START Amylopektyna (§ 1) lgap 15000 100000 wap = lgap-1 wegap (patrz§ 6) n = 0
Losowe określenie cząsteczki i miejsca w cząsteczce, które atakuje
egzo--D-glukanaza. (§ 4)
Czy enzym jest wstanie "rozciąć" wiązanie w atakowanej cząsteczce? (§ 5) Zderzenie aktywne: (§ 7) [lgap]n=[lgap]n+1+[lgam]n+1 (patrz § 7.1.) wap = wap - 1 wegap (patrz § 7.2.) n = n + 1 Zderzenie nieaktywne: (§ 8) n = n +1 TAK NIE KONIEC SYMULACJI wegap = 0 (§ 9) wegam > 0
2.4 Zestawienie danych doświadczalnych z modelem
Możliwość przejścia z układu modelowego do układu rzeczywistego jest niezwykle ważne. Umożliwia ono nie tylko weryfikację opracowanego modelu i jego założeń, ale także jego późniejsze wykorzystanie do celów praktycznych.
2.4.1 Opis układu rzeczywistego
Kinetykę reakcji chemicznej opisujemy zwykle podając zależność zmiany stężeń poszczególnych substancji w czasie. Zależność tą możemy określić poprzez podanie konkretnych wartości stężeń danej substancji w czasie lub poprzez podanie funkcji opisującej zmiany ilości poszczególnych substancji w układzie. Obrazowo możemy to przedstawić w ten sposób, iż w jednostkowej objętości określamy w sposób ciągły lub w określonych odstępach czasu stężenia określonych substancji. Standardowo za objętość jednostkową przyjmujemy objętość jednego dm3
lub m3. Stężenia substancji możemy określić na przykład poprzez wyrażenie masy lub liczności danej substancji w jednostkowej objętości. Za jednostkę czasu przyjmuje się wielkość krotną sekundy, która odpowiada szybkości reakcji*
.
W dalszej części pracy zaprezentowano równorzędne metody translacji układu modelowego do układu rzeczywistego opisanego poprzez podanie zmian stężeń molowych [mol/m3] w czasie [s]. Generalnie, aby dokonać opisanej translacji konieczne jest wykonanie modelowej symulacji dla pojedynczej reakcji enzymatycznej, dla której dysponujemy danymi doświadczalnymi opisującymi jej kinetykę. Po wykonaniu translacji, wyznaczana jest skala przekształcenia, co umożliwia bezpośrednie przeliczenie wielkości uzyskiwanych w modelu na wielkości fizyczne, takie jak stężenie molowe i czas reakcji.
* Teoretycznie zaprezentowany w pracy model może opisywać dowolnie duży układ. Jednakże w typowym układzie fizycznym mamy zwykle do czynienia z 1018 do 1027 cząsteczek w objętości jednego dm3. Dlatego, ze względów praktycznych zredukowano ilość rozpatrywanych w pracy cząsteczek do objętości reprezentatywnej dla całego układu (od 1 do 106).
2.4.2 Wyznaczenie stałej przeskalowania w oparciu o liczbę obrotów
Przejście z układu modelowego do rzeczywistego odbywa się w dwóch niezależnych etapach: przeliczeniu ilości cząsteczek rozpatrywanych w modelowym układzie na stężenia molowe [mol/dm3] oraz kroku symulacji (liczby iteracji) na jednostki czasu [s].
Przyjmijmy, że w pewnej objętości jednostkowej znajduje się określona liczba cząsteczek substratu i enzymu. Stężenie początkowe w układzie modelowym (wyrażane poprzez funkcję charakterystyczną) odpowiada stężenie początkowemu w układzie rzeczywistym wyrażonemu stężeniem molowym (ct=0 [mol/dm3]). Stężenie końcowe w układzie modelowym, odpowiada ilości powstałych cząsteczek w układzie, w którym wszystkie cząsteczki substratów i produktów pośrednich zostały przekształcone na produkty końcowe. W praktyce za stężenie końcowe produktów, przyjmujemy takie stężenie, które jest osiągane po pewnym czasie (tk) i które nie ulega późniejszym zmianą (przy zachowanych warunkach reakcji). Znając relację między stężeniami początkowymi i końcowymi, z wynikami symulacji komputerowej, możemy wyznaczyć stałą przekształcenia, wiążącą stężenia cukrów wyznaczanych w reakcji z DNS z funkcją charakterystyczną zdefiniowana w modelu. W Tabeli 1 poniżej zestawiono przykładowe wielkości wyznaczane przy badaniu kinetyki reakcji enzymatycznej degradacji skrobi z symulacją komputerową.
Tabela 1. Przykładowe zestawienie wielkości wyznaczanych przy badaniu kinetyki reakcji enzymatycznej degradacji skrobi z symulacją komputerową.
