4. BADANIA WŁASNE
4.1. Syntezy enzymatyczne
4.1.4. Syntezy L-tryptofanu i jego pochodnej znakowanej deuterem
4.1.4.1. Enzymatyczna synteza L-Trp
Otrzymana przeze mnie w punkcie 4.1.3.1 pochodna 3-F-L-Ala posłużyła w reakcji sprzęgania z indolem, katalizowanej przez enzym tryptofanazę, prowadzącej do
udziałem chloro- i bromopochodnej alaniny, natomiast reakcja z wykorzystaniem fluoropochodnej alaniny została przeprowadzona przeze mnie po raz pierwszy.
NH
Schemat 4.11. Reakcja sprzęgania 3-F-L-Ala z indolem katalizowana przez Tpase Badania wstępne i wizualizacja reagentów
Przed przystąpieniem do właściwej syntezy L-Trp wykonałam szereg badań wstępnych z udziałem związków wzorcowych, mających na celu opracowanie metody wizualizacji reagentów, monitorowania postępu reakcji oraz izolacji produktu.
Pierwszym etapem było zbadanie właściwości fizykochemicznych reagentów tj. L-Trp, 3-F-L-Ala i indolu. Indol charakteryzuje się intensywnym, charakterystycznym zapachem, natomiast pozostałe związki są bezwonne. L-Trp i 3-F-L-Ala rozpuszczają się w wodzie, amoniaku i DMSO, a indol jest dobrze rozpuszczalny w etanolu i słabo w wodzie. Do identyfikacji reagentów posłużyła mi metoda chromatografii cienkowarstwowej TLC. Płytki pokryte silikażelem rozwijałam w różnych mieszaninach rozpuszczalników, jednakże najlepszym układem okazał się acetonitryl/woda (4:1, v/v, wpółczynniki retencji: 3-F-L-Ala Rf = 0,28; L-Trp Rf = 0,46;
indol Rf = 0,84). Płytki TLC wizualizowałam poprzez spryskiwanie etanolowym roztworem ninhydryny i wygrzewanie w temperaturze 150°C, gdyż każdy z badanych związków z tym odczynnikiem, w większym lub mniejszym stopniu, daje odczyn barwny. L-Trp i 3-F-L-Ala w reakcji z ninhydryną wykazują intensywnie fioletowe plamki. Indol, który nie zawiera 1° grupy aminowej, jest słabo widoczny na płytce jednak dobrze pod lampą UV (λ=234 nm). Rejestracja widm UV-VIS analizowanych związków pozwoliła na wykluczenie tej metody kontroli postępu reakcji, gdyż 3-F-L-Ala nie wykazuje absorpcji w świetle UV, natomiast L-Trp (rysunek 4.4) i indol wykazują maksimum absorpcji przy tej samej długości fali, czyli przy λmax=280 nm.
Rysunek 4.4. Widmo UV L-tryptofanu Opracowanie warunków syntezy L-Trp
Reakcję syntezy L-Trp przeprowadziłam kilkakrotnie z użyciem różnych stężeń substratów w celu zoptymalizowania warunków jej przebiegu. Reakcja sprzęgania indolu z 3-F-L-Ala, katalizowana przez Tpase, przebiegała w 0,1% buforze amonowym o pH 8,0 w temperaturze 37°C przez 24 godziny. Enzym jest handlowo dostępny w formie apotryptofanazy, więc jego prawidłowe działanie wymagało obecności kofaktora PLP w mieszaninie reakcyjnej. Niewielki dodatek merkaptoetanolu zapobiegał rozwijaniu się grzybów i pleśni. Postęp reakcji monitorowałam za pomocą chromatografii TLC na płytkach silikażelowych rozwijanych w układzie acetonitryl/woda 4:1 (v/v) i wywoływanych 0,1% etanolowym roztworem ninhydryny.
