Wydział Chemii
Jolanta Szymańska
BADANIE BIOTRANSFORMACJI
L-ALANINY I JEJ POCHODNYCH METODAMI IZOTOPOWYMI
Praca doktorska wykonana w Pracowni Chemii Biomolekuł
Promotor:
Prof. dr hab. Marianna Kańska
Warszawa 2014
Praca doktorska została wykonana w ramach Interdyscyplinarnych Studiów Doktoranckich w zakresie Ochrony Środowiska i Zarządzania środowiskiem.
Stypendium doktoranckie było finansowane z projektu POKL.04.01.01-00-100/10
„Chemia, fizyka i biologia na potrzeby społeczeństwa XXI wieku: nowe makrokierunki studiów I, II i III stopnia” w Priorytecie IV POKL.
Projekt nr: POKL.04.01.01-00-100/10
„Chemia, fizyka i biologia na potrzeby społeczeństwa XXI wieku: nowe makrokierunki studiów I, II i III stopnia” w Priorytecie IV POKL
Składam wyrazy wdzięczności mojemu
promotorowi Pani prof. dr hab. Mariannie Kańskiej
za zaproponowanie interesującej tematyki badań, opiekę nad moją pracą, wsparcie i cenne wskazówki oraz ciepłą, serdeczną atmosferę
jaka panowała w trakcie jej wykonywania.
Składam serdeczne podziękowania Panu dr Ryszardowi Kańskiemu za pomoc i cenne rady podczas wykonywania
badań.
Serdecznie dziękuję moim koleżankom z Pracowni Chemii Biomolekuł:
dr Małgorzacie Pająk dr Katarzynie Pałce dr Elżbiecie Winnickiej
za pomoc podczas wykonywania badań, dyskusje naukowe oraz za przyjazną atmosferę jaka
panowała w laboratorium.
Składam serdeczne podziękowania moim najbliższym za wiarę we mnie i wsparcie w
chwilach zwątpienia.
WYKAZ SKRÓTÓW STOSOWANYCH W PRACY ... 1
1. WPROWADZENIE ... 2
2.CELE BADAŃ ... 8
3. PRZEGLĄD LITERATURY ... 10
3.1. Klasyfikacja enzymów ... 10
3.2. Oksydoreduktazy ... 11
3.3. Dehydrogenazy ... 11
3.3.1. Kofaktory dehydrogenaz ... 11
3.3.2. Stereospecyficzność dehydrogenaz ... 13
3.3.3. Dehydrogenazy aminokwasowe ... 14
3.3.4. Dehydrogenaza L-alaninowa ... 15
3.3.4.1. Ogólna charakterystyka enzymu AlaDH ... 15
3.3.4.2. Budowa enzymu AlaDH ... 19
3.3.4.3. Mechanizm reakcji katalizowanej przez AlaDH... 23
3.3.5. Dehydrogenaza L-mleczanowa ... 26
3.3.5.1. Ogólna charakterystyka enzymu LDH ... 26
3.3.5.2. Budowa enzymu LDH ... 27
3.3.5.3. Mechanizm reakcji katalizowanej przez LDH ... 28
3.3.6. Dehydrogenaza mrówczanowa ... 29
3.3.6.1. Ogólna charakterystyka enzymu FDH ... 29
3.3.6.2. Budowa enzymu FDH ... 31
3.3.6.3. Mechanizm reakcji katalizowanej przez FDH ... 32
3.4. Liazy ... 33
3.4.1. Kofaktory liaz ... 33
3.4.2. Tryptofanaza ... 35
3.4.2.1. Ogólna charakterystyka enzymu tryptofanazy, Tpase ... 35
3.4.2.2. Budowa enzymu Tpase ... 37
3.4.2.3. Mechanizm reakcji katalizowanej przez Tpase ... 38
3.5. Metody syntezy izotopomerów koenzymu NAD(P)H ... 40
3.6. Metody syntezy alaniny i jej izotopomerów ... 43
3.7. Syntezy halogenopochodnych alaniny ... 47
3.7.1. Metody syntezy fluoropochodnych alaniny ... 47
3.7.2. Znaczenie halogenopochodnych aminokwasów ... 50
3.8. Metody syntezy tryptofanu i jego pochodnych ... 51
3.9. Efekty izotopowe jako metoda badania mechanizmów reakcji enzymatycznych ... 54
3.9.1.2. Kinetyka reakcji enzymatycznych ... 56
3.9.1.3. Efekty izotopowe ... 59
3.9.1.4. Podział efektów izotopowych ...- 61 -
3.9.1.5. Kinetyczny efekt izotopowy ...- 63 -
3.9.1.6. Rozpuszczalnikowy efekt izotopowy ...- 64 -
3.9.1.7. Metody pomiarowe kinetycznych efektów izotopowych ...- 65 -
4. BADANIA WŁASNE ... 68
4.1. Syntezy enzymatyczne... 70
4.1.1. Synteza izotopomeru [(4R)-2H]-NADH ... 70
4.1.1.1. Badania wstępne i śledzenie postępu reakcji ... 70
4.1.1.2. Opracowanie warunków enzymatycznej syntezy izotopomeru [(4R)-2H]-NADH ... 72
4.1.1.3 Synteza izotopomeru [(4R)-2H]-NADH z użyciem enzymu FDH ... 75
4.1.2. Synteza L-alaniny i jej pochodnej znakowanej deuterem... 77
4.1.2.1. Enzymatyczna synteza L-Ala ... 77
4.1.2.2. Enzymatyczna synteza izotopomeru [2-2H]-L-Ala ... 80
4.1.3. Syntezy halogenopochodnych alaniny ... 82
4.1.3.1. Enzymatyczna synteza 3-F-L-Ala ... 82
4.1.3.2. Enzymatyczna synteza izotopomeru 3-F-[2-2H]-L-Ala ... 84
4.1.3.3. Próba otrzymania 3-Br-L-Ala ... 84
4.1.4. Syntezy L-tryptofanu i jego pochodnej znakowanej deuterem ... 85
4.1.4.1. Enzymatyczna synteza L-Trp ... 85
4.1.4.2. Synteza [2-2H]-L-Trp ... 89
4.1.4.3. Próba syntezy 3,3-di-F-L-Trp ... 91
4.2. Wyznaczanie efektów izotopowych deuteru ... 92
4.2.1. Metodyka badań i optymalizacja warunków pomiarów kinetycznych ... 92
4.2.1.1 Oksydacyjna deaminacja L-alaniny katalizowana przez AlaDH ... 94
4.2.1.2. Redukcyjne aminowanie kwasu pirogronowego katalizowane przez AlaDH... 97
4.2.1.3. Oksydacyjna deaminacja 3-fluoro-L-alaniny katalizowana przez AlaDH ... 100
4.2.1.4. Redukcyjne aminowanie kwasu 3-fluoropirogronowego katalizowane przez AlaDH ... 103
4.2.1.5. Redukcja kwasu 3-fluoropirogronowego katalizowana przez LDH ... 106
5. PODSUMOWANIE I WNIOSKI ... 108
6. CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA ... 117
6.1. Wykaz stosowanych odczynników i aparatury ...117
6.2. Syntezy enzymatyczne...119
6.2.1. Enzymatyczna synteza koenzymu [(4R)-2H]-NADH z użyciem FDH ... 119
6.2.2. Enzymatyczna synteza L-alaniny i jej pochodnych ... 120
6.2.2.1. Synteza L-alaniny ... 120
6.2.2.2 Synteza [2-2H]-L-alaniny ... 120
6.2.2.3 Synteza 3-fluoro-L-alaniny ... 121
6.2.2.4 Synteza 3-fluoro-[2-2H]-L-alaniny ... 122
6.2.1. Synteza L-tryptofanu i jego pochodnych ... 122
6.2.3.1. Synteza L-tryptofanu ... 122
6.2.3.2 Synteza [2-2H]-L-tryptofanu ... 123
6.3.1. Badanie kinetyki reakcji katalizowanych przez AlaDH ... 124 6.3.1.1. Badanie kinetyki oksydacyjnej deaminacji L-alaniny, L-Ala, w buforze
