typu northern), B- Próba poprawy wydajności obróbki reagenta shmiR-hsa-155-luc. Druga wersja reagenta (B) shmiR-hsa-155-luc ze zmienioną sekwencją w miejscu cięcia przez RNazę Dicer. Czarna linią zaznaczono przewidywane miejsca cięcia przez RNazy. Przewidywane miejsce cięcia przez Dicer zostało przesunięte w kierunku pętli terminalnej na podstawie długości uwalnianych z wersji reagenta B produktów siRNA. L1 oraz, L2 - markery wielkości RNA.
49
intensywnością. Prekursory shRNA cząsteczek wykorzystujących ludzki pri-miRNA wykazywały szybszą migrację elektroforetyczną związaną z przewidywaną 4nt różnicą długości (Ryc. 16B oraz Materiały i Metody Ryc. 53). Większy udział produktów shRNA powstających z mysiego pri-miRNA może świadczyć o pozytywnym wpływie rozluźnienia struktury w obrębie miejsca cięcia przez RNazę Drosha na jej aktywność (Ryc. 15B).
Znaczne różnice zaobserwowano na etapie efektywności obróbki cząsteczek przez RNazę Dicer. Obserwowano silne, heterogenne sygnały pochodzące od siRNA uwalnianych z mysiego pri-miRNA i słabo wykrywalne sygnały siRNA uwalnianych z ludzkiego ortologu. Większa heterogenność siRNA-HD1 niż siRNA-luc uwalnianych z mmu-pri-miR-155 może być spowodowana obecnością pary U:A przerywającej ciąg pięciu par G:C w pobliżu miejsca cięcia przez RNazę Dicer (Materiały i Metody Ryc. 53).
Dla reagenta shmiR-hsa-155-luc podjęto próbę poprawienia wydajności jego komórkowej obróbki. Stworzono dodatkowy konstrukt (shmiR-hsa-155-luc-B) z wprowadzoną zmianą sekwencji nukleotydowej w pobliżu miejsca cięcia przez RNazę Dicer, tak aby upodobnić cząsteczkę shmiR do endogennego prekursora miRNA (Ryc. 16B). Zmieniono parę C:G na „słabszą” parę U:A w miejscu cięcia przez RNazę Dicer. Zastosowana modyfikacja poprawiła efektywność obróbki reagenta w komórkach na etapie cięcia przez RNazę Dicer, jednak w porównaniu do wersji mysiej uwalniane siRNA pozostawały nadal na niskim poziomie (Ryc. 16B).
Wyniki przeprowadzonej analizy wykazały, że zastosowanie mmu-pri-miR-155 w ludzkich komórkach daje większe szanse na uzyskanie reagentów shmiR efektywnie uwalniających cząsteczki siRNA. Na podstawie otrzymanych wyników do dalszej części badań wybrano mysi prekursor mmu-pri-miR-155. Obserwowana poprawa efektywności obróbki reagenta shmiR-hsa-155-lucB po zmianie sekwencji w miejscu cięcia przez RNazę Dicer, jak również różnice obserwowane pomiędzy reagentami shmiR-mmu-155 mogą sugerować, że sekwencja nukleotydowa może mieć wpływ na efektywność powstawania cząsteczek siRNA w komórkach.
50
2.4. Konstrukcja trzech serii reagentów shmiR różniących się typem pri-miRNA
W celu dokonania charakterystyki reagentów shmiR skonstruowano trzy serie cząsteczek (wykorzystujących różne nośnikowe pri-miRNA) z trzema różnymi sekwencjami siRNA zastępującymi endogenny dupleks miRNA/miRNA*. Sekwencje siRNA wybrano kierując się głównie ich wysoką efektywnością wyciszania sekwencji docelowej po ich podaniu do komórek w postaci syntetycznych cząsteczek (Moses i wsp. 2010; de Mezer i wsp. 2011). Wytypowane siRNA posiadają sekwencje docelowe w genie lucyferazy (siRNA-luc) oraz w genie huntingtyny (siRNA-HD1 oraz siRNA-HD2), różnią się natomiast sekwencją nukleotydową oraz zawartością par G:C.
Badając serię reagentów zawierających sekwencję siRNA-HD1 metodą northern blot, nie zaobserwowano produktów obróbki niektórych cząsteczek (Ryc. 17A). W przypadku reagenta shmiR-21-HD1 (w1) nie obserwowano ani dociętego prekursora shRNA ani dojrzałych cząsteczek siRNA, co mogło być spowodowane zahamowaniem jego obróbki już na etapie cięcia przez RNazę Drosha.
Ryc. 17. Obróbka serii reagentów shmiR z siRNA-HD1 analizowana metodą northern blot. A-komórkowa obróbka reagentów shmiR-30a-HD1, shmiR-21-HD1-w1, shmiR-155-HD1.