Wydzielenie L-Trp z mieszaniny poreakcyjnej
Opracowanie warunków rozdziału
Fluoropochodna alaniny, 3-F-L-Ala, nie jest dostępna handlowo i musiała być przeze mnie syntetyzowana, dlatego też w ramach badań wstępnych sporządziłam wzorcową mieszaninę L-Trp i L-Ala (w buforze amonowym zakwaszonym do pH 4), której współczynniki retencji w chromatografii cienkowarstwowej (w układzie acetonitryl/woda 4:1, v/v) są zbliżone do mieszaniny L-Trp i 3-F-L-Ala. Rozdział mieszaniny wzorcowej przeprowadziłam na kolumnie wypełnionej silikażelem w takim samym układzie jaki stosowałam w chromatografii TLC, czyli acetonitryl/woda, 4:1
długość fali [nm]
absorbancja
wzorcowych, co świadczyło o niewłaściwym doborze warunków rozdziału. W kolejnym etapie sporządziłam wzorcową mieszaninę L-Trp i 3-F-L-Ala oraz zmodyfikowałam warunki rozdziału na kolumnie chromatograficznej. Zastosowałam eluent wzbogacony w acetonitryl (acetonitryl/woda 5:1, v/v), jednak jakość rozdziału poprawiła się jedynie nieznacznie. Dalsze badania nad rozdziałem mieszaniny wzorcowej doprowadziły mnie do wniosków, iż należy dodatkowo zastosować dłuższą kolumnę i bardzo powolny wyciek. Większość próbek zawierało czysty L-Trp, jednak konieczne było przeprowadzenie rechromatografii nierozdzielonych frakcji zawierających L-Trp i 3-F-L-Ala. Otrzymany produkt oczyściłam dodatkowo za pomocą chromatografii jonowymiennej na złożu Amberlite IR 120 [H+] w celu pozbycia się soli i innych zanieczyszczeń.
Izolacja L-Trp z mieszaniny poreakcyjnej
Po upływie 24 godzin od rozpoczęcia reakcji mieszaninę poreakcyjną zakwasiłam do pH 4 za pomocą stężonego kwasu solnego, a następnie odwirowałam enzym przy użyciu wirówki. Mieszaninę odparowałam do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem, rozpuściłam w buforze amonowym o pH 4 i naniosłam na kolumnę wypełnioną silikażelem. Produkt, czyli L-Trp, eluowałam z kolumny stosując mieszaninę rozpuszczalników acetonitryl/woda 5:1, v/v. W pierwszej kolejności elucji uległ nieprzereagowany indol. Początkowe frakcje zawierały czysty L-Trp, jednak kolejne, pomimo zastosowania długiej kolumny, powolnego wycieku i zbierania niewielkich frakcji, były zanieczyszczone nieprzereagowanym substratem 3-F-L-Ala. Z tego powodu konieczna była rechromatografia nierozdzielonych frakcji. Czyste próbki zawierające L-Trp połączyłam, zatężyłam pod zmniejszonym ciśnieniem i zliofilizowałam. Uzyskany związek był zanieczyszczony solami nieorganicznymi o czym świadczyła zbyt duża masa. Rozpuszczony w wodzie L-Trp naniosłam na kolumnę jonowymienną wypełnioną złożem Amberlite IR-120 [H+] i wymyłam 2 M roztworem amoniaku, gdyż użycie eluentu o niższym stężeniu powodowało rozmycie związku na kolumnie i wymywanie w postaci wielu frakcji. Zebrane frakcje zatężyłam i zliofilizowałam (rysunek 4.5) otrzymując czysty L-Trp z 25% wydajnością chemiczną, która nie jest zbyt wysoka ze względu na wieloetapowe oczyszczanie.
NH
Rysunek 4.5. Schemat oczyszczania L-Trp 4.1.4.2. Synteza [2-2H]-L-Trp
Badając reakcję sprzęgania katalizowaną przez enzym tryptofanazę postanowiłam sprawdzić, co jest źródłem protonu w pozycji α L-tryptofanu. Z tego powodu przeprowadziłam dwie próby. W pierwszej z nich (schemat 4.12) założyłam, że proton pochodzi z pozycji α 3-fluoro-L-alaniny, dlatego otrzymałam izotopomer 3-fluoro-[2-2H]-L-alaninę i poddałam go inkubacji z indolem, kofaktorem PLP i enzymem tryptofanazą w środowisku 0,1% buforu amonowego o pH 8,0 w temperaturze 37°C przez 24 godziny, zgodnie z rysunkiem 4.5.
NH
Schemat 4.12. Próba syntezy izotopomeru L-Trp znakowanego deuterem z udziałem 3-chromatografia kolumnowa na silikażelu
(acetonitryl/woda 5:1) zakwaszenie mieszaniny do pH 4 i
odwirowanie enzymu
jonowymienna chromatografia kolumnowa jonowymienna
rechromatografia
zatężanie, liofilizacja
W drugiej próbie (schemat 4.13) założyłam, że proton pochodzi ze środowiska reakcji, dlatego sprzęganie 3-fluoro-L-alaniny z indolem przeprowadziłam w ten sam sposób co poprzednio, ale w deuterowanym medium reakcyjnym (pD 8,4).