protonowanym ... 124 6.3.1.2. Badanie kinetyki oksydacyjnej deaminacji L-alaniny, L-Ala, w buforze
deuterowanym ... 125 6.3.1.3. Badanie kinetyki redukcyjnego aminowania kwasu pirogronowego, PA, w buforze protonowanym o stężeniu 0,75 M ... 125 6.3.1.4. Badanie kinetyki redukcyjnego aminowania kwasu pirogronowego, PA, w buforze deuterowanym o stężeniu 0,75 M ... 126 6.3.1.5. Badanie kinetyki reakcji redukcyjnego aminowania kwasu pirogronowego, PA, w buforze protonowanym o stężeniu 0,025 M ... 127 6.3.1.6. Badanie kinetyki redukcyjnego aminowania kwasu pirogronowego, PA, w buforze deuterowanym o stężeniu 0,025 M ... 127 6.3.1.7 Badanie kinetyki oksydacyjnej deaminacji 3-fluoro-L-alaniny, 3-F-L-Ala, w buforze protonowanym ... 127 6.3.1.8 Badanie kinetyki oksydacyjnej deaminacji 3-fluoro-L-alaniny, 3-F-L-Ala,
w buforze deuterowanym ... 128 6.3.1.9 Badanie kinetyki redukcyjnego aminowania kwasu 3-fluoropirogronowego, 3-F- PA, w buforze protonowanym ... 129 6.3.1.10 Badanie kinetyki redukcyjnego aminowania kwasu 3-fluoropirogronowego, 3- F-PA, w buforze deuterowanym ... 129 6.3.2. Badanie kinetyki reakcji katalizowanej przez LDH ... 130
6.3.2.1. Badanie kinetyki redukcji kwasu 3-fluoropirogronowego, 3-F-PA, w buforze protonowanym ... 130 6.3.2.2. Badanie kinetyki redukcji 3-fluoropirogronowego, 3-F-PA, w buforze
deuterowanym ... 131
7. BIBLIOGRAFIA ... 132 8. DOROBEK NAUKOWY ... 144
WYKAZ SKRÓTÓW STOSOWANYCH W PRACY
Ǻ Angstrem, 10-10 m
A2pm kwas mezo-diaminopimelinowy AA D-alanylo-D-alanina
ACS system transportu Ala-Cys- Ser ADH dehydrogenaza alkoholowa AlaDH dehydrogenaza L-alaninowa AlaR racemaza alaninowa AldDH dehydrogenaza aldehydowa AMP adenozyno-5’-monofosforan ATP adenozyno-5’-trifosforan BCG Bacillus Calmette-Guérin boc grupa tert-butoksykarbonylowa
D deuter
Da Dalton
D-AAO oksydaza D-aminokwasowa D-Ala D-alanina
DMSO dimetylosulfotlenek Ea energia aktywacji
EC Enzyme Commission – komisja enzymatyczna
FDG 2-[18F]fluoro-2-deoksy-D-glukoza FDH dehydrogenaza mrówczanowa FMN mononukleotyd flawinowy GABA kwas γ-aminomasłowy GPT transferaza glutaminowo-
pirogronianowa h stała Planca
HPLC wysokosprawna chromatografia cieczowa
k stała szybkości reakcji z udziałem lżejszego izotopu
k* stała szybkości reakcji z udziałem cięższego izotopu
Kd stała dysocjacji
KIE kinetyczny efekt izotopowy KM stała Michaelisa-Menten LA kwas L-mlekowy L-Ala L-alanina
LDH dehydrogenaza L- mleczanowa L-Trp L-tryptofan
M jednostka stężenia [mol/dm3] m/z stosunek masy do ładunku MBA metylobenzyloamina
MHz jednostka częstotliwości, mega (106) herc
MS spektroskopia mas NAD(P)+ utleniony dinukleotyd
nikotynoamidoadeninowy lub jego fosforan
NAD(P)H zredukowany dinukleotyd
nikotynoamidoadeninowy lub jego fosforan
NAG N-acetyloglukozoamina NaHMDS heksametylodisilazydek sodu NAM kwas N-acetylomuraminowy
magnetyczny rezonans jądrowy
p stopień podstawienia izotopowego PA kwas pirogronowy
PCR reakcja łańcuchowa polimerazy pD ujemny logarytm ze stężenia
deuteronów
PET pozytonowa tomografia emisyjna Ph grupa fenylowa
pH ujemny logarytm ze stężenia protonów
PLP, PMP, PNP
5’-fosforan pirydoksalu, pirydoksaminy, pirydoksyny ppm parts per milion, 10-6 Rf współczynnik retencji SIE rozpuszczalnikowy efekt
izotopowy TA transaminaza
TLC chromatografia cienkowarstwowa TMS tetrametylosilan
TOF ES(-) analizator czasu przelotu, elektrorozpylanie przy jonizacji ujemnej
Tpase tryptofanaza
TRIS tri-(hydroksymetylo)- metyloamina
TTN, kcat stała katalityczna
U unit, jednostka aktywności enzymatycznej
UV-VIS promieniowanie ultrafioletowe i widzialne
Vmax szybkość maksymalna
α efekt izotopowy dla 100% stopnia podstawienia
αp zmierzona wartość efektu izotopowego
β+ promieniowanie pozytonowe δ przesunięcie chemiczne λ długość fali
ν częstotliwość fali υ szybkość reakcji
1. WPROWADZENIE
„Uczony jest w swojej pracowni nie tylko technikiem, lecz również dzieckiem wpatrzonym w zjawiska przyrody,
wzruszające jak czarodziejska baśń”
Maria Skłodowska-Curie
Organizmy żywe są zdolne do przeprowadzania wielu skomplikowanych procesów metabolicznych w temperaturze fizjologicznej, za co odpowiedzialne są enzymy – wydajne biokatalizatory, przyspieszające reakcje chemiczne w znacznie wyższym stopniu niż jakiekolwiek poznane dotąd katalizatory chemiczne. Reakcje biotransformacji to przemiany chemiczne zachodzące w obecności enzymów w postaci wolnej lub związanej – z użyciem całych komórek. Nazwa „enzym” została po raz pierwszy użyta w 1898 roku przez niemieckiego badacza Wilhelma Kühne, jednak istnienie enzymów było znane już w XVIII wieku, kiedy to włoski uczony Spallanzani zaobserwował i opisał trawienie mięsa pod wpływem soku żołądkowego sępa. 50 lat później udało się wyizolować ze słodu enzym, znany dzisiaj jako amylaza, natomiast w roku 1834 Theodor Schwann wyodrębnił pierwszy biokatalizator pochodzenia zwierzęcego – pepsynę [1]. W roku 1907 Eduard Buchner otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii za swoje badania nad zdolnością ekstraktów z drożdży do fermentacji cukrów i udowodnienie, że jest ona możliwa bez obecności żywych komórek [2]. Kolejnym krokiem milowym było wyizolowanie i otrzymanie w postaci krystalicznej czysto białkowego enzymu – ureazy, co pozwoliło w późniejszych latach na badanie struktur enzymów metodami rentgenografii strukturalnej [3]. Pierwszym enzymem, którego strukturę opisano i przedstawiono w postaci trójwymiarowej, był lizozym, co dało początek rozwojowi biologii strukturalnej [4]. Dotychczas poznano ponad trzy tysiące biokatalizatorów, jednak liczba ta wzrasta w szybkim tempie.
