Dehydrogenaza mrówczanowa

3.3.6.1. Ogólna charakterystyka enzymu FDH

Dehydrogenaza mrówczanowa (ang. formate dehydrogenase, FDH, EC 1.2.1.2) należy do rodziny NAD⁺-zależnych dehydrogenaz działających na związki karbonylowe. Katalizuje nieodwracalną reakcję utleniania mrówczanu do ditlenku węgla przy jednoczesnej redukcji koenzymu NAD⁺ (schemat 3.9).

O

Schemat 3.9. Utlenianie mrówczanu do ditlenku węgla katalizowane przez FDH

Dehydrogenaza mrówczanowa składa się z dwóch identycznych podjednostek białkowych i nie zawiera w swojej strukturze jonów metali i grup prostetycznych.

Optymalne warunki do działania FDH

Optymalne warunki działania FDH z Candida boidinii to temperatura 45-55°C i pH 7,5-8,5, jednak wykazuje on aktywność enzymatyczną w szerokim zakresie temperatury i pH (5,5-11). Bakteryjny FDH charakteryzuje się większą stabilnością w warunkach środowiskowych niż enzym wyizolowany z drożdży.

Specyficzność substratowa

FDH charakteryzuje się wysoką specyficznością zarówno względem preferowanego substratu, jak i koenzymu. Związki takie jak formaldehyd, formamid, metanol, tiomrówczan, octan, mleczan i jabłczan nie są substratami dla FDH i wszystko wskazuje na to, że katalizuje on reakcje wyłącznie w obecności mrówczanu i koenzymu NAD⁺. FDH jest enzymem pro-R specyficznym względem przeniesienia atomu wodoru między mrówczanem a koenzymem NAD⁺ [52].

Inhibitory FDH

Inhibitorami enzymu FDH są jony Cu²⁺, N3

-, OCN^-, NO2

-, SCN^- oraz tiomrówczan, rtęć i związki rtęcioorganiczne, takie jak kwas p-chlorortęciobenzoesowy [52]. Związki rtęci reagują z grupami tiolowymi aminokwasów, co świadczy o tym, że cysteina odgrywa ważną rolę w zapewnieniu aktywności katalitycznej i struktury natywnej białkowej FDH.

Występowanie i znaczenie biologiczne FDH

FDH występuje w mikroorganizmach metylotroficznych takich jak drożdże (Candida, Pichia, Hansenula) oraz niektóre szczepy bakterii (Pseudomonas, Moraxella, Mycobacterium vaccae). Utlenianie mrówczanu do ditlenku węgla jest jednym z głównych źródeł energii dla tych organizmów; co więcej, enzym FDH odgrywa istotną rolę w procesie dysymilacji, gdyż jest terminalnym enzymem utleniania metanolu w szlaku metabolicznym poprzez formaldehyd do ditlenku węgla [53].

3.3.6.2. Budowa enzymu FDH

Enzym FDH wyizolowany z drożdży Candida boidinii ma strukturę homodimeru zbudowanego z dwóch identycznych podjednostek o łącznej masie cząsteczkowej 74 kDa (rysunek 3.9).

Rysunek 3.9. Struktura krystalograficzna podjednostki enzymu FDH z Candida boidinii (β-kartki zaznaczone strzałkami, α-helisy - wstęgami) [54]

Każda z podjednostek składa się z piętnastu α-helis i trzynastu β-kartek, które występują w postaci dwóch domen - domeny odpowiedzialnej za rozpoznanie i wiązanie NAD⁺ oraz domeny katalitycznej, przyłączającej substrat. Domena, wiążąca koenzym, jest zwinięta w charakterystyczną dla dehydrogenaz strukturę Rossmana, składającą się z sześciu równoległych β-kartek, związanych z dwiema parami α-helis w kolejności β-α-β-α-β. Każda struktura Rossmana wiąże tylko jeden nukleotyd, dlatego domeny wiążące NAD⁺ zawierają po dwie struktury Rossmana, by móc związać cały dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy. Domena katalityczna natomiast ma postać struktury flawodoksyny, czyli pięciu równoległych β-kartek, otoczonych α-helisami i zawierających mononukleotyd flawinowy (FMN). Domeny w monomerze są połączone ze sobą dwiema helisami H6 i H15, co pozwala na ich ruch względem siebie i utworzenie między nimi głębokiej szczeliny, pełniącej funkcję centrum aktywnego. Po przeciwnej stronie monomeru znajduje się szczelina dimeryzacji, odpowiedzialna za łączenie się podjednostek w dimer poprzez dwie domeny wiążące NAD⁺ oraz helisę H1.

