Syntezy halogenopochodnych alaniny

W ciągu ostatnich lat dużym zainteresowaniem cieszą się syntezy aminokwasów podstawionych atomami fluorowców (F, I, Cl i Br), gdyż podstawniki te powodują duże zmiany we właściwościach, reaktywności i funkcjach biologicznych aminokwasów. Jest to spowodowane ich znaczną elektroujemnością oraz wielkością podstawników związaną z dużymi promieniami van der Waalsa (brom – 1.85 A, jod – 1.98 A, chlor – 1.75 A, fluor – 1.47).

W związku z tym, iż głównym przedmiotem moich eksperymentów, opisanych w niniejszej rozprawie doktorskiej, są związki zawierające podstawnik fluorowy, poniżej przedstawiłam wybrane chemiczne i enzymatyczne metody syntezy fluoropochodnych alaniny.

3.7.1. Metody syntezy fluoropochodnych alaniny

Po raz pierwszy metoda syntezy pochodnych 3-fluoro-L-Ala i 3-fluoro-[2-² H]-D-Ala odpowiednio z: L-H]-D-Ala i [2-²H]-D-Ala poprzez fluorowanie w ciekłym HF i gazowym CF₃OF pod wpływem światła została opracowana przez Kollonitsch’a i Barash’a. Według badaczy, tworzący się w ten sposób rodnik CF₃O·, jest odpowiedzialny za selektywne fluorowanie alaniny w pozycji β [87].

Z kolei Sutherland i Willis opisali syntezę czystego enancjomeru 3-F-L-Ala poprzez enzymatyczny rozdział mieszaniny racemicznej estru metylowego N-boc-3-fluoro-D,L-alaniny (schemat 3.29). Na 2,3-dibromopropionian metylu podziałano SnCl4

i BrF3, a następnie NaN3, w celu wymiany podstawnika bromowego na ugrupowanie azydkowe w warunkach katalizy przeniesienia międzyfazowego. Redukcja azydku, z jednoczesnym zabezpieczeniem przez grupę boc, pozwoliła na otrzymanie mieszaniny racemicznej estru metylowego 3-fluoroalaniny, która została następnie poddana

działaniu papainy, katalizującej jej stereoselektywną hydrolizę. Usunięcie grupy zabezpieczającej w warunkach kwasowych pozwoliło na otrzymanie optycznie czystych enancjomerów D i L 3-fluoroalaniny [88].

Br

Schemat 3.29. Chemiczna synteza N-boc-F-Ala i rozdział mieszaniny racemicznej;

boc-tertbutyloksykarbonyl, Et-etyl

Rekombinowany enzym ω-transaminaza (ω-TA), wyizolowany z bakterii Vibrio fluvialis, katalizuje reakcję przeniesienia grupy aminowej z (S)-α-metylobenzyloaminy ((S)-ω-MBA) do kwasu 3-fluoropirogronowego (schemat 3.30). Wspomniany enzym, w przeciwieństwie do α-transaminazy, umożliwia przeniesienie grupy aminowej z pozycji innej niż α cząsteczki aminokwasu lub aminy do akceptora, którym jest ketokwas.

Enzym ω-TA został pozyskany w wyniku rekombinacji DNA bakterii Escherichia coli, będącej organizmem gospodarza, poprzez wprowadzenie namnożonego za pomocą techniki PCR transgenu – fragmentu genu kodującego białko enzymatyczne z bakterii Vibrio fluvialis.

Schemat 3.30. Asymetryczna synteza 3-F-L-Ala katalizowana przez rekombinowany enzym ω-TA

Aby zahamować inhibicję enzymu ω-TA przez powstający acetofenon, synteza była

powodowało usuwanie większości acetofenonu z fazy wodnej do warstwy organicznej (izooktan), co pozwoliło na zwiększenie stopnia konwersji 3-F-PA do 3-F-L-Ala z 31%

do 96% [89].

Ohshima, Wandrey i Conrad opracowali metodę selektywnej produkcji 3-F-L-Ala w procesie ciągłym z 3-F-PA w bioreaktorze z membraną enzymatyczną.

Zastosowanie systemu multienzymatycznych reakcji z udziałem immobilizowanych enzymów AlaDH i FDH pozwoliło na syntezę 3-F-L-Ala z jednoczesną regeneracją koenzymu NADH in situ. Postęp reakcji i stężenie nieprzereagowanego substratu były monitorowane przy użyciu spektrofotometru UV-VIS i analizatora aminokwasów, a produkt został wydzielony za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (ang. high-performance liquid chromatography, HPLC) z detektorem fluorescencyjnym [90].

W wyniku reakcji sprzężonej katalizowanej przez AlaDH i LDH Gonҫalves et al. opracowali metodę jednoczesnej syntezy 3-F-D-Ala i (R)-3-F-PA (schemat 3.31).

Racemiczna 3-fluoro-D,L-Ala została poddana działaniu AlaDH, która katalizuje oksydacyjną deaminację L-enancjomeru do 3-F-PA. W kolejnym etapie powstały związek ulega enancjoselektywnej konwersji do (R)-3-F-LA przy jednoczesnym odtworzeniu koenzymu NAD⁺ [91,92].