Enzymy tworzą trójwymiarowe struktury, z centrum aktywnym jako specyficznym
i kofaktora (takiego jak cząsteczka organiczna, bądź jon metalu), którego obecność jest konieczna do prawidłowego przebiegu katalizy enzymatycznej.
W ostatnich latach znacząco wzrosła rola i zastosowanie enzymów w syntezie organicznej oraz ich znaczenie w kontekście tzw. „zielonej chemii”. Enzymy charakteryzują się dużą specyficznością względem katalizowanej reakcji i preferowanych substratów. Przekształcają tylko określone rodzaje grup funkcyjnych w ściśle określonym miejscu w cząsteczce, wykazują chemoselektywność, regioselektywność i enancjoselektywność [5]. Procesy biokatalityczne umożliwiają syntezę pojedynczych enancjomerów, co ma niebagatelne znaczenie w farmakologii, gdyż izomery leków mogą się znacząco od siebie różnić pod względem właściwości farmakokinetycznych, farmakodynamicznych, skuteczności oraz działań niepożądanych dla organizmu człowieka [6]. Reakcje enzymatyczne charakteryzują się wysoką wydajnością, gdyż enzymy nie katalizują reakcji ubocznych. Ponadto zwykle działają w łagodnych warunkach temperaturowych (20-40°C) i w środowisku wodnym, a odpady powstające wskutek reakcji, w których uczestniczą, są mało szkodliwe dla środowiska.
Wadą stosowania enzymów jest jednak ich wysoki koszt oraz trudności w izolacji, a także nietrwałość i wrażliwość na czynniki środowiskowe, które przy niezachowaniu optymalnych warunków mogą powodować denaturację. Ważne jest również stosowanie wysokiej czystości odczynników, gdyż nawet niewielkie zanieczyszczenia mogą powodować inhibicję enzymów.
W miarę rosnącego postępu w dziedzinie enzymologii można zauważyć, iż enzymy stają się coraz bardziej uniwersalnymi biokatalizatorami i ich wykorzystanie nie ogranicza się do umiarkowanych warunków środowiskowych, charakterystycznych dla organizmów mezofilnych. Pozyskiwanie znacznie bardziej stabilnych enzymów z mikroorganizmów ekstremofilnych, rozwijających się w warunkach ekstremalnych temperatur, pH czy też zasolenia, pozwala na ich szersze zastosowanie w wielu gałęziach nauki i przemysłu. Przykładem może być termostabilna polimeraza DNA, która jest używana do powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych, co ma kluczowe znaczenie w badaniach nad genomem, klonowaniem, diagnostyce klinicznej i kryminalistyce. Ponadto niektóre enzymy katalizują reakcje w bezwodnych rozpuszczalnikach organicznych, co umożliwia ich wykorzystanie w syntezie organicznej, gdyż wiele związków nie rozpuszcza się w wodzie. Należy jednak
pamiętać, że suche, liofilizowane enzymy muszą zawierać pewną ilość wody, aby nie uległy denaturacji i zachowały konformację natywną odpowiedzialną za ich aktywność.
Niewątpliwą zaletą syntez w warunkach bezwodnych jest fakt, iż enzymy w takim środowisku nie ulegają rozpuszczeniu, dzięki czemu można je łatwo usunąć po reakcji i użyć ponownie [5].
Preparaty enzymatyczne znajdują zastosowanie w wielu gałęziach przemysłu, takich jak: spożywczy, farmaceutyczny, tekstylny czy papierniczy. Często stosuje się specjalne szczepy mutantów mikroorganizmów, które charakteryzują się nadprodukcją określonych enzymów, co zwiększa efektywność procesów technologicznych. Coraz częściej spotykanym rozwiązaniem, szczególnie w biotechnologii, jest immobilizacja enzymów na nośniku stałym poprzez mikrokapsułkowanie czy zamykanie w matrycy polimerowej w formie żelu. Unieruchomienie enzymów zwiększa ich odporność na warunki środowiskowe, takie jak skrajne pH i ekstremalna temperatura, a także pozwala na ich wielokrotne wykorzystanie, łatwe wydzielenie produktów reakcji oraz prowadzenie procesów ciągłych [7]. Wysoka selektywność enzymów sprawia, że możliwe są reakcje multienzymatyczne, gdzie w jednym naczyniu reakcyjnym znajduje się wiele rodzajów enzymów, stanowiących zespół biokatalizatorów katalizujących kolejne reakcje zachodzące w obrębie tej samej przemiany.
Odkąd Robert Koch, będący pionierem w zakresie mikrobiologii medycznej, ogłosił swą teorię dotyczącą rozwoju chorób bakteryjnych, za którą otrzymał w 1905 roku Nagrodę Nobla, trwają intensywne badania nad patogenezą chorób zakaźnych wywoływanych przez rozmaite mikroorganizmy [8]. Ogromnym przełomem w leczeniu chorób bakteryjnych było odkrycie w 1928 roku przez Alexandra Fleminga pierwszego antybiotyku – penicyliny [9]. Fakt ten zapoczątkował lawinę odkryć nowych antybiotyków, zarówno naturalnych, jak i syntetycznych, które stały się orężem człowieka w walce z chorobami wcześniej nieuleczalnymi, powodującymi śmierć i choroby milionów ludzi. Niestety warto przy tym zauważyć, iż wiele antybiotyków pochodzenia naturalnego nie znajduje zastosowania w lecznictwie ze względu na zbyt wysoką toksyczność, w związku z czym za wskazane należy uznać intensywne badania nad opracowaniem ich syntetycznych pochodnych. Rozwój w tej dziedzinie będzie mógł się dokonywać m.in. dzięki pełniejszemu poznaniu mechanizmów procesów (tj. dotyczących metabolizmu białek, asymilacji azotu,
sporulacji, germinacji, syntezy ściany komórkowej) zachodzących w komórkach bakterii. Należy bowiem podkreślić, iż tylko tego typu działania mogą umożliwić świadome projektowanie nowych leków, których efekty nie będą – jak miało to miejsce wielokrotnie w przeszłości – dziełem przypadku.