Kontakt między monomerami zapewnia motyw – helisa-skręt-helisa – zbudowany z 19 aminokwasów, który odstaje od domeny wiążącej NAD⁺ i dopasowuje się do szczeliny

dimeryzacji drugiej podjednostki enzymu. Struktura enzymu FDH jest zwarta, jednak domeny katalityczne są odsłonięte, co sprawia, że centrum aktywne jest łatwo dostępne.

FDH nie zawiera w swej strukturze jonów metali i grup prostetycznych. Forma apoenzymu występuje w postaci konformacji otwartej. Natomiast w formie holoenzymu, w połączeniu z koenzymem NAD⁺, przekształca się w konformację zamkniętą, gdzie domena katalityczna jest przechylona o 8°, co skutkuje zwężeniem szczeliny centrum aktywnego. Każda podjednostka enzymu zawiera niezależne centrum aktywne, gdzie reszty aminokwasów Arg 258 i Asn 119 wiążą mrówczan, przekształcając go w produkt. W domenie wiążącej NAD⁺ reszty aminokwasów Asp 282 i Ser 313 zapewniają kontakt z pierścieniem nikotynoamidowym, natomiast Arg 174 z grupą fosforanową koenzymu NAD⁺. Reszty aminokwasów: Asn 119, Val 123, Thr 256, Asp 282, His 311, Ser 313 i Gly 314 oddziałują z ugrupowaniem nikotynoamidowym w holoenzymie [55-57].

3.3.6.3. Mechanizm reakcji katalizowanej przez FDH

Podczas katalizy enzymatycznej z udziałem dehydrogenazy mrówczanowej następuje oderwanie anionu wodorkowego z mrówczanu i bezpośrednie przeniesienie w pozycję C-4 pierścienia nikotynoamidowego (będącego elementem dodatnio naładowanego koenzymu NAD⁺) bez udziału etapów katalizy kwasowo-zasadowej, która zachodzi w reakcjach katalizowanych przez inne pokrewne dehydrogenazy (schemat 3.10). Z tego powodu przeniesienie jonu wodorkowego ze zmianą hybrydyzacji z sp² na sp³ jest etapem determinującym szybkość reakcji utleniania mrówczanu przez dehydrogenazę mrówczanową. W centrum aktywnym enzymu atomy tlenu mrówczanu tworzą wiązania wodorowe z Arg 258 i Asn 119, umiejscawiając substrat pod odpowiednim kątem względem płaszczyzny pierścienia nikotynoamidowego koenzymu NAD⁺, tak by umożliwić transfer anionu wodorkowego.

Ważnym czynnikiem w katalizie FDH jest wzmocnienie właściwości elektrofilowych pozycji C-4 ugrupowania nikotynoamidowego koenzymu, co może być osiągnięte w wyniku polaryzacji poprzez oddziaływania z negatywnie naładowanymi ligandami.

Obszary hydrofobowe w enzymie – Pro 97-Phe 98, Ile 122, Val 150 i Ile 202 – są przesuwane względem centrum aktywnego w rezultacie zmiany konformacyjnej zachodzącej w czasie reakcji. Para aminokwasów Pro-Phe zapewnia odpowiednie warunki do związania obojętnego ditlenku węgla po etapie z udziałem naładowanego

ujemnie mrówczanu, natomiast reszty Val 150 i Ile 202 zapewniają odpowiednie warunki do związania obojętnej formy koenzymu NADH powstającego w wyniku reakcji [58,59].

Schemat 3.10. Proponowany mechanizm działania dehydrogenazy mrówczanowej [58,59]