomagania regeneracji tkanki kostnej, najczęściej w chirurgii szczękowo-twarzowej i stomatologicznej, są membrany [7, 84]. Taka
P R Z E G L Ą D L I T E R A T U R O W Y | 32
postać materiału, stosowana w tak zwanej sterowanej regeneracji kości (GBR), ma za zadanie przede wszystkim zapobiec migracji szybko proliferujących komórek tkanki miękkiej (głównie komórek epitelialnych oraz fibroblastów) w obszar ubytku kostnego, zapewniając przestrzeń do regeneracji tkanki twardej. Materiały membranowe stosowane są samodzielnie, lub wraz z wypełnieniem ubytku w postaci przeszczepu auto-/allogennego, proszku/granul ceramicznych (hydroksyapatyt, bioaktywne szkło), czy też porowatych rusztowań [7, 84]. Dla osiągnięcia założonego celu terapeutycznego, zarówno rusztowania, jak również membrany stosowane w regeneracji tkanki kostnej powinny spełniać szereg wymagań w zakresie porowatości, właściwości powierzchni, właściwości mechanicznych, biodegradacji, czy właściwości biologicznych.
Architektura rusztowania, obejmująca między innymi objętość, wielkość, kształt, a także stopień połączenia porów, jest jednym z istotniejszych parametrów decydujących o jego właściwościach osteokondukcyjnych. Determinuje ona migrację oraz proliferację komórek osteogennych oraz osteoblastów, przepływ składników odżywczych, produktów przemiany materii oraz cząsteczek sygnałowych (cytokin), a także wrastanie i formowanie się nowych naczyń krwionośnych – kluczowy etap regeneracji tkanki kostnej [85]. W przypadku membran dla sterowanej regeneracji tkanki kostnej porowatość zapewnia selektywną przepuszczalność. Z jednej strony umożliwia wczesne wrastanie naczyń krwionośnych, a także zapewnia swobodną wymianę substancji odżywczych oraz metabolitów, a z drugiej zapobiega migracji komórek tkanki miękkiej w miejsce ubytku kości [7, 84].
Liczne badania wskazują, że rusztowania dla inżynierii tkanki kostnej powinny charakteryzować się hierarchiczną architekturą, wysoką porowatością otwartą (>90%) [86, 87]. Mikroporowatość (pory wielkości <10 µm), poprzez zwiększenie rozwinięcia powierzchni materiału, sprzyja adsorpcji białek ECM oraz adhezji osteoblastów i komórek osteogennych [88, 89], a w przypadku materiałów ceramicznych oraz kompozytowych, zawierających bioaktywną fazę modyfikującą, przyczynia się do szybkiego uwalniania jonów oraz formowania się warstwy fosforanowo-wapniowej w kontakcie z środowiskiem biologicznym [5]. Z kolei makroporowatość (pory wielkości >100 µm) umożliwia z jednej strony migrację komórek, a z drugiej wrastanie naczyń krwionośnych oraz tkanki kostnej gospodarza, zapewniając dodatkowo stabilizację rusztowania w ubytku [5, 88]. Badania in vivo przeprowadzone dla materiału na bazie hydroksyapatytu w postaci rusztowań zawierających cylindryczne kanały o zróżnicowanej średnicy, wzbogaconego dodatkowo białkami morfogenetycznymi kości (BMP), wszczepionego podskórnie, wykazały, że mniejsza średnica kanałów (90-120 µm) skutkowała formowaniem się tkanki chrzęstnej, a następnie, w miarę pojawiania się unaczynienia, obserwowano ektopowy proces osteogenezy. Z kolei dla materiałów z kanałami o większej średnicy (350 µm), sprzyjających szybkiemu wrastaniu
P R Z E G L Ą D L I T E R A T U R O W Y | 33
naczyń krwionośnych, obserwowano bezpośredni wzrost tkanki kostnej [90]. Należy podkreślić, że makroporowatość negatywnie wpływa na parametry mechaniczne materiału [91]. W przypadku rusztowań degradowalnych, porowatość warunkuje również proces degradacji. Większe rozwinięcie powierzchni, a zatem większa powierzchnia kontaktu materiału ze środowiskiem tkankowym, może przyspieszyć procesy degradacji hydrolitycznej i enzymatycznej materiałów polimerowych lub rozpuszczania w przypadku materiałów ceramicznych [92].