Działanie antybiotyków polega na powodowaniu śmierci komórki bakteryjnej (działanie bakteriobójcze) lub wpływaniu na jej metabolizm poprzez hamowanie namnażania się (działanie bakteriostatyczne). Antybiotyki funkcjonują według różnych mechanizmów, jedne wpływają negatywnie na biosyntezę kwasów nukleinowych lub białek, inne zaś zakłócają syntezę bakteryjnej ściany komórkowej (jak ma to miejsce w przypadku np. penicyliny). Mechanizm działania penicyliny jako antybiotyku polega na blokowaniu aktywności enzymów bakteryjnych poprzez ich strukturalne podobieństwo do naturalnego substratu i wskutek tego zahamowaniu syntezy peptydoglikanu [10]. Mając na uwadze, iż produktem redukcyjnego aminowania kwasu pirogronowego (PA) z udziałem bakteryjnej dehydrogenazy L-alaninowej (ang.
L-alanine dehydrogenase, AlaDH, EC 1.4.1.1) jest L-alanina (L-Ala) - ważny składnik i prekursor peptydoglikanu, istnieje przypuszczenie, że enzym ten bierze udział w procesie biosyntezy ściany komórkowej. Ponadto AlaDH uczestniczy w katabolizmie L-alaniny (rysunek 1.1.) oraz zapewnia energię niezbędną w sporulacji, czyli procesie tworzenia form przetrwalnikowych bakterii z rodzaju Bacillus.
Rysunek 1.1. Biotransformacje L-alaniny i kwasu pirogronowego[11]
L-alanina
pirogronian
dehydrogenaza L-alaninowa EC 2.6.1.2
EC 5.1.1.1
EC 1.4.1.1
racemaza alaninowa
D-alanina aminotransferaza
alaninowa
dehydrogenaza L-mleczanowa EC 1.1.1.27
kwas L-mlekowy
pirogronian
dehydrogenaza D-aminokwasowa EC 1.4.5.1
pirogronian
Niedawne odkrycie obecności enzymu AlaDH w chorobotwórczym szczepie bakterii Mycobacterium tuberculosis jest dodatkowym bodźcem do badania mechanizmu działania tego enzymu, gdyż może on stanowić potencjalny cel terapeutyczny w leczeniu gruźlicy – dawniej powszechnej i często śmiertelnej choroby zakaźnej, której nawrót obserwuje się nawet w krajach wysokorozwiniętych [12].
Według niektórych źródeł 3-fluoro-L-alanina (3-F-L-Ala), będąca nienaturalnym aminokwasem i produktem enzymatycznej syntezy z udziałem AlaDH, ma potencjalne znaczenie antybakteryjne i przeciwwirusowe [13]. Podłożem tego działania może być fakt, iż związek ten, zamiast L-alaniny, wbudowuje się do żywych komórek mikroorganizmów, powodując nieprawidłowości w metabolizmie oraz jest inhibitorem niektórych enzymów, takich jak racemaza alaninowa (ang. alanine racemase, AlaR, EC 5.1.1.1) uczestnicząca w biosyntezie ściany komórkowej bakterii. Pomimo wielu badań pewne szczegóły mechanizmu reakcji katalizowanej przez AlaDH nie zostały do końca poznane i wyjaśnione. Gruntowne zrozumienie sposobu działania AlaDH mogłoby przyczynić się do pełniejszego poznania procesów metabolicznych zachodzących u bakterii oraz opracowania nowych farmaceutyków przeciwbakteryjnych.
W ramach mojej pracy doktorskiej podjęłam się próby zbadania mechanizmu biotransformacji L-alaniny katalizowanej przez dehydrogenazę L-alaninową. Do badania reakcji oksydacyjnej deaminacji L-alaniny i 3-fluoro-L-alaniny oraz redukcyjnego aminowania kwasu pirogronowego i 3-fluoropirogronowego (3-F-PA) zastosowałam metodę rozpuszczalnikowych (ang. SIE, solvent isotope effect) i kinetycznych efektów izotopowych (ang. KIE, kinetic isotope effect). Ponadto na podstawie wyznaczonego SIE dla redukcji kwasu 3-fluoropirogronowego do (R)-3-fluoromlekowego (3-F-LA) katalizowanej przez dehydrogenazę L-mleczanową (ang. L-lactate dehydrogenase, LDH, EC 1.1.1.27) wyjaśniłam pewne detale dotyczące mechanizmu działania tego biokatalizatora.
Wspomniane metody izotopowe nie są powszechnie stosowane, ale dostarczają wielu użytecznych informacji na temat mechanizmów skomplikowanych procesów katalizowanych przez enzymy. Metoda ta opiera się na badaniu kinetyki reakcji enzymatycznych z udziałem lżejszych i cięższych izotopów tego samego pierwiastka;
w przypadku niniejszej pracy są to izotopy wodoru – prot i deuter. Znakowanie związków w specyficznych pozycjach i wyznaczanie efektów izotopowych w reakcjach z ich udziałem pozwala na określenie etapu determinującego szybkość reakcji, poznanie struktury kompleksu aktywnego oraz wykrycie różnych nietypowych efektów np. tunelowania protonu.
Wyznaczanie efektów izotopowych w badanych przeze mnie biotransformacjach wymaga zaplanowania i wykonania syntez izotopomerów L-alaniny, 3-fluoro-L-alaniny oraz koenzymu NADH specyficznie znakowanych deuterem, dlatego etapem wyjściowym dla prowadzonych przeze mnie badań mechanistycznych było opracowanie metod enzymatycznej syntezy znakowanych substratów.
Uzyskana pochodna – 3-fluoro-L-alanina posłużyła ponadto do enzymatycznej syntezy L-tryptofanu (L-Trp) w wyniku reakcji sprzęgania z indolem katalizowanej przez tryptofanazę (ang. tryptophanase, Tpase, EC 4.1.99.1) – enzym z klasy liaz – katalizujący rzadką w przyrodzie reakcję tworzenia wiązania pomiędzy aromatycznym i alifatycznym atomem węgla.
2.CELE BADAŃ
Celem prowadzonych przeze mnie eksperymentów było zbadanie mechanizmu odwracalnej biotransformacji L-alaniny i jej fluoropochodnej katalizowanych przez enzym – dehydrogenazę L-alaninową – z wykorzystaniem rozpuszczalnikowych, SIE i kinetycznych efektów izotopowych, KIE. Ponadto wyznaczenie SIE dla reakcji redukcji kwasu 3-fluoropirogronowego, 3-F-PA, do kwasu (R)-3-fluoromlekowego, 3-F-LA, pozwoliło na otrzymanie pewnych informacji na temat detali mechanizmu działania dehydrogenazy L-mleczanowej. Stosowane przeze mnie metody izotopowe wymagały zsyntetyzowania odpowiednich, selektywnie znakowanych deuterem izotopomerów L-Ala, 3-F-L-Ala i koenzymu NADH. Otrzymana przeze mnie fluoropochodna L-Ala posłużyła do opracowania nowej, nie opisanej dotychczas w literaturze, metody syntezy L-tryptofanu zachodzącej w wyniku reakcji sprzęgania 3-F-L-Ala z indolem, katalizowanej przez enzym – tryptofanazę.