NH
O OH NH2
2H NH
NH2 H
O OH
F + tryptofanaza
[2-2H]-L-Trp 3-F-L-Ala
2H2O pD 8,4
Schemat 4.13. Próba syntezy izotopomeru L-Trp znakowanego deuterem w deuterowanym medium reakcyjnym
Postęp syntez kontrolowałam za pomocą chromatografii cienkowarstwowej w układzie acetonitryl/woda (4:1, v/v). Po zakończeniu danej reakcji, analogicznie jak w przypadku syntezy L-Trp (punkt 4.1.4.1), zakwasiłam mieszaninę reakcyjną do pH 4, odwirowałam enzym, a pozostałość poddałam chromatografii kolumnowej na silikażelu w układzie acetonitryl/woda 5:1 (v,v), a następnie chromatografii jonowymiennej na złożu Amberlite IR 120 [H+]. Wydajność chemiczna reakcji wynosiła odpowiednio 22%
i 29% w przypadku syntez z udziałem 3-F-[2-2H]-L-Ala i deuterowanego medium reakcyjnego. Struktury powstałych związków oraz miejsce i stopień podstawienia deuterem określiłam za pomocą spektroskopii 1H NMR (D2O, 200 MHz) (schemat 4.14). Analiza uzyskanych widm wykazała, że proton w pozycji α L-tryptofanu nie pochodzi z 3-fluoro-L-alaniny, lecz ze środowiska reakcji, gdyż w przypadku przeprowadzenia reakcji sprzęgania z indolem w środowisku buforu deuterowanego nastąpiło podstawienie deuterem w 63% (tabela 4.3).
NH
Schemat 4.14. Struktura [2-2H]-L-Trp
Pozycja
W odróżnieniu od 3-fluoro-L-alaniny, polifluorowane pochodne alaniny takie jak 3,3-di- i 3,3,3-trifluoro-L-alanina (3,3,3-tri-F-D,L-Ala) są inhibitorami enzymów PLP-zależnych, w tym tryptofanazy [137]. Jednak według niektórych źródeł indol jest w stanie przeciwdziałać dezaktywacji tryptofanazy przez di- i trifluoropochodne alaniny, gdyż będąc reaktywnym aromatycznym nukleofilem reaguje z powstałym 3,3-difluoro-α-aminoakrylanem [138].
Fakt ten skłonił mnie do podjęcia próby enzymatycznej syntezy 3,3-difluoro-L-tryptofanu (3,3-di-F-L-Trp) zgodnie ze schematem 4.15.
NH
Schemat 4.15. Próba enzymatycznej syntezy 3,3-di-fluoro-L-tryptofanu
Reakcję prowadziłam w analogiczny sposób jak w punkcie 4.1.4.1, jednak nie zaobserwowałam obecności produktu w mieszaninie poreakcyjnej. Prawdopodobnie indol nie wykazuje dostatecznie silnych właściwości ochronnych przed inhibicją
tryptofanazy lub ulega reakcji, której towarzyszy powstanie produktu innego niż pochodna tryptofanu. Mechanizm dezaktywacji Tpase obejmuje powstanie zasady Schiffa między inhibitorem a kofaktorem PLP będącym częścią holoenzymu, co skutkuje eliminacją HF z 3,3,3,-trifluoro-L-alaniny. Rezultatem tych przemian jest powstanie β-fluoro-α,β-nienasyconej iminy będącej akceptorem Michaela. Wszystko wskazuje na to, że dodatkowe atomy fluoru sprawiają, że tworzy się związek pośredni, który wiążąc się kowalencyjnie z kofaktorem PLP dezaktywuje enzym Tpase [138].
4 . 2 . W Y Z N A C Z A N I E E F E K T Ó W I Z O T O P O W Y C H D E U T E R U
4.2.1. Metodyka badań i optymalizacja warunków pomiarów kinetycznych Do badań efektów izotopowych deuteru w reakcjach enzymatycznych wykorzystałam metodę niekonkurencyjną, która pozwala na wyznaczenie SIE i KIE na Vmax i na Vmax/KM. Przebieg reakcji monitorowałam spektrofotometrycznie poprzez pomiar absorbancji dla przemiany formy utlenionej koenzymu NAD+ (λmax= 260 nm) w formę zredukowaną (λmax= 340 nm) lub odwrotnie, gdyż żaden z substratów (L-Ala, PA, LA i ich pochodne) nie wykazuje absorpcji promieniowania UV przy charakterystycznej długości fali. Ta pośrednia metoda pozwala na śledzenie zmian stężenia substratu w badanych przeze mnie reakcjach (schemat 4.16). W zależności od kierunku przemiany rejestrowałam wzrost lub spadek absorbancji przy λmax= 340 nm.
