Substrat
(zdefiniowanie substratu, jego budowy i struktury) t = 0
Zderzenie enzymu z substratem Losowe określenie cząsteczki i miejsca
w cząsteczce, które atakuje enzym.
Czy enzym jest wstanie "rozciąć" wiązanie w atakowanej cząsteczce?
Zderzenie aktywne (produktywne): Proces enzymatycznego "cięcia" substratu
t t + akt.
Zderzenie nieaktywne (nieproduktywne): Nie dochodzi do reakcji enzymatycznej
t t + nieakt. TAK NIE KONIEC SYMULACJI NIE TAK
Czy w układzie pozostały cząsteczki substratu?
2.3.2 Model hydrolizy amylopektyny
2.3.2.1 Zdefiniowanie amylozy
Jak wspomniano, amyloza jest polimerem liniowym złożonym z reszt D-glukozy powiązanych wiązaniem glikozydowym -14. Cząsteczka amylozy posiada dwa końce różniące się właściwościami chemicznymi; koniec nieredukujący i koniec redukujący (z wolną grupą aldehydową). Stosowana analityka opiera się na metodzie z DNS [54-63], pozwalającej na określenie ilości cukrów, które zawierają wolną grupę aldehydową lub ketonową. Innymi słowy, w wyniku pomiarów, otrzymujemy informację o ilości końców redukujących, która to ilość nie zależy od długości łańcuchów policukrowych amylozy, lecz jedynie od ich ilości w opisywanym układzie. O CH2OH O H OH OH O O CH2OH O H OH O O O CH2OH O H OH O H CH2OH O H OH O O CH2OH O H OH O koniec redukujący koniec nieredukujący
Rys. 2.1. Schemat cząsteczki amylozy. Na rysunku zaznaczono pięć podjednostek glukozy, w rzeczywistości dla amylozy wchodzącej w skład skrobi ziemniaczanej liczba podjednostek glukozy w łańcuchu amylozy waha się od 1000 do 6000.
W dalszej części pracy przyjęto, że dla uproszczenia podjednostki glukozy w cząsteczce amylozy będzie przedstawiana symbolicznie jako strzałki. W celu odróżnienia od znaków powszechnie przyjętych w notacji chemicznej, przyjęto że dla wyróżnienia podjednostki glukozy będą oznaczane jako strzałki z podwójnym bełtem: "". Wybrano arbitralnie, że zwrot strzałek będzie odpowiadał zapisowi wiązania -14 i będzie on zgodny z kierunkiem degradacji cząsteczki w przypadku działania - i glukoamylazy. Przy numerowaniu podjednostek glukozy, przyjęto numerację od końca redukującego w kierunku końca nieredującego, zaznaczając numer jej nad strzałką symbolizującą podjednostkę glukozy. Ze względu na stosowaną w części doświadczalnej analitykę, postanowiono stworzyć funkcję charakterystyczną opisującą wszystkie wolne końce
redukujące oraz końce redukujące mogące powstać w wyniku całkowitej degradacji cząsteczek policukrów do wolnej glukozy.
Funkcja charakterystyczna A opisująca ilość wolnych końców redukujących i ilość wiązań glikozydowych -14 została zdefiniowana następująco:
1. Każdej podjednostce glukozy n, zostaje przypisana wartość binarna zero lub jeden, określająca “Czy podjednostka lub cząsteczka glukozy występuje potencjalnie w formie aldehydowej?”: A(0,1) .
2. Wartość zero przyjmuje funkcja dla danej podjednostki lub cząsteczki glukozy, jeśli zawiera ona wolną grupę aldehydową (koniec redukujący): An = 0 .
3. Wartość jeden przyjmuje funkcja dla danej podjednostki glukozy, jeżeli jej pierwszy atom węgla uczestniczy w wiązaniu -14 z kolejną podjednostką glukozy: An = 1 .
Przyjęto, że w schematycznym opisie cząsteczki amylozy, wartość opisanej powyżej funkcji charakterystycznej będzie zapisywana dla danej podjednostki lub cząsteczki glukozy w miejscu wskazanym przez grot strzałki symbolizującej podjednostkę glukozy. Według przyjętych zasad, cząsteczkę amylozy złożoną z pięciu podjednostek glukozy można przedstawić symbolicznie jako:
5 4 3 2 1
1
1
1
1
0
Przykładowo, hydrolizę powyższej cząsteczki przy udziale -amylazy do maltotriozy i maltozy można zapisać następująco:
5 4 3 2 1
1
1
1
1
0
amylaza
1 2 3 4 51
0
1
1
0
Dzięki wprowadzeniu funkcji charakterystycznej, łatwo zauważyć, że w wyniku powyższej reakcji, liczba końców redukujących w układzie wzrosła o jeden, a ilość wiązań -14 zmalała o jeden, przy niezmienionej liczbie podjednostek glukozy w rozpatrywanym układzie. W przypadku amylozy, w oparciu o zaproponowana funkcję charakterystyczną, można sprowadzić zapis reakcji do zapisu binarnego. Przykładowo omawianą powyżej reakcję można zapisać jako:
01111
amylaza
2.3.2.2 Opis cząsteczek substratów i produktów reakcji.
1. Amyloza:
1.1. polimer liniowy złożony z podjednostek glukozy. W przypadku skrobi ziemniaczanej przyjmuje się ze ilość podjednostek glukozy wchodzących w skład amyloz tworzących ziarna skrobi ziemniaczanej waha się od 1000 do 6000 podjednostek glukozy: 1000 lgam 6000,
1.2. liczba wiązań -14 między cząsteczkami glukozy w amylozie: wam = lgam-1,
1.3. ze względu na charakter reakcji przyjęto, że wiązania -14 w cząsteczce amylozy będą numerowane od końca redukującego,
1.4. cząsteczka amylopektyny posiada dwa końce rozróżnialne w stosowanej analityce: koniec redukujący i nieredukujący.
