Charakterystyka reagentów shmiR, wykorzystujących najczęściej stosowane nośnikowe pri-miRNA (pri-miR-30a oraz pri-miR-155)

Najczęściej wykorzystywane w konstrukcji reagentów shmiR hsa-pri-miR-30a oraz mmu-miR-155 stosowane są już od ponad dziesięciu lat (Zeng i wsp. 2002; Zeng i Cullen 2005; Chung i wsp. 2006). Od czasu ich zaproponowania wiedza dotycząca biogenezy miRNA znacznie się poszerzyła i poznano wiele nowych cząsteczek miRNA. Nie wiadomo jednak, czy pośród nowopoznanych miRNA nie ma lepszych pri-miRNA nośnikowych. Jak dotąd nie przeprowadzono systematycznej analizy porównawczej, mogącej dać odpowiedź na pytanie w jakim stopniu pri-miR-30a oraz pri-miR-155 spełniają kryteria optymalnych nośników do projektowania na ich podstawie reagentów shmiR i czym charakteryzują się uwalniane z nich siRNA. Aby odpowiedzieć na te pytania w niniejszej pracy zastosowano jednolity system eksperymentalny, pozwalający na monitorowanie poszczególnych etapów obróbki reagentów shmiR z wykorzystaniem dwóch uzupełniających się metod badawczych hybrydyzacji typu northern oraz NGS. Przeprowadzone badania pozwoliły na scharakteryzowanie puli krótkich RNA uwalnianych z hsa-pri-miR-30a, mmu-pri-miR-155 oraz z hsa-pri-miR-21, do których wprowadzono po trzy różne wstawki siRNA. Analizie poddano zarówno efektywność cięcia reagentów shmiR na obu etapach ich obróbki jak i scharakteryzowano uwalniane siRNA pod względem jakościowym oraz ilościowym.

W pierwszej kolejności wykazano, że z naturalnych pri-miRNA zarówno endogennych jak i pochodzących z nadekspresji uwalniana jest w komórkach heterogenna pula miRNA (Ryc. 13). Zaprojektowane na podstawie tych prekursorów reagenty shmiR wydajnie uwalniają w komórkach również niejednorodne cząsteczki siRNA (Ryc. 21 i Ryc. 22), efektywnie wyciszające ekspresję genów docelowych (Ryc. 24). Zaobserwowano, że efektywność uwalniania siRNA jak i stopień ich heterogenności jest różny w zależności od konstrukcji reagenta (połączenia wstawki siRNA z pri-miRNA). Zastosowanie nowoczesnej technologii NGS umożliwiło poznanie sekwencji uwalnianych cząsteczek siRNA oraz odtworzenie miejsc cięcia reagentów shmiR przez RNazy Drosha oraz Dicer. Pokazano, że w przypadku reagentów shmiR podobnie jak dla miRNA (Morin i wsp. 2008; Warf i wsp. 2011; Starega-Roslan i wsp. 2015) końce 5’ siRNA generowane przez domenę RIIIB RNazy Drosha są bardziej homogenne niż końce 3’ generowane przez domenę RIIIB RNazy Dicer. Zatem heterogenność siRNA obserwowana w wynikach hybrydyzacji typu northern związana jest najczęściej z różnymi końcami 3’ nici wiodących siRNA. Istnieje ryzyko że częściowo na pulę analizowanych cząsteczek siRNA oraz miRNA mogą mieć wpływ preferencje wiązania

103

białek AGO oraz modyfikacje końców cząsteczek RNA. Doniesienia o preferencyjnym wiązaniu przez białka AGO miRNA posiadających nukleotydy U lub A na końcu 5’ (Frank i wsp. 2010), zwracają uwagę na możliwość zwiększenia stabilności związanych wariantów miRNA w komórce i ich preferencyjne wykrywanie. Inni autorzy wykazali jednak, że miRNA występują w komórkach w znacznym nadmiarze w stosunku do białek AGO oraz że cząsteczki nie związane przez białko (lecz oddziałujące z sekwencją docelową) są w komórkach stabilne, co umożliwia ich detekcję metodą northern (Janas i wsp. 2012). Wyniki te pozwalają sądzić, że dane uzyskane w analizie NGS odzwierciedlają realne proporcje powstawania różnych wariantów siRNA w komórkach. Ze względu na zjawisko modyfikacji końców krótkich RNA, w niniejszej pracy we wszystkich przedstawianych analizach NGS wykryte sekwencje miRNA oraz siRNA posiadające nukleotydy „nie-matrycowe” nie były brane pod uwagę. Istnieje jednak ryzyko, że w części modyfikacji dodawany nukleotyd jest przypadkowo zgodny z sekwencją prekursora. Na podstawie danych literaturowych (Newman i wsp. 2011; Wyman i wsp. 2011) można jednak stwierdzić, że jest to na tyle niewielka grupa przypadków iż nie zaburza ona istotności uzyskanych wyników.