H
NH2 O
R N+
NH2 O
R N
H H
NAD+ NADH
Schemat 4.16. Konwersja formy utlenionej koenzymu NAD+ w formę zredukowaną ze zmianą maksimum absorpcji promieniowania UV
Przed przystąpieniem do właściwych eksperymentów wykonałam szereg prób, λmax=260 nm λmax=340 nm
obserwację przebiegu reakcji z udziałem różnych stężeń substratów, koenzymów, a także aktywności enzymów oraz czasu trwania i odstępów pomiędzy rejestrowanymi pomiarami, opracowałam indywidualne, optymalne warunki pomiarów kinetycznych dla każdej z reakcji badanych metodami izotopowymi. Każdy układ pomiarowy składał się z sześciu kuwet kwarcowych zawierających następujące składniki:
substrat - w każdej kuwecie inne stężenie;
koenzym- w każdej kuwecie takie samo stężenie;
bufor - w objętości dopełniającej mieszaninę do 3 ml;
enzym AlaDH lub LDH - w każdej kuwecie taka sama aktywność. W celu zainicjowania reakcji po dodaniu pozostałych składników mieszaniny reakcyjnej należało dodać enzym niemalże jednocześnie do każdej kuwety.
Na podstawie otrzymanych wartości absorbancji wyznaczyłam początkowe szybkości reakcji V0 dla sześciu różnych stężeń substratów w rozpuszczalniku protonowanym i deuterowanym, które następnie zoptymalizowałam do wykresów Lineweavera-Burka w celu obliczenia parametrów kinetycznych Vmax i KM. W pomiarach reakcji redukcyjnego aminowania PA i 3-F-PA, katalizowanych przez AlaDH i redukcji 3-F-PA z udziałem LDH, obserwowałam spadek absorbancji przy λmax = 340 nm spowodowany ubytkiem koenzymu NADH lub [(4R)-2H]-NADH. W przypadku reakcji oksydacyjnej deaminacji L-Ala, [2-2H]-L-Ala, 3-F-L-Ala i [2-2H]-L-Ala obserwowany wzrost absorbancji przy λmax = 340 nm był rezultatem spadku stężenia utlenionej formy koenzymu NAD+. Kilka początkowych pomiarów zarejestrowałam bez dodatku enzymu w celu skorygowania wartości absorbancji o wartość tła.
Odpowiednie zestawienie otrzymanych wartości parametrów kinetycznych w środowisku buforu protonowanego i deuterowanego, zarówno dla związków nieznakowanych jak i izotopomerów selektywnie podstawionych deuterem, pozwoliło na wyznaczenie rozpuszczalnikowych i kinetycznych efektów izotopowych. Syntezy potrzebnych izotopologów znakowanych deuterem opisałam w poprzednich punktach rozdziału „Badania własne” niniejszej pracy. W przypadku pomiarów kinetycznych z udziałem izotopomerów o podstawieniu izotopowym niższym niż 100% obliczenia skorygowałam zgodnie z równaniem 3.10. Niepewność pomiarową efektów izotopowych obliczyłam metodą Studenta-Fishera dla poziomu ufności α = 0,9.
4.2.1.1 Oksydacyjna deaminacja L-alaniny katalizowana przez AlaDH
Oksydacyjna deaminacja L-Ala, katalizowana przez dehydrogenazę L-alaninową w obecności koenzymu NAD+, prowadzi do powstania PA (schemat 4.17).
NH2
Schemat 4.17. Oksydacyjna deaminacja L-Ala
Kinetykę reakcji utleniania L-Ala do PA badałam rejestrując wzrost absorbancji przy λ = 340 nm związany z redukcją koenzymu NAD+ do NADH. Przebieg reakcji w środowisku protonowanego (wykres 4.1) i deuterowanego buforu węglanowego (odpowiednio pH 10,2 i pD 10,6) w temperaturze pokojowej monitorowałam za pomocą spektrofotometru UV-VIS, rejestrując absorbancję co dwie minuty przez 40 minut.
Przeprowadziłam kilka serii eksperymentów dla sześciu różnych stężeń L-Ala w zakresie 0,067 - 0,4 mM. Dla każdej serii wyznaczyłam wartości szybkości początkowych V0 i zoptymalizowałam je do wykresów Lineweavera-Burka.
Wykres 4.1. Kinetyka reakcji oksydacyjnej deaminacji L-alaniny w buforze protonowanym
Wpływ środowiska reakcji (bufor protonowany i deuterowany) na przebieg kinetyki oksydacyjnej deaminacji L-Ala przedstawiłam na wykresie w postaci krzywych Michaelisa-Menten (wykres 4.2) oraz wykresów Lineweavera-Burka (wykres 4.3).
