Opracowanie oraz optymalizacja systemu do analizy reagentów typu shmiR 1. Pierwotne prekursory miRNA jako nośniki siRNA w technologii RNAi

Pierwszym etapem projektowania cząsteczek typu shmiR jest wybór odpowiedniego pri-miRNA, który posłuży w komórkach jako „nośnik” dla cząsteczki siRNA. W celu zidentyfikowania pri-miRNA najczęściej wykorzystywanych do tworzenia reagentów shmiR przeprowadzono szeroki przegląd literatury.

Na podstawie zebranych informacji wybrano dwa pierwotne prekursory miRNA najczęściej wykorzystywane do wyciszania ekspresji genów w komórkach zwierzęcych: hsa-pri-miR-30a, oraz mmu-pri-miR-155. Dla porównania badano również dobrze poznany i ulegający ekspresji we wszystkich ludzkich tkankach, hsa-pri-miR-21. Prekursor ten jest rzadko wykorzystywany do konstrukcji reagentów shmiR, jednak istnieją doniesienia, że może być on dobrym nośnikiem dla cząsteczek siRNA (Yue i wsp. 2010; Huang i Jia 2013; Choi i wsp. 2015).

Przewidywane struktury drugorzędowe wybranych pri-miRNA przedstawiono na Ryc. 11. Różnią się one zarówno pod względem struktur tworzonych przez sekwencje otaczające prekursor pre-miRNA, obecności motywów strukturalnych wprowadzających lokalne rozluźnienia podwójnej helisy RNA w obrębie trzonu struktury spinki, jak i wielkości pętli terminalnej.

42

Ryc. 11. Przewidywane struktury przyjmowane przez pierwotne prekursory 30a, miR-155 oraz miR-21. Zacieniony obszar odpowiada dupleksowi miRNA/miRNA*. Zaznaczono

główne miejsca cięcia przez RNazy Drosha i Dicer. Przedstawione struktury obejmują fragmenty sekwencji otaczającej strukturę pre-miRNA wystarczające do ich efektywnej obróbki.

43

Wstępne analizy poziomu ekspresji miRNA powstających z wybranych pri-miRNA przeprowadzono na podstawie wyników NGS zdeponowanych w bazach miRBase (v.16 i v.21) oraz deepBase (Yang i wsp. 2010a; Kozomara i Griffiths-Jones 2011). Umożliwiło to scharakteryzowanie dojrzałych cząsteczek miRNA uwalnianych z tych pri-miRNA oraz identyfikację nici wiodącej (Ryc. 12).

W przypadku hsa-miR-30a zaobserwowano duży udział nici miRNA pochodzących z obu ramion, co może wskazywać na ich funkcjonalność. Również poziom ekspresji tego miRNA jest bardzo wysoki (~ 10 tys. RPM; ang. reads per million), co może pośrednio świadczyć o efektywnej obróbce tego prekursora przez RNazy Drosha i Dicer. Wysoki poziom miRNA zaobserwowano również w przypadku hsa-miR-21 (~24 tys. RPM), jednak ze zdecydowaną przewagą miRNA uwalnianego z ramienia 5’ (Ryc. 12). Podobna dominacja nici wiodącej z ramienia 5’ obserwowana jest w przypadku mmu-miR-155, jednak jego poziom komórkowy jest dużo niższy (~ 0,5 tys. RPM).

Następnym krokiem prowadzonych badań było sprawdzenie czy w wyniku nadekspresji badanych pri-miRNA w komórkach sposób ich obróbki przez RNazy Drosha i Dicer nie ulega zmianie. Jako model eksperymentalny wybrano dwie ludzkie linie komórkowe: linię HEK 293T oraz linię HeLa. Ponieważ odpowiednie skrócenie sekwencji otaczających pre-miRNA ułatwia dalsze kroki związane z konstruowaniem reagentów technologii RNAi przeprowadzono szereg przewidywań struktur cząsteczek pri-miRNA, z sekwencjami otaczającymi różnej długości. Skrócenie sekwencji otaczających pre-miRNA do około 40 nt

Ryc. 12. Ekspresja endogennych miRNA 30a, 21, oraz 155 według bazy miRBase v21. Przedstawiono wyniki

44

ze strony 5’ oraz 3’ zostało przeprowadzone tak aby przewidywana struktura skróconego pri-miRNA nie uległa zmianie.