Parametrem, który odgrywa istotną rolę w kształtowaniu odpowiedzi biologicznej jest zwilżalność powierzchni biomateriału. Badania wskazują, że powierzchnie o charakterze hydrofilowym sprzyjają adhezji, a także aktywności osteoblastów i komórek osteogennych [93, 94]. Wynika to prawdopodobnie z uprzywilejowanej adsorpcji odpowiednich białek (fibronektyny i witronektyny) do hydrofilowych powierzchni materiału, przy jednoczesnym zachowaniu konformacji zapewniającej aktywność sekwencji wiążących [95, 96].Białka te stanowią swoistą warstwę pośrednią umożliwiającą adhezję komórek do powierzchni biomateriału. Odziaływanie komórek z zaadsorbowanymi białkami macierzy zewnątrzkomórkowej zachodzi za pośrednictwem obecnych w błonie komórkowej receptorów transbłonowych (integryn), które wiążą się ze specyficznymi sekwencjami aminokwasowymi białek (np. RGD - Arg-Gly-Asp). Wiązanie integryn z sekwencjami aminokwasowymi prowadzi do powstania płytek przylegania (ang. focal adhesion), zapewniających strukturalne połączenie pomiędzy otoczeniem zewnętrznym (zaadsorbowanymi białkami macierzy zewnątrzkomórkowej), a wnętrzem komórki (filamentami aktynowymi cytoszkieletu). Płytki przylegania wraz z transbłonowymi receptorami czynników wzrostu odpowiedzialne są za aktywację szlaków sygnałowych regulujących procesy migracji, adhezji, rozpłaszczania, proliferacji i różnicowania komórek [97–100].
Kolejnymi parametrami powierzchni wpływającymi na odpowiedź biologiczną w warunkach in vitro i in vivo jest chropowatość i topografia. Analiza literatury jednoznacznie wskazuje, że powierzchnie o wyższej chropowatości, zarówno w skali mikro- jak również nanometrycznej sprzyjają adhezji komórek prekursorowych oraz osteoblastów w warunkach in vitro, a także integracji implantu z tkanką kostną warunkach in vivo [101–106]. Większe rozwinięcie powierzchni materiału, związane bezpośrednio z wyższą chropowatością, może sprzyjać adsorpcji białek biorących udział w adhezji komórek (np. fibronektyny) [101]. Chropowatość powierzchni ma wpływ także na proces różnicowania osteogennego. Liao i in. wykazali, że osteoblasty hodowane w kontakcie z mikrostrukturyzowaną powierzchnią polidimetylosiloksanu (PDMS) charakteryzowały się istotnie wyższym poziomem aktywności ALP oraz mineralizacji ECM w porównaniu do komórek w kontakcie z PDMS o gładkiej
P R Z E G L Ą D L I T E R A T U R O W Y | 34
powierzchni [102]. Analiza przeprowadzona dla osteoblastów hodowanych w kontakcie z powierzchnią tytanu, poddaną zróżnicowanej obróbce, wykazała istotny wpływ wzrostu jej chropowatości (0,6 µm < Ra < 5,2 µm) na ekspresję szeregu genów związanych z osteogenezą [107]. Badania You i in. dowiodły, że nanostrukturyzowana powierzchnia poliuretanu w połączeniu z czynnikami różnicującymi, obecnymi w pożywce hodowlanej, w znacznym stopniu przyspiesza osteogenne różnicowanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, powodując wzrost aktywności ALP oraz ekspresji osteokalcyny i osteopontyny [108]. Ponadto, badania dowodzą, że zastosowanie nanoteksturyzowanych powierzchni o zróżnicowanej geometrii, wpływających bezpośrednio na kształt komórki, daje możliwość kontroli kierunku różnicowania mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC), w tym ukierunkowania ich na proces różnicowania osteogennego (Rysunek 2) [106].