F

Schemat 3.31. Jednoczesna synteza 3-F-D-Ala i (R)-3-F-Ala z udziałem enzymów

3.7.2. Znaczenie halogenopochodnych aminokwasów

Aminokwasy zawierające fluor nie występują w organizmach żywych, lecz są inkorporowane do komórek w taki sam sposób, jak naturalne aminokwasy ze względu na podobny promień van der Waalsa fluoru (1,47 Å) i wodoru (1,2 Å). Z powodu wysokiej elektroujemności fluoru, jego obecność powoduje nieprawidłowości w metabolizmie oraz dysfunkcję białek [93]. Poprzez nieodwracalną dezaktywację racemazy alaninowej, enzymu zaangażowanego w biosyntezę peptydoglikanu będącego głównym składnikiem ściany komórkowej bakterii, aminokwasy podstawione fluorem, w tym 3-fluoro-L-alanina oraz jej D-izomer, wykazują potencjalne właściwości antybakteryjne i mogłyby znaleźć zastosowanie jako antybiotyki [13,33,87]. Ponadto niektóre z nich, w tym 3-fluoro-L-Ala, są inhibitorami enzymów PLP- zależnych takich jak dekarboksylazy, transaminazy i racemazy [94]. W medycynie i chemii bioorganicznej fluoropochodne aminokwasów znajdują zastosowanie w kontroli ciśnienia krwi, w przeciwdziałaniu alergii i wzrostowi nowotworów oraz jako znaczniki biologiczne [95].

Zastosowanie enzymów do opracowania nowych, ekspresowych metod syntezy fluoropochodnych aminokwasów może mieć duże znaczenie w medycynie nuklearnej.

Aminokwasy znakowane izotopem ¹⁸F, który jest krótkożyciowym emiterem promieniowania β⁺ o okresie półtrwania około 110 minut, są interesującą klasą radioznaczników w neuroonkologii o dużym potencjale diagnostycznym do obrazowania guzów mózgu metodą pozytonowej tomografii emisyjnej (ang. positron emission tomography, PET). Ze względu na podwyższony metabolizm aminokwasów w komórkach nowotworowych jest to obiecujący kierunek rozwoju techniki PET.

Aminokwasy są niezbędne do syntezy białek, a tym samym wzrostu nowotworów, dlatego ich izotopologi mogą być przydatne do obrazowania guzów mózgu, jak również raka prostaty i płuc. Wzmożone zużycie, a tym samym transport aminokwasów do komórek nowotworowych w mózgu, powoduje, że wykorzystanie znaczników radioizotopowych w formie nienaturalnych aminokwasów lub ich pochodnych może poprawić czułość i specyficzność obrazowania guzów mózgu względem powszechnie używanego znacznika PET – 2-[¹⁸ F]fluoro-2-deoksy-D-glukozy (FDG). Istnieje kilka systemów transportu aminokwasów do komórek.

Jednym z nich, blisko związanym ze wzrostem i rozprzestrzenianiem się guzów nowotworowych, jest system ASC (alanina-seryna-cysteina), który odpowiada za transport alaniny, seryny i cysteiny przez błonę komórkową. Badania biodystrybucji pochodnej ¹⁸F-alaniny: 3-(1[¹⁸F]fluorometylo)-L-alaniny sugerują, że wykazuje ona właściwości dobrego znacznika PET do obrazowania wzmożonego transportu aminokwasów poprzez system ASC związany ze wzrostem nowotworów [96-100].

Halogenopochodne ketokwasów i hydroksykwasów są aktualnie badane pod kątem ich zastosowania w syntezie asymetrycznej związków o potencjalnym znaczeniu farmakologicznym. Fluorowane α-hydroksykwasy, takie jak kwas (R)-3-fluoromlekowy znajdują zastosowanie jako chiralne bloki budulcowe w asymetrycznej syntezie farmaceutyków będących β-blokerami receptorów adrenergicznych oraz inhibitorów neurotransmitera GABA (kwasu γ-aminomasłowego) [92]. Pedersen wykazał natomiast, że kwas 3-bromopirogronowy (3-Br-PA) może być wykorzystany w terapii niektórych rodzajów nowotworów, gdyż eliminuje agresywne guzy wątroby. Zdrowe tkanki pozyskują energię w formie ATP, powstałego w wyniku metabolizmu glukozy lub kwasów tłuszczowych w mitochondriach, natomiast, zgodnie z hipotezą Warburga, tkanki nowotworowe w większości pozyskują ATP poprzez metabolizowanie glukozy bezpośrednio do kwasu L-mlekowego. Mechanizm działania 3-Br-PA obejmuje przerwanie tego procesu poprzez inhibicję enzymu dehydrogenazy 3-fosforanogliceroaldehydowej. Pozwala to na zahamowanie wzrostu guzów nowotworowych przy jednoczesnej minimalizacji toksycznych efektów ubocznych [101,102].

3 . 8 . M E T O D Y S Y N T E Z Y T R Y P T O F A N U I J E G O