Charakterystyka enzymów amylolitycznych

Amylazy są enzymami produkowanymi zarówno przez rośliny, zwierzęta i jak i grzyby. U kręgowców pełnia one funkcje typowych enzymów trawiennych i są obecne m. in. w ślinie i wydzielinie trzustkowej. W świecie roślinny, występują one zwłaszcza w ziarnach kiełkujących zbóż, gdzie następuje ich synteza mająca za zadanie uruchomienie zgromadzonego w formie skrobi materiału energetycznego. Podstawowe kryteria podziału enzymów amylolitycznych spotykane w literaturze przedstawiono w Tab. 2.2.

Tab. 2.2. Wybrane kryteria podziału enzymów amylolitycznych [5, 8, 10, 11, 12].

Kryterium podziału enzymów amylolitycznych: Typy enzymów amylolitycznych:

 ze względu na typ hydrolizowanego wiązania glikozydowego

 hydrolizujące wiązania -1,4-glikozydowe:

 -amylazy,

 -amylazy,

 endo--amylazy.

 hydrolizujące wiązania -1,6-glikozydowe:

 enzymy znoszące rozgałęzienia (izoamylazy, pullulanazy)  hydrolizujące wiązania -1,4- i -1,6-glikozydowe:

 glukoamylazy,

 pullulenazy.  ze względu na miejsce hydrolizowanego

wiązania glikozydowego w cząsteczce skrobi (cięcie „z brzegu” lub „wewnątrz łańcucha”)

 endoamylazy:  -amylazy,  pullulenazy,  cyklodekstrynazy.  egzoamylazy:  -amylazy,  glukoamylazy,  egzo--amylazy.

 ze względu na zachodzące procesy  amylazy upłynniające:

 -amylazy,  izoamylazy,  pullulenazy,  cyklodekstrynazy.  amylazy scukrzające:  -amylazy,  glukoamylazy,  egzo--amylazy.

 ze względu na pochodzenie  roślinne,

 bakteryjne,

 zwierzęce,  grzybowe.  ze względu na formę anomeryczną produktów  amylazy uwalniające produkty w formie anomerycznej

(np. -amylazy, cyklodekstynazy),

 amylazy uwalniające produkty w formie nieanomerycznej (-amylazy i glukoamylazy).

 ze względu na budowę przestrzenną oraz centów aktywnych amylaz

 struktura walca (/)8 ,  struktura (/)5 {-amylazy} ,  struktura walca (/) {glukoamylazy}.  ze względu na właściwości fizykochemiczne  termostabilne*

,

 „kwaśne”, „zasadowe” (optimum pH),

 metalozależne (wymagające obecności jonów metali, np. Mg2+, Co2+, Mn2+ lub wrażliwe na obecność jonów Ca2+).

 ze względu na czynnik wywołujący inhibicje enzymu

 inhibowane substratem,

 inhibowane produktem (produktami) reakcji,

 inhibowane (ulegające inaktywacji) pod wpływem innego czynnika.  ze względu na mechanizm inhibicji  enzymy ulegające inhibicji kompetycyjnej, niekompetycyjnej,

akompetycyjnej, itp.

 ze względu na proces technologiczny  enzymy upłynniające (endoamylazy; głównie -amylazy),

 enzymy scukrzające (egzoamylazy, głównie -amylazy i glukoamylazy).

* Oprócz poszukiwań enzymów produkowanych przez tzw. termofile i hipertermofile [13], możliwych do zastosowania w podwyższonych temperaturach, obecnie wzrasta zainteresowanie przemysłu także amylazami produkowanymi przez organizmy „zimnolubne” [14], których zastosowanie pozwala zredukować koszty związane z podgrzewaniem mieszaniny reakcyjnej oraz dodatkowo gwarantuje stabilność produktów hydrolizy.

Enzymy amylolityczne, zgodnie z klasyfikacją stworzoną w 1961 roku przez Komisję Enzymową Międzynarodowej Unii Biochemicznej, zaliczane są do klasy hydrolaz, podklasy hydrolaz atakujących wiązania glikozydowe (EC 3.2.). Klasyfikacja na podpodklasy oparta jest na położeniu hydrolizowanego wiązania glikozydowego w cząsteczce substratu. W dalszej części rozdziału przedstawiono schemat działania enzymów amylolitycznych oraz wybranych enzymów związanych z procesem hydrolizy skrobi [5, 11, 12].

-amylazy (EC 3.2.1.1) - hydrolizują wiązania -1,4-glikozydowe ulokowane wewnątrz cząsteczki skrobi. Większość -amylaz nie hydrolizuje wiązań -1,4-glikozydowych ulokowanych w bezpośrednim sąsiedztwie miejsc rozgałęzienia w cząsteczkach amylopektyny. Schemat działania -amylazy na cząsteczkę amylopektyny przedstawiono na rys. 2.3.