Wykres 4.2. Krzywe Michaelisa-Menten dla deaminacji L-alaniny w buforze protonowanym i deuterowanym
Wykres 4.3. Wykres Lineweavera-Burka dla deaminacji L-alaniny w buforze protonowanym i deuterowanym
0 50 100 150 200 250
0,067 0,13 0,2 0,27 0,33 0,4
szybkość początkowa [mM/min]
stężenie substratu [mM]
L-Ala w buforze protonowanym
L-Ala w buforze deuterowanym
-0,005 0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03
-5 0 5 10 15 20 25
1/V0 [min/mM]
1/[S] [mM-1]
L-Ala w buforze protonowanym
L-Ala w buforze deuterowanym
Otrzymany przeze mnie w punkcie 4.1.2.2 izotopomer L-Ala, znakowany deuterem w pozycji C-2, wykorzystałam do badania mechanizmu działania enzymu AlaDH metodą rozpuszczalnikowych i kinetycznych efektów izotopowych. Porównanie parametrów kinetycznych Vmax i Vmax/KM dla reakcji oksydacyjnej deaminacji L-Ala w buforze protonowanym i deuterowanym, a także zestawienie parametrów wyznaczonych z udziałem [2-2H]-L-Ala, pozwoliło na obliczenie SIE. Stosując tę samą metodykę wyznaczyłam KIE na Vmax i na Vmax/KM na podstawie pomiarów kinetycznych dla reakcji z udziałem L-Ala i [2-2H]-L-Ala (schemat 4.18) w rozpuszczalniku protonowanym i deuterowanym.
NH2
2H
O OH
O OH O
+ NAD+
dehydrogenaza L-alaninowa
+ [(4R)-2H]-NADH
[2-2H]-L-Ala PA
Schemat 4.18. Oksydacyjna deaminacja izotopomeru [2-2H]-L-Ala
Dla izotopomeru L-Ala znakowanego w 75% deuterem wartości efektów izotopowych skorygowałam stosując równanie 3.10. Uzyskane wyniki przedstawiłam w tabelach 4.4 i 4.5.
Substrat Rozpuszczalnikowy efekt izotopowy SIE na Vmax SIE na Vmax/KM L-Ala 2,0 ± 0,1 2,0 ± 0,1 [2-2H]-L-Ala 1,4 ± 0,1 1,7 ± 0,2
Tabela 4.4. Rozpuszczalnikowe efekty izotopowe dla oksydacyjnej deaminacji L-Ala
Rozpuszczalnik Kinetyczny efekt izotopowy KIE na Vmax KIE na Vmax/KM 1H2O 1,2 ± 0,1 2,2 ± 0,1
2H2O 0,99 ± 0,07 2,1 ± 0,06
Tabela 4.5. Kinetyczne efekty izotopowe dla oksydacyjnej deaminacji L-Ala Uzyskane wyniki badań nad mechanizmem oksydacyjnej deaminacji L-alaniny zostały opublikowane w Journal of Chemistry and Chemical Engineering vol. 8, 145-150 (2014).
4.2.1.2. Redukcyjne aminowanie kwasu pirogronowego katalizowane przez AlaDH Kinetykę reakcji redukcji PA do L-Ala (schemat 4.5) badałam rejestrując spadek absorbancji związany z malejącym stężeniem formy zredukowanej koenzymu NADH (wykres 4.4). Przebieg reakcji monitorowałam spektrofotometrycznie dla maksimum absorpcji przy λmax = 340 nm w środowisku buforu amonowego o pH 8,8 i pD 9,2 w temperaturze pokojowej, rejestrując absorbancję co jedną minutę przez 30 minut.
Przeprowadziłam kilkanaście serii eksperymentów dla sześciu różnych stężeń PA w zakresie 0,03-0,2 mM.
Wykres 4.4.Kinetyka reakcji redukcyjnego aminowania kwasu pirogronowego w buforze protonowanym
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
0 10 20 30
absorbancja
czas [min]
0,03 mM 0,07 mM 0,1 mM 0,13 mM 0,17 mM 0,2 mM
Otrzymany przeze mnie uprzednio izotopomer [(4R)-2H]-NADH (punkt 4.1.1.3) posłużył do badania mechanizmu działania enzymu AlaDH metodą rozpuszczalnikowych i kinetycznych efektów izotopowych deuteru. Dla każdej serii wyznaczyłam wartości szybkości początkowych V0 dla sześciu różnych stężeń substratu i zoptymalizowałam je do wykresów Lineweavera-Burka.
Krzywe Michaelisa-Menten (wykres 4.5) przedstawiają przebieg redukcyjnego aminowania PA z udziałem koenzymu NADH znakowanego deuterem w środowisku protonowanego i deuterowanego buforu amonowego o stężeniu 0,75 M.
