shmiR-21-luc
4.3. Wpływ cech sekwencji nukleotydowej na precyzję cięcia reagentów shmiR przez RNazy Drosha oraz Dicer
4.3.1. Częstość występowania nukleotydów w miejscach cięcia przez RNazy Drosha oraz Dicer
W kolejnym etapie badań sprawdzono, czy sekwencja nukleotydowa w miejscach cięcia przez RNazy Drosha oraz Dicer może być istotnym czynnikiem wpływającym na sposób obróbki cząsteczek prekursorowych w komórkach (Starega-Roslan i wsp. 2015). W pierwszej kolejności przeprowadzono analizę bioinformatyczną dla endogennych miRNA, ze względu na możliwość analizy dużej grupy cząsteczek o różnych sekwencjach nukleotydowych. Analizę przeprowadzono dla miRNA ulegających ekspresji w komórkach HEK 293T na danych pochodzących z NGS udostępnionych przez Dr Davida Galasa (Lee i wsp. 2010) uzyskanych na platformie Illumina/Solexa. Wszystkie miRNA, które wykazały powyżej 5 odczytów w analizie NGS zostały podzielone na grupę homogennych oraz heterogennych miRNA. Do homogennych miRNA zaliczono takie cząsteczki, których główny wariant miRNA uwalnianego z danego ramienia stanowił 90% i więcej. W grupie miRNA heterogennych znalazły się takie cząsteczki, których główny wariant stanowi poniżej 70% (od 30 do 70 %). Grupa miRNA pośrednich, których główny wariant osiąga 70-90%, jako bardzo niejednorodna nie była dalej analizowana. Wysoka częstość (w przypadku heterogennych
86
miRNA) oraz niska częstość lub brak (w przypadku homogennych miRNA) drugiego najczęstszego wariantu miRNA, decyduje o przyporządkowaniu cząsteczek do poszczególnych grup. Dlatego dodatkowo analiza została wykonana w obrębie grupy miRNA homogennych dla pierwszego najbardziej reprezentowanego wariantu oraz dla drugiego wariantu stanowiącego poniżej 10 % odczytów. Należy w tym miejscu podkreślić że w grupie heterogennych miRNA drugi wariant może być prawie tak samo częsty jak pierwszy i osiągać wartości blisko 50%.
W obrębie wydzielonych dwóch grup miRNA przeanalizowano częstość występowania poszczególnych nukleotydów w miejscach cięcia prekursorów przez RNazy. Zaobserwowano istotne statystycznie różnice w częstości nukleotydów w głównym wariancie miRNA pomiędzy grupą homogennych i heterogennych miRNA (Ryc. 38A i B) (oznaczone kolorem czerwonym) oraz istotne statystycznie różnice pomiędzy pierwszym a drugim wariantem w obrębie miRNA homogennych (Ryc. 38A i C) (oznaczone kolorem zielonym). Obserwowano również pozycje wykazujące istotną statystycznie różnicę częstości występowania nukleotydów w stosunku do tła, przedstawiającego średnią częstość nukleotydów w obrębie ludzkich pre-miRNA wg. bazy miRBase (oznaczone czarnym kolorem lub czarną obwódką liter, jeżeli w danej pozycji zaznaczona była istotność statystyczna we wcześniejszych porównaniach).
87
Ryc. 38. Anliza częstości występowania nukleotydów w miejscach ciecia prekursorów pri-miRNA przez RNazy Drosha oraz Dicer. Częstości nukleotydów w pobliżu miejsc cięcia
przedstawiono w postaci WebLogo. Na każdym wykresie na osi Y podano częstości nukleotydów reprezentowane przez wielkość liter odpowiadających poszczególnym nukleotydom. Nukleotydy wykazujące statystycznie zmienioną częstość w stosunku do tła (p<0.00078, dwustronny, dokładny test Fishera z poprawką Bonferroni) (Materialy i Metody Tabela 8) zostały zaznaczone kolorem czarnym lub czarą obwódką liter. n- reprezentuje liczbę analizowanych miRNA. Analiza dla: A- głównych wariantów miRNA homogennych, B- głównych wariantów miRNA heterogennych, C- drugiego wariantu miRNA homogennych. D- Tło zostało określone jako średnia częstość nukleotydów w obrębie ludzkich prekursorów miRNA zdeponowanych w bazie miRBase v14. Wartości istotności statystycznej (p-value) w pozycjach Na, Nb, Nc, Nd, N5, N6, N7, N8 oraz Ne, Nf, Ng, Nh, N1, N2, N2, N3, N4 umieszczono w rozdziale Materiały i Metody (Tabela 8).