Przykładowe produkty reakcji:

5x

3x

Rys. 2.3. Schemat ataku -amylazy na cząsteczkę amylopektyny. Podjednostki glukozy w cząsteczkach skrobi zaznaczono sześciokątami, miejsca ataku enzymu na wiązania glikozydowe zaznaczono strzałkami, czerwonym kolorem oznaczono koniec redukujący w łańcuchu.

egzo--amylazy - katalizują reakcję uwalniania od końców nieredukujących skrobi liniowych oligosacharów. W zależności od typu enzymu zawierają one od trzech do sześciu reszt glukozowych. E₃ E₄ E₅ E₆ E₇ E₃ E₄ E₅ E₇ E₆

Rys. 2.4. Schemat ataku egzo--amylaz na cząsteczkę amylozy, zaznaczono miejsca ataku poszczególnych typów egzo--amylaz (oznaczenia zgodne z poprzednim rysunkiem).

pullulanazy (EC 3.2.1.41) - hydrolizują wiązania -1,6-glikozydowe w cząsteczce skrobi. Wyróżniane są także amylopullulanazy i neopullulanazy hydrolizujące zarówno wiązania

-1,6-glikozydowe, jak i wiązania -1,4-glikozydowe. Produktami reakcji hydrolizy skrobi przy udziale amylopullulanaz i neopullanaz jest mieszanina krótkich oligochacharydów pozbawiona praktycznie dekstryn granicznych zawierających wiązania -1,6-glikozydowe.

-amylazy (EC 3.2.1.2) - katalizują hydrolizę wiązań -1,4-glikozydowych między druga, a trzecią podjednostką glukozy licząc od końca nieredukujacego w cząsteczce skrobi. W zależności od wielkości od budowy centrum aktywnego enzymu, reakcja hydrolizy skrobi, zostaje zatrzymana w odległości od 2 do 5 podjednostek glukozy od miejsca położenia wiązania -1,6-glikozydowego. Przyjmuje się, że niektóre -amylazy ulegają inhibicji kompetycyjnej maltoza uwalniana w wyniku reakcji. Na rys. 2.5. przedstawiono schematy ataku -amylazy na cząsteczkę amylopektyny oraz różnych mechanizmów reakcji.

Produkty hydrolizy. 14x Produkty: Produkty: 5x Produkty: 8x

Rys. 2.5. Schemat ataku -amylazy (oznaczenia jak na poprzednim rysunku). a) atak -amylazy na cząsteczkę amylopektyny,

Możliwe mechanizmy działania -amylazy:

b) atak losowy (ang. random attack) - adsorpcja, pojedyncze cięcie wiązania glikozydowego, desorpcja z uwolnieniem jednej cząsteczki maltozy,

c) wielokrotny atak łańcuchowy (ang. multiple chain attack) - adsorpcja, seria cięć prowadząca do sekwencyjnego uwalniania cząsteczek maltozy, desorpcja,

d) d) pojedynczy atak łańcuchowy (ang. single chain attack) - adsorpcja, hydroliza do końca łańcucha co drugiego wiązania -1,4-glikozydowego u uwalnianiem cząsteczek maltozy, desorpcja.

a)

b)

c)

glukoamylazy (-amylazy) (EC 3.2.1.3) - uwalniają cząsteczki glukozy, hydrolizując wiązania -1,4-glikozydowe od końca nieredujacego łańcucha poliglukozowego. Większość glukoamylaz posiada zdolność hydrolizy także wiązań -1,6-glikozydowych znajdujących się przy nieredukującej reszcie glukozowej w łańcuchu.

Produkty reakcji:

49x

Rys. 2.6. Schemat ataku glukoamylazy na cząsteczkę amylopektyny (oznaczenia zgodne z poprzednimi rysunkami).

izoamylazy (EC 3.2.1.68) - hydrolizują wiązania -1,6-glikozydowe wewnątrz cząsteczki skrobi, powodując uwolnienie liniowych polisacharydów. Potocznie izoamylazy nazywane są enzymami znoszącymi rozgałęzienia.

Produkty reakcji:

2x

Rys. 2.7. Schemat ataku izoamylaz na cząsteczkę amylopektyny (oznaczenia zgodne z poprzednimi rysunkami).