Wykres 4.5. Krzywe Michaelisa-Menten dla kwasu pirogronowego w protonowanym i deuterowanym buforze amonowym o stężeniu 0,75 M
Porównanie parametrów kinetycznych dla reakcji redukcyjnego aminowania PA z udziałem NADH i [(4R)-2H]-NADH (schemat 4.19) w buforze protonowanym i deuterowanym pozwoliło na wyznaczenie SIE i KIE na Vmax i na Vmax/KM dla deuteru.
Uzyskane wartości efektów nie wymagały skorygowania, gdyż podstawienie izotopowe [(4R)-2H]-NADH wynosiło 100%. Otrzymane wyniki przedstawiłam w tabelach 4.6 i 4.7.
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
0,03 0,07 0,1 0,13 0,17 0,2
szybkość początkowa [mMl/min]
stężenie substratu [mM]
PA w buforze protnowanym
PA w buforze deuterowanym
NH2
2H
O OH O
OH O
+ NAD+
dehydrogenaza L-alaninowa
+ [(4R)-2H]-NADH
[2-2H]-L-Ala PA
Schemat 4.19. Redukcyjne aminowanie kwasu pirogronowego z udziałem koenzymu [(4R)-2H]-NADH
Substrat Rozpuszczalnikowy efekt izotopowy SIE na Vmax SIE na Vmax/KM
PA/NADH 0,90 ± 0,2 0,90 ± 0,04 PA/[(4R)-2H]-NADH 0,87 ± 0,07 0,96 ± 0,04
Tabela 4.6. Rozpuszczalnikowe efekty izotopowe dla redukcyjnego aminowania PA z udziałem NADH i [(4R)-2H]-NADH w buforze o stężeniu 0,75 M
Rozpuszczalnik Kinetyczny efekt izotopowy KIE na Vmax KIE na Vmax/KM
1H2O 1,1 ± 0,2 0,99 ± 0,03
2H2O 1,0 ± 0,1 1,0 ± 0,05
Tabela 4.7.Kinetyczne efekty izotopowe dla redukcyjnego aminowania PA w protonowanym i deuterowanym buforze amonowym o stężeniu 0,75 M
Te same eksperymenty powtórzyłam w środowisku buforu amonowego o niższym stężeniu – 0,025 M (tabele 4.8 i 4.9), gdyż według niektórych źródeł literaturowych stężenie buforu może wpływać na wielkość efektów izotopowych.
Substrat Rozpuszczalnikowy efekt izotopowy SIE na Vmax SIE na Vmax/KM
PA/NADH 3,8 ± 0,6 3,7 ± 0,9
PA/[(4R)-2H]-NADH 1,2 ± 0,4 0,98 ± 0,3
Tabela 4.8. Rozpuszczalnikowe efekty izotopowe dla redukcyjnego aminowania PA z udziałem NADH i [(4R)-2H]-NADH w buforze amonowym o stężeniu 0,025 M
Rozpuszczalnik Kinetyczny efekt izotopowy KIE na Vmax KIE na Vmax/KM 1H2O 0,94 ± 0,2 0,91 ± 0,1
2H2O 1,0 ± 0,4 0,83 ± 0,04
Tabela 4.9.Kinetyczne efekty izotopowe w reakcji redukcyjnego aminowania PA w protonowanym i deuterowanym buforze amonowym o stężeniu 0,025M
4.2.1.3. Oksydacyjna deaminacja 3-fluoro-L-alaniny katalizowana przez AlaDH
Oksydacyjna deaminacja 3-F-L-Ala katalizowana przez dehydrogenazę L-alaninową w obecności koenzymu NAD+ prowadzi do powstania 3-F-PA zgodnie ze schematem 4.20.
NH2 H
O OH F
O OH O
+ NAD+ F
dehydrogenaza L-alaninowa
+ NADH
3-F-L-Ala 3-F-PA
pH 8,8
Schemat 4.20. Oksydacyjna deaminacja 3-F-L-Ala
Poprzez rejestrację wzrostu absorbancji przy λmax = 340 nm, związanego z redukcją koenzymu NAD+ do NADH, badałam spektrofotometrycznie kinetykę reakcji utleniania 3-F-L-Ala do 3-F-PA. Przebieg reakcji w środowisku protonowanego (pH 10,2; wykres 4.6) i deuterowanego (pD 10,6) buforu węglanowego monitorowałam za pomocą
spektrofotometru UV-VIS w temperaturze pokojowej. Absorbancję rejestrowałam co minutę, każdy pomiar trwał 40 minut, a kilka początkowych pomiarów bez enzymu posłużyło do korekty tła. Przeprowadziłam serię eksperymentów dla sześciu różnych stężeń 3-F-L-Ala w zakresie 0,4-0,9 mM i dla każdej serii wyznaczyłam szybkości początkowe V0 a następnie zoptymalizowałam je do wykresu Lineweavera-Burka.