88
Porównanie pomiędzy grupami homogennych i heterogennych miRNA pokazało, że występują istotne różnice w występowaniu nukleotydu G (p=2,22 × 10−4) w drugiej pozycji miRNA uwalnianego z ramienia 5’ (nadreprezentacja w grupie homogennych i zubożenie w grupie heterogennych miRNA) oraz w występowaniu nukleotydu U (p=2.7 × 10−6) w ostatniej pozycji miRNA uwalnianego z ramienia 5’ (Ryc. 38A i B). Zaobserwowano również różnice w występowaniu nukleotydu U (p=2,51 × 10−4) w ostatniej pozycji miRNA na końcu 3’ w grupie homogennych miRNA uwalnianych z ramienia 3’ (nadreprezentacja w grupie homogennych i zubożenie w grupie heterogennych miRNA). W pierwszej pozycji odcinanej sekwencji otaczającej pre-miRNA w ramieniu 3’ w grupie homogennych miRNA, zaobserwowano zwiększoną częstość występowania C (p=7.07 × 10−4) oraz brak A (p= 3,07 × 10−4), podczas gdy w grupie miRNA heterogennych częstość nukleotydów A i C w tej pozycji nie odbiegała od tła.
Porównanie pierwszego oraz drugiego najczęstszego wariantu miRNA w obrębie grupy homogennych miRNA (Ryc. 38A i C) wykazało brak nukleotydu G (p=2,9 × 10−4) w ostatniej pozycji głównego wariantu miRNA uwalnianego z ramienia 3’ oraz niską częstość występowania nukleotydu U (p=1,76 × 10−5) w pozycji ją poprzedzającej (w kierunku 5’). Podczas gdy nukleotydy te w analogicznych pozycjach drugiego wariantu miRNA wykazywały wysoką częstość występowania. Uzyskane wyniki mogą świadczyć o tym, że charakterystyczne cechy sekwencji wykrywane w drugim najczęstszym wariancie miRNA homogennych są odpowiedzialne za jego niską ekspresję.
Analiza częstości nukleotydów w odniesieniu do tła (Ryc. 38D) wykazała, że w grupie homogennych miRNA występuje znacznie więcej nukleotydów o istotnie zmienionej częstości. Obserwowano brak występowania nukleotydu G (p=1,27 × 10−4) w pierwszej pozycji miRNA uwalnianego z ramienia 5’, preferencyjne występowanie nukleotydów UG na końcu 5’ cząsteczek powstających z ramienia 5’ (p=4,61 × 10−6; p=3,44 × 10−5), oraz nadreprezentację nukleotydów U (p=1,56 × 10−9; p=7,76 × 10−4) na końcach 3’ cząsteczek pochodzących z obydwu ramion prekursora. W grupie heterogennych miRNA wykryto tylko dwie cechy istotne statystycznie w stosunku do tła (preferencja występowania A w pierwszej pozycji miRNA uwalnianego z ramienia 3’(p=2,41 × 10−4) oraz bardzo niską częstość występowania nukleotydu A w drugim nukleotydzie sekwencji odcinanej przez RNazę Dicer w ramieniu 5’ (p=5,33 × 10−4 )).
89
Dzięki przeprowadzonej analizie bioinformatycznej wykryto te cechy sekwencji, które różnią homogenne i heterogenne miRNA, głównie w miejscu docinania prekursorów pri-miRNA przez RNazę Drosha. Zidentyfikowano zdecydowanie więcej elementów sekwencji charakterystycznych dla homogennych miRNA, niż dla miRNA heterogennych.
We wcześniejszych rozdziałach niniejszej pracy zauważono, że w niektórych przypadkach zmiany sekwencji w miejscu cięcia powodowały obniżenie efektywności obróbki reagentów shmiR. Wyniki analizy bioinformatycznej dla pri-miRNA pozwalają natomiast sądzić, iż sekwencja w miejscach cięcia przez RNazy może wpływać również na precyzję cięcia pri-miRNA jak i konstruowanych na ich podstawie reagentów shmiR.
90
4.3.2. Wpływ zmian sekwencji na precyzję cięcia reagentów shmiR przez RNazy