Rysunek 2. Wpływ powierzchni o zróżnicowanej nanotopografii, obejmującej nanorowki (a), matrycę
nanosłupków (b) oraz matrycę nonodołków (c), na kształt MSC. Mechanizm aktywacji szlaku sygnałowego Rho/ROCK prowadzący do różnicowania MSC w kierunku osteoblastów, adipocytów lub mioblastów/neurocytów, kontrolowany kształtem komórki (d) [106]
Innymi istotnymi parametrami materiałów stosowanych w regeneracji tkanki kostnej są właściwości mechaniczne. Idealne rusztowanie dla inżynierii tkanki kostnej powinno charakteryzować się parametrami mechanicznymi jak najbardziej zbliżonymi do właściwości mechanicznych tkanki kostnej. Z jednej strony, odpowiednia wytrzymałość mechaniczna rusztowania powinna gwarantować funkcję przenoszenia obciążeń, a odpowiednio dobrany moduł Younga nie powodować efektu przesztywnienia układu implant-kość, które może prowadzić do zahamowania procesów regeneracji lub nawet resorpcji tkanki kostnej wokół wszczepu. Odpowiednia wytrzymałość rusztowania powinna ograniczać również zmiany jego
P R Z E G L Ą D L I T E R A T U R O W Y | 35
kształtu i porowatości po umieszczeniu w organizmie, zapewniając przestrzeń do migracji komórek, a także wrastania naczyń krwionośnych i tkanki [5, 85, 109]. Z drugiej strony, liczne badania wskazują, że parametry mechaniczne rusztowania, takie jak sztywność, determinują odpowiedź komórkową, w tym morfologię, proliferację oraz proces różnicowania ludzkich meznchymalnych komórek macierzystych. Dowiedziono, że komórki hodowane na elastycznym podłożu (E ~ 1kPa) wykazywały różnicowanie w kierunku neuronów, z kolei komórki macierzyste pozostające w kontakcie ze sztywniejszym rusztowaniem (E ~ 10 kPa) różnicowały się w kierunku komórek gleju. Podłoże o najwyższej sztywności (25-40 kPa) indukowało różnicowanie osteogenne [86]. Większość obecnie badanych oraz stosowanych materiałów nie spełnia funkcji biomechanicznych, a ich stosowanie, w przypadku krytycznych ubytków kości długich, wymaga użycia dodatkowych stabilizatorów wykonanych z materiałów niedegradowalnych, najczęściej metalicznych. Wynika to przede wszystkim z podstawowego wymogu jaki muszą spełniać rusztowania dla inżynierii tkankowej – wysokiej porowatości (Rysunek 3) [3, 85]. W przypadku membran, odpowiednia wytrzymałość materiału ma przede wszystkim na celu zapewnienie poręczności chirurgicznej, a także utrzymanie przestrzeni do regeneracji tkanki kostnej [7, 84].
Rysunek 3. Moduł Younga oraz wytrzymałość na ściskanie materiałów polimerowych, ceramicznych
oraz kompozytowych znajdujących zastosowanie w regeneracji tkanki kostnej w odniesieniu do parametrów mechanicznych kości gąbczastej i korowej [85]
Biodegradowalność materiału jest kluczową właściwością pozwalającą na stopniowe zastępowanie rusztowania przez nowo formującą się tkankę, a przypadku membran pozwala na uniknięcie dodatkowego zabiegu usunięcia wszczepu. Kinetyka degradacji materiału powinna być dopasowana do tempa regeneracji tkanki kostnej i wynosić od kilku miesięcy do 2 lat, w zależności od miejsca implantacji [87]. Rusztowanie powinno zachować
P R Z E G L Ą D L I T E R A T U R O W Y | 36
wyjściową mikrostrukturę oraz właściwości mechaniczne przez co najmniej 6 miesięcy umożliwiając zasiedlenie przez komórki, transport substancji odżywczych, a także wrastanie tkanki i naczyń krwionośnych [5]. Następnie stopniowa degradacja powinna umożliwić wzrost tkanki kostnej, a także jej przebudowę. W zależności od rodzaju tkanki przebudowa trwa od 3-6 miesięcy dla kości gąbczastej do 6-12 miesięcy dla kości korowej [91]. Obok kontrolowanego czasu resorpcji materiału, istotna jest również biozgodność produktów jego degradacji. Szybka degradacja poliestrów alifatycznych, takich jak PGA i PDLLA, czy też ceramiki CaP o stosunku molowym Ca/P<1 i szkieł fosforanowych z wysoką zawartością P2O5, może prowadzić do zakwaszenia środowiska tkankowego, a w konsekwencji powodować przewlekły stan zapalny hamujący proces regeneracji tkanki [39, 60–63].
Biomateriały dedykowane dla medycyny regeneracyjnej tkanki kostnej, w postaci zarówno rusztowań jak również membran, powinny obok kontrolowanej biodegradacji wykazywać właściwości osteoindukcyjne. Jak pokazano na rysunku 4 za proces indukowania osteogenezy przez biomateriał odpowiedzialnych jest szereg czynników, do których należą właściwości fizykochemiczne materiału opisane wcześniej i obejmujące jego mikrostrukturę, parametry powierzchni, jak również skład chemiczny. Właściwości te w sposób bezpośredni lub pośredni warunkują proces różnicowania komórek prekursorowych w kierunku osteoblastów, a tym samym regenerację tkanki kostnej [110]. Dużym wyzwaniem jest projektowanie i wytwarzanie biomateriałów, które obok szeregu pożądanych właściwości fizykochemicznych, mechanicznych oraz biologicznych, wykazywałyby takie cechy jak poręczność chirurgiczna, możliwość łatwego dostosowania kształtu i wymiarów materiału w warunkach sali operacyjnej, czy łatwość i skuteczność sterylizacji [111].