Wykres 4.6. Kinetyka reakcji oksydacyjnej deaminacji 3-fluoro-L-alaniny w buforze protonowanym
Wpływ deuterowanego medium reakcyjnego na przebieg oksydacyjnej deaminacji 3-F-[2-2H]-L-Ala przedstawiłam na wykresie w postaci krzywych Michaelisa-Menten (wykres 4.7).
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06
0 5 10 15 20 25 30
absorbancja
czas [min]
0,4 mM 0,5 mM 0,6 mM 0,7 mM 0,8 mM 0,9 mM
Wykres 4.7. Krzywe Michaelisa-Menten dla oksydacyjnej deaminacji 3-fluoro-[2-2 H]-L-alaniny w buforze protonowanym i deuterowanym
Uzyskany przeze mnie w punkcie 4.1.3.2 izotopomer 3-F-[2-2H]-L-Ala posłużył do badania mechanizmu działania enzymu AlaDH metodą rozpuszczalnikowych i kinetycznych efektów izotopowych deuteru (schemat 4.21). Porównanie parametrów kinetycznych Vmax i Vmax/KM dla reakcji oksydacyjnej deaminacji 3-F-L-Ala i
3-F-[2-2H]-L-Ala, zachodzącej w buforze protonowanym i deuterowanym, pozwoliło na wyznaczenie efektów SIE i KIE na Vmax i na Vmax/KM.
NH2
2H
O OH F
O OH O
+ NAD+ F
dehydrogenaza L-alaninowa
+ [(4R)-2H]-NADH
3-F-[2-2H]-L-Ala 3-F-PA
Schemat 4.21. Oksydacyjna deaminacja izotopomeru 3-F-[2-2H]-L-Ala
Ze względu na 72% podstawienie deuterem izotopomeru 3-F-[2-2H]-L-Ala skorzystałam z równania 3.10 by skorygować wielkość efektów izotopowych.
Otrzymane wyniki przedstawiłam w tabelach 4.10 i 4.11.
0 5 10 15 20 25
0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
szybkość początkowa [mM/min]
stężenie substratu [mM]
3-F-[2-2H]-L-Ala w buforze protonowanym
3-F-[2-2H]-L-Ala w buforze deuterowanym
Substrat Rozpuszczalnikowy efekt izotopowy SIE na Vmax SIE na Vmax/KM
3-F-L-Ala 1,0 ± 0,2 0,87 ± 0,06 3-F-[2-2H]-L-Ala 1,5 ± 0,2 1,7 ± 0,2
Tabela 4.10. Rozpuszczalnikowe efekty izotopowe dla redukcyjnego aminowania 3-F-L-Ala i jej izotopomeru z udziałem NADH i [(4R)-2H]-NADH
Rozpuszczalnik Kinetyczny efekt izotopowy KIE na Vmax KIE na Vmax/KM
1H2O 1,2 ± 0,1 1,3 ± 0,3
2H2O 1,6 ± 0,1 2,5 ± 0,3
Tabela 4.11. Kinetyczne efekty izotopowe dla redukcyjnego aminowania 3-F-L-Ala w buforze protonowanym i deuterowanym
4.2.1.4. Redukcyjne aminowanie kwasu 3-fluoropirogronowego katalizowane przez AlaDH
Kinetykę reakcji badałam rejestrując zmiany absorbancji NADH związane z redukcją 3-F-PA do 3-F-L-Ala (schemat 4.8). Przebieg reakcji (wykres 4.8) w środowisku buforu amonowego o pH 8,8 w temperaturze pokojowej monitorowałam spektrofotometrycznie (λmax = 340 nm) rejestrując absorbancję przez 30 minut co jedną minutę. Obserwowałam spadek absorbancji w czasie świadczący o wzroście stężenia formy utlenionej koenzymu NAD+. Przeprowadziłam kilka serii eksperymentów dla sześciu różnych stężeń 3-F-PA w zakresie 0,07-0,23 mM. Dla każdej serii wyznaczyłam wartości szybkości początkowych V0 i zoptymalizowałam je do wykresów Lineweavera-Burka.
Wykres 4.8. Kinetyka reakcji redukcyjnego aminowania kwasu 3-fluoropirogronowego w buforze protonowanym
Wpływ medium reakcyjnego na przebieg badanej reakcji redukcyjnego aminowania 3-F-PA z udziałem koenzymu NADH przedstawiłam na wykresie w postaci krzywych Michaelisa-Menten (wykres 4.9).