Na drodze ligacji odpowiednich par oligonukleotydów (patrz Materiały i Metody) stworzono kasety ekspresyjne dla wybranych prekursorów pri-miRNA. Następnie skonstruowane kasety ekspresyjne wklonowano do dostępnego komercyjnie wektora lentiwirusowego pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP (SBI), z którego transkrypty pri-miRNA ulegały ekspresji pod kontrolą promotora Pol II RNA(CMV).

W prowadzonych badaniach do analizy komórkowej obróbki cząsteczek RNA zastosowano dwie uzupełniające się metody: hybrydyzację typu northern oraz NGS. Metody te pozwalają na przeprowadzenie szczegółowej charakterystyki powstających w komórkach krótkich cząsteczek RNA, dostarczając jednak odmiennych informacji. Wyniki hybrydyzacji typu northern z zastosowaniem radioaktywnie znakowanej sondy oligonukleotydowej oraz silnych warunków denaturujących umożliwiają wizualizację cząsteczek prekursorów jak i dojrzałych miRNA lub siRNA z jednonukleotydową rozdzielczością (Koscianska i wsp. 2011b). Dostarczają one jednak informacji na temat długości obserwowanych produktów bez możliwości wyszczególnienia ile wariantów np. miRNA o nieznacznie przesuniętej sekwencji (ale wciąż zachowanej długości) migruje w żelu w postaci jednego prążka. Taką informację dostarcza natomiast metoda NGS krótkich RNA, umożliwiająca określenie sekwencji powstających cząsteczek miRNA lub siRNA oraz przeprowadzenie analizy ilościowej. Wyniki tej metody nie zawierają jednak informacji o powstających w komórkach prekursorach pre-miRNA.

Wyniki hybrydyzacji typu northern na materiale po nadekspresji pri-miRNA w komórkach HEK i HeLa wykazały różne poziomy prekursorów pre-miRNA powstających z testowanych konstruktów oraz niejednorodność uwalnianych cząsteczek miRNA (Ryc. 13A). Wykrywane w tej analizie produkty odpowiadały wariantom miRNA obserwowanym w wynikach NGS (Ryc. 12). Wysokorozdzielcza analiza prekursorów pre-miRNA (Ryc. 13B) wykazała ich dużą homogenność. Jedynie w przypadku miR-21 obserwowano niewielki udział dodatkowych wariantów pre-miRNA. Prekursory endogennych miRNA w materiale z komórek kontrolnych ulegały ekspresji na znacznie niższym poziomie i były wykrywane tylko w przypadku pri-miR-21.

45

Na podstawie uzyskanych wyników nie stwierdzono zmian w sposobie uwalniania dojrzałych miRNA, wynikających ze skrócenia sekwencji otaczających pre-miRNA. Potwierdzono, że w systemie nadekspresji pri-miRNA pula uwalnianych krótkich cząsteczek RNA jest podobna pod względem jakościowym do wariantów miRNA obserwowanych w naturze. Podwyższeniu ulega jedynie poziom uwalnianych cząsteczek miRNA, co ułatwia ich detekcję oraz dalszą analizę.

Ryc. 13. Badanie efektów obróbki pri-miRNA przez RNazy Drosha i Dicer po nadekspresji w komórkach HEK oraz HeLa. A- prekursory pre-miRNA powstałe w wyniku cięcia

pri-miRNA przez RNazę Drosha oraz cząsteczki siRNA powstałe w wyniku cięcia prekursorów pre-miRNA przez RNazę Dicer. B- analiza typu northern dla prekursorów pre-miRNA; L1- marker wielkości RNA. K – kontrolne RNA z komórek nietraktowanych

46

2.2. Projektowanie reagentów shmiR

W tej części pracy podjęto badania mające na celu opracowanie systemu, umożliwiającego porównawczą charakterystykę wybranych pri-miRNA pod kątem konstrukcji cząsteczek shmiR. Jak wspomniano już wcześniej analizowane konstrukty posiadały skrócone sekwencje otaczające pre-miRNA o długościach przedstawionych w Tabela 3.

Tabela 3. Stosowane w reagentach shmiR długości sekwencji otaczających.