Materiałami, które wydają się sprostać złożonym wymaganiom medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkanki kostnej są kompozyty organiczno-nieorganiczne. Pionierem w zakresie stosowania tego typu materiałów kompozytowych w medycynie był W. Bonfield. Na początku lat 80’ XX wieku wytworzył on stabilny kompozyt, którego matrycę stanowił polietylen wysokiej gęstości modyfikowany cząstkami hydroksyapatytu. Materiał ten łączył bioaktywność HAp, z wytrzymałością oraz możliwością formowania w warunkach sali operacyjnej HDPE. Obecnie kompozyt na bazie HDPE zawierający 40 %obj. HAp, pod nazwą handlową HAPEXTM, stosowany jest do produkcji implantów ucha środkowego [112, 113]. W 2003 roku, A.R. Boccaccini i V. Maquet po raz pierwszy wytworzyli kompozytowe rusztowania na bazie PLGA modyfikowanego cząstkami szkła Bioglass® 45S5 [2, 114]. Kompozyty tego typu łączą biodegradowalność osnowy polimerowej z bioaktywnością ceramicznej fazy modyfikującej, dając przy tym możliwość sterowania szeregiem właściwości istotnych z punktu widzenia ich zastosowania w inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej. Zagadnienia dotyczące możliwości otrzymywania oraz właściwości
P R Z E G L Ą D L I T E R A T U R O W Y | 37
biodegradowalnych materiałów kompozytowych modyfikowanych fazą ceramiczną w postaci krzemionki, wollastonitu, bioaktywnych szkieł oraz ceramiki fosforanowo-wapniowej zostały szeroko omówione w publikacji D1.
Rysunek 4. Schemat przedstawiający materiałowe uwarunkowania właściwości osteoindukcyjnych
biomateriałów [110]
Przestrzenne rusztowania oraz membrany, oprócz podstawowej funkcji, mogą również pełnić rolę systemów kontrolowanego dostarczania substancji biologicznie aktywnych [115– 117]. Zastosowane substancje z jednej strony mają na celu polepszenie biofunkcyjności biomateriału, na przykład poprzez ograniczenie kolonizacji jego porowatej powierzchni przez bakterie (antybiotyki - gentamycyna, wankomycyna, tetracyklina, gatifloksacyna), modulowanie stanu zapalnego (środki przeciwzapalne – deksametazon, ibuprofen), czy też przyspieszenie procesu regeneracji (czynniki wzrostu, cytokiny – BMP-2, TGF-β, FGF, VEGF). Z drugiej zaś strony, uwalniana substancja może wywołać efekt terapeutyczny, na przykład działanie przeciwnowotworowe (chemioterapeutyki - doksorubicyna, metotreksat, cisplatyna) [115, 118, 119]. Pomimo znacznej poprawy biodostępności substancji aktywnych oraz wyeliminowania skutków ubocznych wynikających z tradycyjnej drogi podania, nadal istnieją pewne ograniczenia dotyczące ich stosowania w lokalnych systemach dostarczania. Należą do nich między innymi: narastająca antybiotykooporność bakterii, toksyczność antybiotyków w kontakcie z komórkami, wysoka toksyczność chemioterapeutyków wobec komórek normalnych, czy lekooporność komórek nowotworowych. Jednocześnie, dużym
P R Z E G L Ą D L I T E R A T U R O W Y | 38
ograniczeniem stosowania biomolekuł jest ich niestabilność i wrażliwość na wiele czynników (np. pH, temperaturę, enzymy), zdolność do wywoływania niepożądanej odpowiedzi immunologicznej i wreszcie wysokie koszty stosowania [120–125]. Grupą związków, które wydają się być idealnymi kandydatami do zastosowań w inżynierii tkankowej są polifenole. Związki te wykazują szeroki zakres aktywności biologicznej, obejmujący działanie przeciwzapalne, antybakteryjne, przeciwutleniające (w tym zdolność zmiatania wolnych rodników oraz chelatowania jonów metali), a także zdolność indukowania apoptozy komórek nowotworowych, przy jednoczesnym braku skutków ubocznych [126]. Ponadto, badania in vitro wskazują, że polifenole wpływają korzystnie na metabolizm tkanki kostnej, indukując z jednej strony osteoblastogenezę, a z drugiej hamując różnicowanie i aktywność osteoklastów [127–130].
C E L I Z A K R E S P R A C Y | 40