Oprócz hydrolaz w procesach związanych konwersją skrobi i glukozy stosowane są także inne enzymy, takie jak:

cyklotransferazy (EC 2.4.1.19) - należą do klasy transferaz, i podobnie jak egzo--amylazy katalizują reakcję uwalniania oligosacharydów od końców nieredukujący skrobi. W przeciwieństwie jednak do egzo--amylazy uwalniane produkty nie są w formie liniowej, lecz mają formę zamkniętych pierścieni cyklodekstrynowych (rys. 2.8.).

alfa-glikozylotransferaza beta-glikozylotransferaza gamma-glikozylotransferaza

gamma

beta ^alfa

gamma-cyklodekstryna beta-cyklodekstryna alfa-cyklodekstryna

Rys. 2.8. Schemat ataku cyklotransferaz na cząsteczkę amylozy, zaznaczono miejsca ataku poszczególnych typów cyklotransferaz (oznaczenia zgodne z poprzednimi rysunkami).

izomerazy ksylozowe (izomeraza glukozowa) (EC 5.3.1.5) - wykorzystywana przemysłowo głównie w procesie izomeryzacji D-glukozy do D-fruktozy (rys. 2.9.).

O CH₂OH H H OH H H OH ^{OH H} OH OH H OH CH₂OH H CH₂OH O H OH

Rys. 2.9. Schemat działania izomerazy ksylozowej, na przykładzie izomeryzacji glukozy do fruktozy.

glikozylotransferaza rozgałęzień -glukanu (amylo-1,41,6-glukozylotransferaza), katalizuje reakcje przeniesienia fragmentu liniowego łańcucha poliglukozowego z utworzeniem wiązania -1,6-glikozydowego, zgodnie ze schematem przedstawionym na rys. 2.10.

Rys. 2.10. Schemat działania glikozylotransferazy rozgałęzień -glukanu na cząsteczkę amylozy. Kolorem zielonym zaznaczono przenoszony fragment poliglukozowy, pozostałe oznaczenia zgodne z poprzednimi rysunkami.

Należy tutaj zaznaczyć, że nawet enzymy otrzymywane z różnych mutacji danego szczepu bakterii mogą się różnić powinowactwem do substratu, wydajnością procesu konwersji skrobi, a także wrażliwością na temperaturę. [15]

Enzymy, w tym także enzymy amylolityczne mogą także prowadzić reakcje odwrotne (ang. reverse reaction). Uwidacznia się to szczególnie w końcowym etapie reakcji, gdy występuje niedobór substratu, przy jednocześnie wysokim stężeniu produktu [11, 12]. Przykładowo glukoamylaza może katalizować reakcję „łączenia” się cząsteczek glukozy z utworzeniem m.in.: ,-trehalozy (-D-glukopyranozylo--d-glukopyranozy), kojibiozy (2-0--D-glukopyranozylo-D-glukozy), nigerozy (3-0--D-glukopyranozylo-D-glukozy), maltozy (4--D-glukopyranozylo-D-glukozy), izomaltozy (6-0--D-glukopyranozylo-D -glukozy), maltotriozy (4-0--D-glukopyranozylo-maltozy), panozy (6-0--D

-glukopyranozylo-D-maltozy), izopanozy (4-0--D-glukopyranozylo-izomaltozy) oraz izomaltotriozy (6-0--D -glukopyranozylo-D-izomaltozy) [16].

łańcuch główny łańcuch podrzędny

2.2.4 Technologia

Schemat typowego procesu technologicznego pozyskiwania skrobi kukurydzianej i jej obróbki przedstawiono na rys. 2.11.

zbiór kukurydzy segregacja kolb komory przezna-czone do wstępnego namaczania kolb kukurydzianych przemiał kolb kukurydzy wstępna separacja odwodnienie oczyszczanie skrobi

zbiorniki reakcyjne produkcja skrobi

separacja sitowa

suszenie

Umyta, obrana kukurydza przenoszona jest taśmociągiem do zbiorników z łagodnym, kwaśnym roztworem. Rozmiękczona kukurydza jest mielona w celu odrzucenia kaczanów, następnie zmielony i wyselekcjonowany materiał przenoszony jest do łuskarki. Uzyskana zawiesina zawierająca gluten i skrobię rozdzielana jest w wirówkach. Zawiesina skrobi przenoszona jest do reaktorów, gdzie poddaje się ją chemicznej i fizycznej modyfikacji. Uzyskany produkt oczyszczany jest w wirówkach myjących, poddawany dekantacji w wirówkach koszykowych i suszony w wirówkach kołowych. Sucha skrobia jest proszkowana i poddawana kontroli jakości, a następnie pneumatycznie przenoszona jest do zbiorników. Końcowy produkt jest pakowany w torby lub jest przewożony cysternami. suszenie produktów odpadowych przechowywanie glutenu przechowywanie

/ melanżowanie ^{pakowanie załadunek spedycja}

Rys. 2.11. Schemat procesu technologicznego produkcji z kukurydzy skrobi modyfikowanej (wg National Starch and Chemical Company [7]).