Zaznaczona cząsteczka shmiR-21-HD1-W1 (wersja pierwsza) wykazująca bardzo niską efektywność cięcia. B- Efektywna obróbka drugiej wersji (w2) reagenta shmiR-HD1 ze zmienionym miejscem cięcia dla RNazy Drosha. L1 oraz, L2 - markery wielkości RNA.
51
Aby poprawić efektywność komórkowej obróbki reagenta shmiR-21-HD1, stworzono jego drugą wersję (w2) zawierającą substytucję nukleotydową w miejscu cięcia przez RNazę Drosha (Ryc. 17B). W endogennym pri-miR-21 występuje w tym miejscu niekanoniczna para nukleotydowa typu „wobble” (G:U), a w wyjściowym reagencie shmiR (w1) wprowadzona została niekanoniczna para A:G. Zastosowany w wariancie drugim (w2) reagenta shmiR powrót do pary G:U odtwarza sekwencję miejsca cięcia wyjściowego prekursora pri-miR-21. Analiza northern blot pokazała, że komórkowa obróbka reagenta shmiR-21-luc-w2 uległa znacznej poprawie. Zaobserwowano zarówno produkty cięcia przez RNazę Drosha jak i Dicer. Na podstawie uzyskanych wyników reagent shmiR-21-HD1-w2 został wykorzystany w dalszych badaniach opisanych w niniejszej pracy.
Podsumowując, podobnie jak w przypadku substytucji w miejscu cięcia przez RNazę Dicer, w przypadku poprawy efektywności cięcia reagenta shmiR-155-lucB opisanego w poprzednim rozdziale tak i zmiana sekwencji w miejscu cięcia przez RNazę Drosha doprowadziła do zwiększenia wydajności obróbki reagenta shmiR. Jest to kolejna przesłanka o potencjalnym znaczeniu sekwencji nukleotydowej w miejscu cięcia reagntów RNAi, tym razem przez RNazę Drosha.
52
2.5. Opracowanie systemu eksperymentalnego do badania efektywności działania reagentów shmiR
W celu sprawdzenia funkcjonalności testowanych cząsteczek shmiR zaadaptowano system lucyferazowy. Analizy przeprowadzono z wykorzystaniem linii komórkowych HEK 293T oraz HeLa. W badaniach wykorzystano komercyjny wektor pmiR-Glo (Promega), zawierający sekwencje genów lucyferazy, pochodzących z organizmów Firefly (Photinus pyralis) oraz Renilla (Renilla reniformis). W wektorze tym, sekwencję docelową dla testowanych cząsteczek umieszcza się bezpośrednio za genem lucyferazy firefly, natomiast produkt genu lucyferazy renilla
wykorzystywany jest jako kontrola wewnętrzna. Na potrzeby prowadzonych badań do wektora pmiRGlo wklonowano pierwszy egzon genu huntingtyny zawierający sekwencje docelowe dla siRNA-HD1 oraz siRNA-HD2. Cząsteczki shmiR uwalniające siRNA-luc posiadają sekwencję docelową w obrębie genu lucyferazy firefly (Ryc. 18). Przeprowadzono optymalizację procesu kotransfekcji komórek dwoma plazmidami dotyczącą zarówno ilości wprowadzanych wektorów jak i proporcji wektora shmiR do wektora pmiRGlo (patrz Materiały i Metody).
Przeprowadzone analizy pokazały, że cząsteczki siRNA uwalniane z reagentów shmiR efektywnie działają w komórkach i mogą osiągać poziomy wyciszania zbliżone do syntetycznych cząsteczek siRNA.
Ryc. 18. Wektor lucyferazowy do testowania efektywności cząsteczek shmiR. Kolorem
czerwonym zaznaczono miejsca docelowe dla testowanych siRNA.
53
2.6. Wybór linii komórkowej do badania reagentów shmiR
Końcowym etapem opracowania systemu do charakterystyki reagentów shmiR był wybór odpowiedniej linii komórkowej. W przedstawionych powyżej badaniach stosowano standardowo wykorzystywane w biologii molekularnej linie komórkowe HEK 293T oraz komórki HeLa.
W celu porównania wyników uzyskanych z zastosowaniem obu linii komórkowych przeprowadzono analizę intensywności sygnałów wykrywanych w hybrydyzacji typu northern, a odpowiadających różnym etapom komórkowej obróbki testowanych cząsteczek.
Zaobserwowano, że profile sygnałów pochodzących od produktów poszczególnych etapów cięcia prekursorów w obydwu liniach komórkowych są podobne natomiast różnią się intensywnością (Ryc. 19A).
Ryc. 19. Porównanie poziomów i efektywności działania reagentów shmiR w liniach komórkowych HEK oraz HeLa.