W związku z założeniami do zadań mojej pracy doktorskiej należało:
1. Opracowanie i optymalizacja warunków syntezy oraz metod identyfikacji i izolacji izotopomerów:
L-alaniny znakowanej deuterem w pozycji C-2;
3-fluoro-L-alaniny znakowanej deuterem w pozycji C-2;
koenzymu NADH znakowanego deuterem w pozycji 4R pierścienia nikotynoamidowego;
L-tryptofanu znakowanego deuterem w pozycji C-2.
2. Opracowanie optymalnych warunków pomiarów kinetycznych oraz wyznaczenie efektów izotopowych w reakcjach biotransformacji L-Ala i 3-F-L-Ala oraz redukcji 3-F-PA do 3-F-LA:
a) wyznaczenie kinetycznych efektów izotopowych w reakcjach katalizowanych przez enzym AlaDH, tj.
oksydacyjnej deaminacji L-Ala w środowisku buforów protonowanego i deuterowanego;
oksydacyjnej deaminacji 3-F-L-Ala w środowisku buforów protonowanego i deuterowanego;
redukcyjnego aminowania PA z udziałem koenzymów NADH i [(4R)-2H]- NADH w środowisku buforów protonowanego i deuterowanego;
redukcyjnego aminowania 3-F-PA z udziałem koenzymów NADH i [(4R)-2H]- NADH w środowisku buforów protonowanego i deuterowanego.
b) wyznaczenie rozpuszczalnikowych efektów izotopowych w reakcjach katalizowanych przez enzym AlaDH, tj.
oksydacyjnej deaminacji L-Ala i [2-2H]-L-Ala;
oksydacyjnej deaminacji 3-F-L-Ala i 3-F-[2-2H]-L-Ala;
redukcyjnego aminowania PA z udziałem koenzymów NADH i [(4R)-2H]- NADH;
redukcyjnego aminowania 3-F-PA z udziałem koenzymów NADH i [(4R)-2H]- NADH.
oraz katalizowanej przez enzym LDH:
redukcji 3-F-PA do 3-F-LA.
3. Interpretacja uzyskanych wyników.
3. PRZEGLĄD LITERATURY
3 . 1 . K L A S Y F I K A C J A E N Z Y M Ó W
Według zasad klasyfikacji, opracowanych przez Międzynarodową Unię Biochemii i Biologii Molekularnej, enzymy zostały podzielone na sześć klas ze względu na typ katalizowanej reakcji. Każdemu enzymowi został przypisany:
czteroczęściowy kod enzymatyczny EC (ang. Enzyme Commission) i odpowiednia nomenklatura nazewnictwa wskazująca na rodzaj biotransformacji. Zgodnie z powyższym wyszczególniono sześć grup: EC 1 − oksydoreduktazy, EC 2 − transferazy, EC 3 − hydrolazy, EC 4 − liazy, EC 5 − izomerazy, EC 6 − ligazy. Poniżej przedstawiłam klasyfikację enzymów, używanych przeze mnie w przeprowadzonych eksperymentach (tabela 3.1) [14]:
EC 1 OKSYDOREDUKTAZY
EC 1.1 działają na grupę
hydroksylową
EC 1.1.1 EC 1.2.1 EC 1.4.1 funkcję kofaktora pełni
NAD+ lub NADP+
EC 1.1.1.1 dehydrogenaza
alkoholowa EC 1.1.1.27 dehydrogenaza L-mleczanowa EC 1.2
działają na grupę aldehydową lub ketonową
EC 1.2.1.2 dehydrogenaza
mrówczanowa EC 1.4
działają na grupę aminową
EC 1.4.1.1 dehydrogenaza
L-alaninowa
EC 4 LIAZY EC 4.1
liazy węgiel-węgiel; tworzą lub rozrywają wiązanie C-C
EC 4.1.99 inne
EC 4.1.99.1 tryptofanaza
Tabela 3.1. Klasyfikacja wybranych enzymów
3 . 2 . O K S Y D O R E D U K T A Z Y
Oksydoreduktazy to enzymy należące do klasy 1, katalizujące reakcje utleniania i redukcji, czyli przemiany z udziałem protonów, elektronów i tlenu. Klasa ta obejmuje następujące enzymy: dehydrogenazy, reduktazy, oksydazy, oksygenazy, hydroksylazy i peroksydazy. Oksydoreduktazy odszczepiają elektrony i protony, a następnie przenoszą je między substratem i koenzymem, który jest niezbędny do prawidłowej aktywności enzymatycznej [7].
Głównym przedmiotem badań prezentowanych w niniejszej rozprawie doktorskiej są reakcje z udziałem dehydrogenaz i liaz, dlatego też dalsze rozdziały poświęciłam na przedstawienie najważniejszych właściwości i struktur wybranych enzymów.
3 . 3 . D E H Y D R O G E N A Z Y
Dehydrogenazy to ogólna nazwa enzymów katalizujących, zwykle w sposób odwracalny, odszczepienie atomów wodoru z rozmaitych substratów takich, jak aminokwasy, aldehydy, 1° i 2° alkohole, 2- i 3-hydroksykwasy, cukry i inne. Enzymy te utleniają substrat poprzez odszczepienie anionu wodorkowego (H-), który jest następnie przenoszony na cząsteczkę koenzymu NAD(P)+, który ulega redukcji do NAD(P)H [7].
3.3.1. Kofaktory dehydrogenaz
Większość enzymów z podklasy dehydrogenaz katalizuje reakcje z udziałem koenzymów nikotynoamidowych − dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NAD+) lub jego fosforanu (NADP+), które pełnią rolę przenośników elektronów i protonów z substratu na koenzym lub odwrotnie. Biorą one udział m.in. w syntezie i degradacji węglowodanów, kwasów tłuszczowych i aminokwasów. Formy utlenione koenzymów pełnią funkcję akceptorów protonów i elektronów pochodzących od innych cząsteczek, ulegając w ten sposób redukcji. Jeden atom wodoru wraz z dwoma elektronami jest przenoszony z substratu na koenzym, natomiast drugi pozostaje w środowisku reakcji jako proton (schemat 3.1).
H
NH2 O
R N+
NH2 O
R N H H
+ H+ + 2H+ + 2e-
- 2H+ - 2e-
Schemat 3.1. Redukcja kofaktora NAD+
Koenzym NAD+ jest dinukleotydem składającym się 5’-monofosforanu adenozyny (AMP) i nukleotydu nikotynoamidowego. Cząsteczka koenzymu NADP+ różni się od NAD+ obecnością grupy fosforanowej przy C-2’-rybozy w nukleotydzie adeninowym (schemat 3.2) [15].