Wykres 4.9. Krzywe Michaelisa-Menten dla redukcyjnego aminowania kwasu 3-fluoropirogronowego w środowisku buforu protonowanego i deuterowanego
0,82
Izotopomer [(4R)-2H]-NADH posłużył do badania mechanizmu działania enzymu AlaDH metodą rozpuszczalnikowych i kinetycznych efektów izotopowych deuteru. Porównanie parametrów kinetycznych dla reakcji redukcyjnego aminowania 3-F-PA z udziałem NADH i [(4R)-2H]-NADH (schemat 4.22) w buforze protonowanym i deuterowanym pozwoliło na wyznaczenie SIE i KIE deuteru na Vmax i na Vmax/KM. Otrzymane wyniki przedstawiłam w tabelach 4.12 i 4.13.
NH2
2H
O OH F
O OH O
F + NAD+
dehydrogenaza L-alaninowa + [(4R)-2H]-NADH
3-F-[2-2H]-L-Ala 3-F-PA
Schemat 4.22. Redukcyjne aminowanie kwasu 3-fluoropirogronowego z udziałem koenzymu [(4R)-2H]-NADH
Substrat Rozpuszczalnikowy efekt izotopowy SIE na Vmax SIE na Vmax/KM
3-F-PA/NADH 6,0 ± 0,9 1,5 ± 0,2
3-F-PA/[(4R)-2H]-NADH 4,4 ± 0,3 0,82 ± 0,09
Tabela 4.12. Rozpuszczalnikowe efekty izotopowe dla redukcyjnego aminowania kwasu 3-fluoropirogronowego
Rozpuszczalnik Kinetyczny efekt izotopowy KIE na Vmax KIE na Vmax/KM 1H2O 1,9 ± 0,2 1,7 ± 0,1
2H2O 1,4 ± 0,2 0,89 ± 0,1
Tabela 4.13. Kinetyczne efekty izotopowe dla redukcyjnego aminowania kwasu 3-fluoropirogronowego
Uzyskane wyniki badań nad redukcyjnym aminowaniem kwasu 3-fluoropirogronowego zostały opublikowane w Copernican Letters vol. 4, 103-109 (2013).
4.2.1.5. Redukcja kwasu 3-fluoropirogronowego katalizowana przez LDH
Kwas 3-fluoropirogronowy (3-F-PA) pod wpływem enzymu dehydrogenazy L-mleczanowej (LDH) i w obecności koenzymu NADH ulega redukcji do kwasu (R)-3-fluoromlekowego (3-F-LA). Reakcja przebiega według schematu 4.23.
F
Schemat 4.23.Enzymatyczna redukcja 3-F-PA z udziałem LDH
Kinetykę reakcji badałam co minutę przez 20 minut rejestrując zmiany absorbancji NADH związane z redukcją 3-F-PA do 3-F-LA. Przebieg reakcji w środowisku buforu fosforanowego o pH 8,0 w temperaturze pokojowej monitorowałam spektrofotometrycznie dla maksimum absorpcji przy λmax = 340 nm i obserwowałam spadek absorbancji świadczący o wzroście stężenia formy utlenionej koenzymu NAD+ (wykres 4.10). Przeprowadziłam serię eksperymentów dla sześciu różnych stężeń 3-F-PA w zakresie 0,04-0,24 mM. Dla każdej serii wyznaczyłam wartości szybkości początkowych V0 i zoptymalizowałam je do wykresów Lineweavera-Burka.
Wykres 4.10. Kinetyka redukcji 3-F-PA do 3-F-LA w buforze protonowanym 0
Zbadałam wpływ rozpuszczalnika deuterowanego na przebieg rozpatrywanej reakcji.
Poniżej na wykresie przedstawiłam krzywe Michaelisa-Menten dla redukcji 3-F-PA w buforze protonowanym oraz deuterowanym (wykres 4.11).
Wykres 4.11. Krzywe Michaelisa-Menten dla redukcji kwasu 3-fluoropirogronowego w środowisku buforu protonowanego i deuterowanego
Wyznaczyłam parametry kinetyczne równania Michaelisa-Menten - Vmax i KM w buforze protonowanym i deuterowanym, a następnie rozpuszczalnikowe efekty izotopowe deuteru dla tej reakcji (tabela 4.14).
Substrat Rozpuszczalnikowy efekt izotopowy SIE na Vmax SIE na Vmax/KM
3-F-L-Ala 1,4 ± 0,2 1,3 ± 0,1
Tabela 4.14. Rzopuszczalnikowe efekty izotopowe w redukcji kwasu 3-fluoropirogronowego
Interpretację uzyskanych wyników przedstawiłam w następnym rozdziale zatytułowanym „Podsumowanie i wnioski”.
0 50 100 150 200 250 300
0,04 0,08 0,12 0,16 0,2 0,24
szybkość początkowa [mM/min]
stężenie substratu [mM]
3-F-PA w buforze protonowanym
3-F-PA w buforze deuterowanym