2. Produkty końcowe:
2.1. glukoza ( lg = 1 ),
2.2. maltoza - zawiera dwie podjednostki glukozy ( lg = 2 ), 2.3. maltotrioza - zawiera trzy podjednostki glukozy ( lg = 3). 2.3.2.3 Ogólne założenia modelu hydrolizy amylozy.
W oparciu o zaproponowany w pracy model, możliwe jest symulowanie reakcji enzym - jedna cząsteczka amylozy lub enzym - wiele cząsteczek amylozy. Możliwe jest także narzucenie określonej długości cząsteczki amylozy lub przyjęcie pseudolosowego rozkładu ich długości. Średnia długość cząsteczek amylozy waha się od 1000 do 6000 podjednostek glukozy w zależności od jej pochodzenia, sposobu otrzymania i składowania [5, 6]. W pracy przyjęto, że niezależnie od długości i ilości cząsteczek, będą one zapisywane w formie jednego łańcucha binarnego. Przykładowo, trzy cząsteczki amylozy o długości po 4000 podjednostek glukozy, można przedstawić symbolicznie jako:
4000 3999 2 1
1
1
1
1
0
; 8000 7999 4002 40011
1
1
1
0
; 12000 11999 8002 80011
1
1
1
0
, co odpowiada, przy przyjętej notacji binarnej, zapisowi:011…11 011…11 011…11.
Określenie cząsteczki i miejsca ataku enzymu, odbywa się poprzez wygenerowanie liczby całkowitej (w opisywanym przykładzie będzie to liczba całkowita z przedziału 112000), która jednoznacznie określa daną podjednostkę glukozy oraz jej położenie w łańcuchu policukrowym. Następnie, zgodnie ze specyfiką enzymu, zostaje określone, w sposób opisany w dalszej części pracy, czy enzym jest wstanie zhydrolizować cząsteczkę w danym miejscu?
2.3.2.4 Hydroliza amylozy przy udziale -amylazy.
1. Cząsteczkami substratów są cząsteczki amylozy, ( lgam 4 ) oraz ( wam 3 ). Dla amylozy ze skrobi ziemniaczanej przyjmuje się lgam 4000.
Liczba rozpatrywanych cząsteczek substratu w modelu jest nieograniczona. 2. Końcowymi produktami reakcji są cząsteczki maltozy i maltotriozy.
3. Symulacja reakcji odbywa się w oparciu o losowe określenie miejsca ataku enzymu na cząsteczki zawarte w roztworze. W sposób losowy określana jest liczba z przedziału 1lgcałk, która w jednoznaczny sposób określa podjednostkę glukozy wraz cząsteczkę cukru w której się zawiera oraz wiązanie przy węglu C1 w danej podjednostce.
4. Rozpatrywane są dwa typy zderzeń:
4.1. aktywne - zachodzące w momencie, kiedy enzym atakuje cząsteczkę amylozy, w miejscu podatnym na działanie enzymu,
4.2. nieaktywne - kiedy enzym, atakuje cząsteczkę amylozy w miejscu niepodatnym na działanie
-amylazy lub enzym atakuje inną cząsteczkę.
5. Miejscem podatnym na działanie -amylazy jest wiązanie -14 między drugą i trzecią podjednostką glukozy w cząsteczce amylozy, licząc od końca nieredukującego wiązanie podatne na atak -amylazy posiada numer ( wam - 2 ).
6. Ilość wiązań -14 w cząsteczce amylozy potencjalnie mogących ulec hydrolizie w wyniku działania
-amylazy wynosi: wbam = Int( (wam - 1) / 2).
7. W wyniku zderzenia aktywnego, od końca nieredukującego odcinana jest cząsteczka maltozy: 7.1. liczba podjednostek glukozy w łańcuchu amylozy maleje o dwie: [lgam]n [lgam - 2]n+1, 7.2. ilość wiązań -14 w cząsteczce amylozy maleje o dwa: [wam]n [wam - 2]n+1, 7.3. krok symulacji zwiększany jest o jeden: n n+1.
8. W wyniku zderzenia nieaktywnego:
8.1. liczba cząsteczek w układzie pozostaje bez zmian,
8.2. liczba podjednostek glukozy w łańcuchu amylozy pozostaje bez zmian: [lgam]n [lgam]n+1, 8.3. ilość wiązań -14 w cząsteczce amylozy pozostaje bez zmian: [wam]n [wam]n+1, 8.4. krok symulacji zwiększany jest o jeden: n n+1.
9. Za koniec reakcji przyjmuje się najmniejszą iterację, dla której ilość wiązań -14, w cząsteczkach amylozy, potencjalnie mogących ulec hydrolizie w wyniku działania
-amylazy wynosi zero: wbam = 0.
10. Miarą postępu reakcji jest ilość końców redukujących uwalnianych podczas procesu hydrolizy amylozy przez -amylazę.
Na sąsiedniej stronie przedstawiono schemat blokowy hydrolizy amylozy przy udziale -amylazy. Symbolem paragraf - "§" zaznaczono na schemacie blokowym odnośniki do powyższego tekstu.