O N
OH OH
N N
N N
NH2
O
OH O O
P O O
O P O
O O
NH2 H O
H
P O O pro-R pro-S
Schemat 3.2. Budowa koenzymu NAD(P)H
NAD+ i NADP+ są koenzymatycznymi formami witaminy PP (niacyny, czynnika przeciwpelagrycznego), tj. kwasu nikotynowego i jego amidu. Wolny kwas nikotynowy ulega przemianie w amid, który następnie jest przekształcany w koenzym NAD+ na dwa sposoby − poprzez rybonukleotyd nikotynoamidowy lub kwas nikotynowy. Witamina PP, w przeciwieństwie do innych witamin, może być syntetyzowana również in vivo z L-tryptofanu.
Reakcje, zachodzące z udziałem wspomnianych koenzymów, można w łatwy sposób monitorować spektrofotometrycznie, gdyż zmiana układu wiązań w pierścieniu
nukleotyd nikotynoamidowy
nukleotyd adeninowy (AMP)
nikotynoamidowym skutkuje pojawieniem się maksimum absorpcji promieniowania UV przy innej długości fali, charakterystycznej dla każdej z form:
forma utleniona NAD(P)+ – λmax= 260 nm;
forma zredukowana NAD(P)H – λmax= 340 nm.
W wyniku redukcji koenzymu NAD(P)+ powstaje nowe centrum stereogeniczne w pierścieniu nikotynoamidowym, co jest przyczyną nierównocenności atomów wodoru w pozycji C-4 (atomy wodoru pro-S i pro-R) [16].
3.3.2. Stereospecyficzność dehydrogenaz
W zależności od rodzaju enzymu, podczas katalizy enzymatycznej z udziałem dehydrogenaz, następuje stereospecyficzne przeniesienie anionu wodorkowego H– z substratu w pozycję pro-R lub pro-S atomu węgla C-4 pierścienia nikotynoamidowego.
Jest to spowodowane zdolnością dehydrogenaz do rozróżniania diastereotopowych atomów wodoru koenzymu NADH. Na tej podstawie wprowadzono podział dehydrogenaz na dwie grupy:
pro-R stereospecyficzne – w których przeniesienie wodoru zachodzi w pozycję pro-R płaszczyzny pierścienia nikotynoamidowego,
pro-S stereospecyficzne – w których przeniesienie wodoru zachodzi w pozycję pro-S płaszczyzny pierścienia nikotynoamidowego (schemat 3.3).
N
H
2H
CONH2
N
2H H
CONH2
pro-R pro-S
Schemat 3.3. Pozycja deuteru względem płaszczyzny pierścienia amidu kwasu nikotynowego w NADH [16]
Stereospecyficzność dehydrogenaz wynika z ich położenia względem koenzymu. W dehydrogenazach pro-R stereospecyficznych konformacja przy wiązaniu glikozydowym między amidem kwasu nikotynowego a rybozą jest anti, co oznacza, że jeden atom wodoru, połączony z atomem węgla C-4 nikotynoamidu, jest zwrócony w kierunku
białka, drugi zaś w kierunku miejsca wiązania substratu. Dehydrogenazy pro-S stereospecyficzne przyjmują natomiast konformację odwrotną – syn [16].
Większość enzymów z grupy dehydrogenaz aminokwasowych wykazuje pro-S stereospecyficzność. W tym przypadku jedynymi znanymi wyjątkami są AlaDH i dehydrogenaza L-lizynowa, które są pro-R stereospecyficzne (tabela 3.2) [17].
Enzym Źródło enzymu Stereospecyficzność
dehydrogenaza L-glutaminianowa
drożdże pro-S
wątroba wołowa pro-S
roślina pro-S
dehydrogenaza L-alaninowa
Bacillus subtilis pro-R Bacillus sphaericus pro-R dehydrogenaza L-leucynowa Bacillus sphaericus pro-S dehydrogenaza L-fenyloalaninowa Bacillus sphaericus pro-S Tramitichromis intermedius pro-S dehydrogenaza L-lizynowa Agrobacterium tumefaciens pro-R dehydrogenaza L-walinowa Streptococcus thermovulgaris pro-S dehydrogenaza alkoholowa Saccharomyces cerevisiae pro-R dehydrogenaza L-mleczanowa mięsień królika pro-R dehydrogenaza mrówczanowa Candida boidinii pro-R
Tabela 3.2. Zestawienie stereospecyficzności wybranych dehydrogenaz [18]
3.3.3. Dehydrogenazy aminokwasowe
Dehydrogenazy aminokwasowe (EC 1.4.1.-) katalizują odwracalną reakcję oksydacyjnej deaminacji α-aminokwasów do odpowiednich α-ketokwasów oraz amoniaku i są sklasyfikowane według specyficzności substratowej (schemat 3.4).
Większość dehydrogenaz katalizuje przemiany α-aminokwasów, jednakże niektóre działają również na β- i ε-aminokwasy. Dehydrogenazy aminokwasowe mają podobne struktury, jednak różnią się od siebie specyficznością substratową, stereospecyficznością oraz stabilnością w różnych warunkach środowiskowych.
Enzymy te uczestniczą w metabolizmie azotu i węgla przeprowadzając proces oksydacyjnej deaminacji. Pozostałe szkielety węglowe są metabolizowane w procesie
odwrotnym – redukcyjnego aminowania – organizmy wiążące azot pobierają amoniak ze środowiska i wbudowują go w ketokwasy tworząc aminokwasy [17].
C H
NH2 R
HOOC C
R HOOC O
+ NAD(P)+ + H2O + NAD(P)H + NH3
Schemat 3.4. Ogólna reakcja z udziałem dehydrogenaz aminokwasowych [18]
Większość dehydrogenaz współdziała tylko z jedną z form koenzymów nikotynoamidoadeninowych, jednak nieliczne wykorzystują obie formy koenzymatyczne. Ogólny mechanizm działania dehydrogenaz aminokwasowych obejmuje oderwanie anionu wodorkowego z substratu i redukcję koenzymu NAD(P)+, a następnie przyłączenie cząsteczki wody związanej z enzymem, co w rezultacie prowadzi do utworzenia pośredniej karbinoloaminy. Oddysocjowanie grupy aminowej z substratu z utworzeniem cząsteczki amoniaku skutkuje powstaniem ketokwasu [17]. W większości dehydrogenazy aminokwasowe działają na L-aminokwasy, a redukcyjne aminowanie α-ketokwasu jest preferowanym kierunkiem reakcji [18].
3.3.4. Dehydrogenaza L-alaninowa
3.3.4.1. Ogólna charakterystyka enzymu AlaDH
Dehydrogenaza L-alaninowa (EC 1.4.1.1) jest ważnym enzymem uczestniczącym w katabolizmie L-alaniny u bakterii. Należy do rodziny dehydrogenaz aminokwasowych i katalizuje oksydacyjną deaminację L-alaniny oraz reakcję odwrotną – redukcyjne aminowanie kwasu pirogronowego (schemat 3.5).