Wyniki NGS oraz doniesienia literaturowe wskazują na większą homogenność końców 5’ niż 3’ miRNA (Landgraf i wsp. 2007; Morin i wsp. 2008; Warf i wsp. 2011) oraz na większą precyzję cięcia przez RNazę Drosha niż Dicer (Calabrese i wsp. 2007). Z tego względu w dalszej części badań skupiono się na cząsteczkach posiadających nić wiodącą wprowadzoną do ramienia 5’ reagentów shmiR, tak aby koniec 5’ nici wiodącej siRNA generowany był przez RNazę Drosha. Naturalne sekwencje miRNA uwalniane z analizowanych prekursorów w wielu przypadkach są dłuższe (23 do 24 nt) niż standardowe 21-nt cząsteczki siRNA. Dodatkowo sekwencje siRNA bardzo często posiadają tylko 19 nt komplementarnych z sekwencją docelową z dołączonym dwukleotydem TT lub UU na końcu 3’. Z tego względu w stosowanym podejściu do pri-miRNA wprowadzano 21 nt sekwencje siRNA komplementarne do sekwencji docelowej. Pierwszy nukleotyd siRNA wprowadzany był w pierwszej pozycji miRNA natomiast brakujące nukleotydy w pozycji 22, 23 i/lub 24 pozostawiane były niezmienione w

stosunku do wyjściowej sekwencji prekursora (Ryc. 14). Wyjątek stanowiły przypadki, w których konieczne było wprowadzenie zmian w celu zachowania oryginalnej struktury prekursora nośnikowego (shmiR-21-luc, HD1).

długość sekwencji otaczającej 5’ 3’ pri-miR-30a 35 nt 40 nt

pri-miR-155 24 nt 64 nt

pri-miR-21 40 nt 50 nt

47

2.3. Charakterystyka mysiego i ludzkiego pri-miR-155

Wśród wybranych, najczęściej stosowanych pri-miRNA wykorzystywanych do konstrukcji reagentów shmiR znalazł się pri-miR-155. Co ciekawe, najczęściej opisywany w literaturze jest jego mysi odpowiednik, jednak istnieją doniesienia o efektywnym funkcjonowaniu hsa-miR-155 jako nośnika do ekspresji siRNA w komórkach (Terasawa i wsp. 2010). W ramach niniejszej pracy porównano oba ortologi pri-miR-155 w komórkach ludzkich. Obydwa prekursory hsa-pri-miR155 oraz mmu-pri-miR-155 uwalniają w komórkach miRNA o identycznej sekwencji nukleotydowej, posiadają natomiast różnice w sekwencji w nici pasażerskiej, pętli terminalnej oraz w sekwencjach otaczających prekursor (zaznaczone kolorem żółtym na rycinie) (Ryc. 15A oraz B).

Ryc. 15. Porównanie przewidywanej struktury mysiego oraz ludzkiego pri-miR-155. A – Struktury pri-miRNA wykorzystywanych do tworzenia reagentów shmiR. B - Powiększona sekwencja pre-miRNA. Kolorem żółtym zaznaczono nukleotydy różniące się w ludzkim ortologu w stosunku do mysiego. Zacieniony obszar odpowiada dojrzałemu dupleksowi miRNA/miRNA *

48

Konsekwencją różnej sekwencji nukleotydowej są zmiany w przewidywanej strukturze drugorzędowej tych pri-miRNA. Różnice występują nie tylko w obrębie pętli terminalnej oraz sekwencji otaczających ale również w obrębie trzonu struktury spinki.

W kolejnym kroku do obydwu cząsteczek pri-miR-155 wprowadzono sekwencje siRNA-HD1 oraz siRNA-luc tworząc odpowiednio reagenty hsa-155-HD1 i shmiR-hsa-155-luc oraz shmiR-mmu-155-HD1 i shmiR-mmu-155-luc. Następnie, po ekspresji reagentów w komórkach HEK porównano efektywność ich obróbki (Ryc. 16A).

Wyniki przeprowadzonej analizy pokazały, że we wszystkich analizowanych przypadkach obróbka reagentów shmiR na etapie cięcia przez RNazę Drosha zachodziła efektywnie. Jednak sygnały odpowiadające pre-miRNA różniły się zauważalnie

Ryc. 16 Porównanie obróbki reagentów shmiR wykorzystujących ludzki oraz mysi pri-miRNA-155.