Wyniki przeprowadzonych analiz wykazały, że wzór siRNA uwalnianych z reagentów shmiR zależy zarówno od zastosowanego pri-miRNA nośnikowego jak i od sekwencji wstawki siRNA, a pula uwalnianych cząsteczek jest wypadkową połączenia tych dwóch elementów. Wykazano, że zarówno siRNA o wysokim jak i niskim stopniu heterogenności wykazywały podobną efektywność wyciszania genu docelowego w typowym zastosowaniu technologii RNAi. Dlatego wydaje się, że najczęściej stosowane prekursory nośnikowe hsa-pri-miR-30a oraz mmu-pri-miR-155, z których uwalniane są siRNA o różnej heterogenności stwarzają duże szanse na skonstruowanie efektywnie działających reagentów shmiR dla większości zastosowań RNAi. Pomimo, iż prekursory te nie wykazują ewidentnych różnic w funkcjonowaniu reagentów shmiR należy mieć na uwadze, że w przypadku pri-miR-155 istnieją dodatkowe aspekty, które mogą w niektórych przypadkach w znaczny sposób zmieniać działanie wykorzystujących go reagentów shmiR. Wiadomo, że komórkowa obróbka pri-miR-155 kontrolowana jest przez białko KSRP (ang. K homology Splicing Regulatory Protein) promujące obydwa etapy docinania przez RNazy (Ruggiero i wsp. 2009). Związanie białka KSRP występuje w obrębie motywu sekwencji w rejonie pętli terminalnej. Dodatkowo miR-155 uczestniczy w odpowiedzi immunologicznej komórek związanej z obecnością endotoksyny bakteryjnej LPS (lipopolisacharyd). Istnieje zatem ryzyko że obróbka reagentów shmiR, wykorzystujących pri-miR-155 będzie bardzo zmienna w zależności od rodzaju komórek, ich fizjologii oraz warunków stresowych, związanych

104

chociażby z zabiegiem transfekcji. Dodatkowo obróbka takich reagentów może być zmieniona w liniach komórkowych lub organizmach modelowych chorób związanych z zaburzeniami komórkowej odpowiedzi immunologicznej.

Wyniki przeprowadzonych analiz wykazały, że w przypadku pri-miR-21 brak precyzji podczas generowania siRNA na etapie cięcia przez RNazę Drosha prowadzi do powstawania wariantów siRNA ze zmienionym końcem 5’ (Ryc. 22). Oznacza to, że w niektórych przypadkach specyficzny konstrukt jakim jest reagent shmiR może wywołać zmianę precyzji cięcia oraz uwolnienie sekwencji siRNA ze zmienionym końcem 5’ oraz przesuniętym regionem źródłowym. Takie zależne od sekwencji efekty off-target mogą zniekształcać wyniki badań z wykorzystaniem reagentów shmiR oraz prowadzić do błędnych interpretacji obserwowanych wyników, przypisując je efektom specyficznego wyciszenia genu docelowego. Zmiana sekwencji końców cząsteczek siRNA może również wpływać na wybór aktywnej nici wprowadzanej do kompleksu RISC, dodatkowo zwiększając pulę regulowanych w komórce genów.

Prekursory nośnikowe pri-miR-30a oraz pri-miR-155 pomimo ich ulepszania na przestrzeni lat, mającego na celu zwiększenie efektywności uwalniania siRNA oraz poprawienie profilu ładowania odpowiedniej nici do kompleksu RISC (Rhee i wsp. 2009; Fellmann i wsp. 2013; Myburgh i wsp. 2014) wciąż nie są doskonałe. Ich główną wadą jest brak możliwości kontrolowania uwalnianej sekwencji siRNA oraz zwiększone ryzyko wywoływania efektów ubocznych zależnych od sekwencji typu „off-target” (Boudreau i wsp. 2013). Natomiast w szczególnych zastosowaniach RNAi, w których ważnym aspektem jest homogenność uwalnianych siRNA stosowanie tych prekursorów nośnikowych wymaga dalszej optymalizacji lub zastąpienia ich innymi pri-miRNA, zapewniającymi wyższą homogenność uwalnianym cząsteczkom siRNA.

105