NH2 H
O OH
O OH O
+ NAD+
dehydrogenaza L-alaninowa
+ NADH
L-Ala PA
+ H2O + NH4+ + H+
EC 1.4.1.1
Schemat 3.5. Odwracalna reakcja oksydacyjnej deaminacji L-alaniny
Optymalne warunki do działania AlaDH
Najbardziej właściwą temperaturą do działania AlaDH jest 30°C a optymalne pH wynosi 10-10,5 dla oksydacyjnej deaminacji i 8-9 dla redukcyjnego aminowania [19].
Specyficzność substratowa
Do prawidłowej aktywności enzym AlaDH wymaga obecności koenzymu NAD+, który nie może być zastąpiony przez NADP+. Specyficzność substratowa w kierunku oksydacyjnej deaminacji jest wysoka, gdyż enzym katalizuje przemiany prawie wyłącznie z udziałem L-Ala. Specyficzność w kierunku redukcyjnego aminowania jest niższa i poza pirogronianem, enzym katalizuje m.in. reakcje z udziałem α-ketomaślanu, α-ketowalerianu i β-hydroksypirogronianu [19].
Inhibitory AlaDH
Silnymi inhibitorami dla enzymu AlaDH są p-chlorortęciobenzoesan i chlorek rtęci (II), będące typowymi związkami hamującymi aktywność enzymów posiadających grupy tiolowe w centrum aktywnym. Ponadto, właściwości inhibicyjne wykazują jony Cu2+ i Pb2+ [19].
Występowanie i znaczenie biologiczne
Od odkrycia AlaDH w 1955 roku przez Wiame i Pierarda enzym ten był przez wiele lat jednym z najintensywniej badanych dehydrogenaz aminokwasowych [20]. Jej obecność odkryto zarówno w organizmach eukariotycznych, jak i prokariotycznych, głównie bakteriach należących do szczepów Bacillus, Acholeplasma, Anabaena, Archeoglobus, Carnobacterium, Enterobacter, Geobacillus, Halobacterium, Mycobacterium, Phormidium, Pseudomonas i Streptomyces [21]. AlaDH została zidentyfikowana i wyizolowana z komórek wegetatywnych i przetrwalnikowych cyjanobakterii oraz bakterii z rodzaju Bacillus (B. cereus, B. subtilis, B. sphaericus), które produkują ten enzym pod wpływem bodźca, jakim jest obecność L-alaniny w środowisku [22].
Enzym AlaDH jest ważnym obiektem badań w wielu obszarach nauki, w tym w medycynie i epidemiologii. AlaDH uczestniczy w katabolizmie L-alaniny i jest
ważnym źródłem węgla i azotu dla mikroorganizmów. Bakterie z rodzaju Bacillus, aby przetrwać w niekorzystnych warunkach środowiskowych, przeprowadzają proces sporulacji, czyli wytworzenia form spoczynkowych – przetrwalników. Procesem odwrotnym jest germinacja, czyli powrót komórki do formy wegetatywnej, dla którego jednym z sygnałów biochemicznych jest wzrost stężenia alaniny w środowisku.
Udowodniono, że AlaDH uczestniczy w produkcji energii niezbędnej do sporulacji i germinacji powstałych przetrwalników poprzez oksydacyjną deaminację L-alaniny i wytworzenie pirogronianu, który jest metabolizowany w cyklu Krebsa [23,24].
Ponadto, w komórkach Rhodopseudomonas capsulata, Streptomyces clavuligerus i Anabeana cylindrica AlaDH uczestniczy w procesie asymilacji azotu w środowisku wysokiego stężenia amoniaku [18]. Wytwarzanie tego enzymu przez mikroorganizmy jest wzbudzane głównie przez obecność substratu – L-alaniny, jednak istnieje teoria, według której indukcja wywołana L-Ala zależy od jej przemiany w D-Ala przez racemazę alaninową [25].
Przeprowadzone niedawno badania wykazały obecność enzymu AlaDH w chorobotwórczym szczepie Mycobacterium tuberculosis, wywołującym gruźlicę.
Pomimo wielu badań nad mechanizmem patogenezy tej choroby stanowi ona wciąż globalne zagrożenie dla zdrowia publicznego ze względu na oporność na antybiotyki, trudności w diagnostyce oraz zdolność do pozostawania prątków gruźlicy w płucach w fazie uśpienia. Enzym AlaDH jest prawdopodobnie zaangażowany w biosyntezę peptydoglikanu – głównego składnika ściany komórkowej, która jest niezbędna do przetrwania większości bakterii. Co więcej aminokwasy: L-Ala i D-Ala są ważnymi składnikami peptydoglikanu, bez których jego synteza jest niemożliwa [12, 26-28].
Struktura warstwy peptydoglikanu ma postać łańcuchów polisacharydowych zbudowanych z kwasu N-acetylomuraminowego (NAM) i N-acetyloglukozoaminy (NAG) usieciowanych poprzez wiązania 4→3 i 3→3 między oligopeptydami, zbudowanymi zazwyczaj z trzech do pięciu aminokwasów: D-alaniny, L-alaniny, kwasu D-glutaminowego i kwasu mezo-diaminopimelinowego (A2pm), tworzących siatkową, trójwymiarową strukturę (rysunek 3.1) [29]. W przypadku pentapeptydu, pierwsze trzy aminokwasy są zmienne, natomiast dwa kolejne charakteryzują się stałością i są z góry określone (stanowią one zawsze terminalny dipeptyd
D-alanylo-D-alaninę, AA), co determinowane jest przez rolę, jaką pełnią one w biosyntezie peptydoglikanu [30].
Rysunek 3.1. A. Klasyczny model warstwy peptydoglikanu w M. tuberculosis (szare pola oznaczają N-acetyloglukozoaminę, białe pola – kwas N-acetylomuraminowy, A2pm – kwas mezo-diaminopimelinowy, zaznaczone są oddziaływania 4→3 między peptydami [30].
B. Siatkowa struktura peptydoglikanu [31]
AA, kluczowa struktura w biosyntezie peptydoglikanu, jest odpowiedzialna za sieciowanie łańcuchów polisacharydowych, gdyż przedostatni aminokwas D-Ala tworzy wiązanie peptydowe z aminokwasem innego oligopeptydu. Fakt ten sprawia, iż końcowy dipeptyd jest obiektem oddziaływania antybiotyków blokujących syntezę bakteryjnej ściany komórkowej [32]. Antybiotyki takie jak wankomycyna i ristocetyna rozpoznają i wiążą się z peptydem AA zakłócając w ten sposób biosyntezę peptydoglikanu, natomiast penicylina powoduje inhibicję enzymów syntetyzujących końcowy dipeptyd [30]. Opracowanie leku będącego inhibitorem enzymu AlaDH, odpowiedzialnego za dostarczanie L-Ala w wyniku redukcyjnego aminowania pirogronianu, może mieć kluczowe znaczenie w zablokowaniu syntezy terminalnego dipeptydu AA, gdyż powstająca L-Ala jest przekształcana do D-Ala przez racemazę alaninową [33]. Podobnie, jak w przypadku antybiotyków z grupy penicylin mogłoby to spowodować zatrzymanie biosyntezy ściany komórkowej i obumarcie bakterii.