REAKCJA CHEMICZNA MODEL (SYMULACJA KOMPUTEROWA)
WIELKOŚĆ OPIS WIELKOŚĆ OPIS
cS,0 [mol/dm3] Stężenie substratu w chwili t=0, równe ilości końców redukujących oznaczonych w reakcji z DNS.
Liczba cząsteczek [-] dla iteracji n=0.
Liczba cząsteczek określona przez funkcję charakterystyczną (“liczba zer”) dla iteracji n=0 (początek reakcji). cS+p,k [mol/dm3] Stężenie końcowe cukrów w chwili t=tk,
równe ilości końców redukujących oznaczonych w reakcji z DNS.
Liczba cząsteczek [-] dla iteracji n=nk.
Liczba cząsteczek określona przez funkcję charakterystyczną (“liczba zer”) dla iteracji n=nk (koniec reakcji) cS,k [mol/dm3] Stężenie końcowe produktów. Ponieważ
w reakcji z DNS nie rozróżnialne są cząsteczki substratów, produktów pośrednich i końcowych, równe jest ono różnicy oznaczonemu stężeniu mieszaniny w chwili t minus stężenie początkowe:
cP,k = cS+P,k - cS,0
Różnica liczby cząsteczek [-] dla iteracji n=nk minus liczba cząsteczek [-] dla iteracji n=0.
Liczba cząsteczek powstałych podczas symulacji.
cgl [mol/dm3] Stężenie glukozy w układzie przy całkowitej hydrolizie policukrów do wolnej glukozy (np. pod wpływem gorącego kwasu solnego).
lgcałk Całkowita liczba podjednostek glukozy
w rozpatrywanym układzie, równa ilości parametrów funkcji charakterystycznej.
Kolejnym etapem jest wyznaczenie skali czasowej. Załóżmy, że dobraliśmy tak objętość jednostkową, aby znajdowała się w niej jedna cząsteczka enzymu. Śledząc jej zachowanie, możemy stwierdzić, iż w układzie modelowym, mamy do czynienia jedynie z dwoma rodzajami zdarzeń: zderzeniem aktywnym i zderzeniem nieaktywnym. W najprostszym przypadku czasy zderzenia aktywnego i nieaktywnego są sobie równe ( tak = tnak ). Możemy wtedy przyjąć, że każdej rozpatrywanej iteracji odpowiada jednakowy przedział czasu, a czas reakcji równy jest sumie tych przedziałów, co można zapisać:
n
k nak n n nak ak k n n n ak Rt n t t n t
t
k k
0 0 .W większości przypadków jednak czas zderzenia aktywnego, jest różny od czasu zderzenia nieaktywnego. W tym przypadku, można zmodyfikować opracowany model, poprzez wprowadzenie dodatkowych założeń:
1. W celu opisania czasu reakcji, zostaje wprowadzona dodatkowa zmienna: tR, oznaczająca czas reakcji.
2. W chwili rozpoczęcia symulacji dla n=0, tR = 0 (o ile nie założono inaczej).
3. W przypadku zderzenia aktywnego, wartość tR zwiększana jest o stałą czasową odpowiadającą czasowi zderzenia aktywnego: tR = tR + tak.
4. W przypadku zderzenia nieaktywnego, wartość tR zwiększana jest o stałą czasową odpowiadającą czasowi zderzenia nieaktywnego: tR = tR + tnak.
5. Czasowi reakcji odpowiada wartość zmiennej tR dla najmniejszej iteracji, dla której ilość wiązań mogących ulec zerwaniu w wyniku działania danego enzymu wynosi zero.
W praktyce stałe tak i tnak. mogą być wyznaczone metodami stosowanymi w biochemii (np. metodą stop flow). W przypadku, kiedy większość zderzeń jest aktywnych, można przyjąć, że stała tak jest odwrotnością liczby obrotów enzymu (ang. turnover number), zdefiniowanej jako “ilość moli substratu transformowanego na minutę przez jeden mol aktywnych cząsteczek enzymów lub centrów katalitycznych w przypadku enzymów zawierających wiele podjednostek katalitycznych w optymalnych warunkach” *
[18].
* Liczbę obrotów enzymu określa się także, jako ilość moli substancji transformowanych na minutę przez jeden mol enzymu (lub jeden mol enzymu) w optymalnych warunkach [18].
Zależność liczby obrotów od prędkości maksymalnej i całkowitego stężenia enzymu wyraża zależność: ] [min 1 . , max 11 1 ml mmol(E) ml min P) mmol(S tot E p c V k
gdzie kP jest liczbą obrotów enzymu; Vmax prędkością maksymalną; cE,tot. całkowitym stężeniem enzymu. Zwykle liczba obrotów enzymu zawiera się w przedziale od 50 do 107 min-1. Przykładowo, dla anhydrazy węglowej kP = 3,6·107
, czyli 1/kP = tak = 1,7 s.
Omówione powyżej modyfikacje przedstawiono na schemacie zamieszczonym na kolejnej stronie.