Ponadto, pewne perspektywy dla dalszych badań nad patogenezą gruźlicy stwarza fakt, iż enzym AlaDH występuje jedynie w wirulentnym szczepie M. tuberculosis, natomiast jest nieobecny w szczepionce przeciwgruźliczej BCG (fr. Bacillus Calmette- Guérin), która zawiera atenuowany szczep bakterii Mycobacterium bovis wywołujący chorobę bydła [34].
A B
oligopeptyd NAM
NAG
Wszystko to sprawia, że z medycznego punktu widzenia AlaDH jest interesującym obiektem badań, gdyż może stanowić potencjalny cel terapeutyczny w leczeniu oraz zapobieganiu gruźlicy. Wnikliwe poznanie i zrozumienie mechanizmu działania tego enzymu mogłoby przyczynić się do opracowania nowych leków oraz szczepionek przeciwgruźliczych.
3.3.4.2. Budowa enzymu AlaDH
Struktura przestrzenna białkowego enzymu AlaDH jest znana i została opisana dla enzymów pozyskanych z różnych źródeł przy użyciu rentgenografii strukturalnej [22,35,36]. Metoda ta polega na analizowaniu obrazów dyfrakcyjnych promieni rentgenowskich tworzonych przez analizowany kryształ i pozwala na dokładne ustalenie struktury związku chemicznego, w tym wyznaczenie położenia poszczególnych atomów względem siebie, ustalenie konfiguracji absolutnej, czy kątów i długości wiązań między atomami. Analiza krystalograficzna enzymów dostarcza wielu cennych informacji na temat struktury 1-, 2-, 3- i 4-rzędowej białka, budowy centrum aktywnego czy konformacji natywnej białka. Informacje na temat struktury białka AlaDH w połączeniu z przeprowadzonymi przeze mnie badaniami izotopowymi mogą pomóc w lepszym wyjaśnieniu mechanizmu działania AlaDH.
Enzym AlaDH składa się z części białkowej – apoenzymu i części niebiałkowej – kofaktora, którego funkcję pełni koenzym NAD+. W zależności od pochodzenia AlaDH ma różną strukturę białkową. Biokatalizator wyizolowany z halofilnych bakterii Halobacterium cutirubrum i H. salinarium ma postać monomeru, enzym z Pseudomonas sp., Rhizobium lupini i Streptomyces fradiae jest tetramerem, a z Streptomyces aureofaciens – oktamerem. Najczęstszą formą enzymu AlaDH, występującą w mikroorganizmach z rodzaju Bacillus, Thermus i Mycobacterium, jest heksamer o ciężarze od 228 do 290 kDa, który składa się z sześciu identycznych podjednostek o masie cząsteczkowej w zakresie 38 – 48 kDa (rysunek 3.2) [18]. Jedną z najlepiej opisanych i scharakteryzowanych struktur krystalograficznych AlaDH jest enzym wyizolowany z prątka gruźlicy – Mycobacterium tuberculosis. Każdy łańcuch polipeptydowy tego enzymu składa się z 371 aminokwasów, przy czym sekwencja aminokwasów i struktura białka w bakteryjnej AlaDH wykazują większą rozbieżność w porównaniu z innymi dehydrogenazami aminokwasowymi takimi jak, PheDH, LeuDH
i GluDH. AlaDH mechanizmem katalizy oraz sposobem zwijania białka przypomina bardziej enzymy z rodziny dehydrogenaz D-2-hydroksykwasowych [35].
Rysunek 3.2. Struktura krystalograficzna heksameru AlaDH z Mycobacterium tuberculosis (podjednostki enzymu są zaznaczone różnymi kolorami) [37]
Budowa podjednostki AlaDH
Każda podjednostka AlaDH składa się z dwóch domen, odseparowanych od siebie szczeliną – domeny wiążącej NAD+ (reszty aminokwasów 129-308) oraz domeny katalitycznej (reszty aminokwasów 1-128 i 309-371), która przyłącza substrat. W pojedynczej podjednostce znajduje się 13 α-helis i 15 β-kartek. Domeny dehydrogenaz, zależnych od NAD+, charakteryzują się obecnością białkowych motywów Rossmanna, które są odpowiedzialne za przyłączanie koenzymu. Analiza struktury trzeciorzędowej enzymu AlaDH pozwoliła na ustalenie, że domena wiążąca NAD+ ma postać centralnie umiejscowionej 7-łańcuchowej β-kartki otoczonej przez α-helisy. Natomiast domena katalityczna charakteryzuje się obecnością 8-łańcuchowej β-kartki zawierającej motyw Rossmanna oraz β-spinki. Pomimo odmiennej sekwencji aminokwasów obie domeny są do siebie strukturalnie zbliżone [36,37].
Czwartorzędowa budowa AlaDH
Budowa heksameryczna enzymu jest skutkiem połączenia trzech dimerów i utworzenia struktury potrójnego dimeru (rysunek 3.3). Dwa łańcuchy polipeptydowe łączą się poprzez dwie α-helisy tworząc dimer, w którym domeny wiążące NAD+ znajdują się w środku, natomiast domeny katalityczne wychodzą na zewnątrz enzymu.
umiejscowiona w szczelinie między domenami. Upakowanie podjednostek w formę heksameru generuje dwie powierzchnie międzyfazowe, czyli interfejsy: interfejs dimeru i trimeru [36,37].
Rysunek 3.3. Dimer powstały w wyniku połączenia dwóch podjednostek enzymu. Jedna podjednostka enzymu jest zaznaczona na niebiesko (domena wiążąca NAD+) i czerwono (domena katalityczna), druga podjednostka - na szaro. Pozycja centrów aktywnych jest wskazana poprzez ligandy NAD+ (na żółto)[36]
Struktura apo- i holodehydrogenazy L-alaninowej
Apoenzym, zanim zwiąże się z kofaktorem i utworzy holoenzym, występuje w postaci konformacji otwartej, przy czym sposób ich oddziaływania jest podobny wśród różnych dehydrogenaz (rysunek 3.4). Główną różnicą strukturalną między apoenzymem i holoenzymem jest zmiana orientacji dwóch domen wiążących NAD+ względem domeny katalitycznej.
Rysunek 3.4. Struktura form apoenzymu (z lewej) i holoenzymu (z prawej) AlaDH z Mycobacterium tuberculosis [38]
W czasie tworzenia kompleksu AlaDH-NAD+ domena katalityczna każdej podjednostki enzymu obraca się o około 16° względem domeny wiążącej NAD+. Jest to wynikiem przejścia z otwartej konformacji w zamkniętą po związaniu enzymu z kofaktorem.
Obrót następuje w tzw. regionie zawiasowym w obrębie reszt aminokwasowych 126-133 i 304-320, które są częścią dwóch odcinków heliakalnych łączących domeny.
Podczas tworzenia się struktury holoenzymu domena katalityczna zmierza w kierunku domeny wiążącej NAD+, co prowadzi do powstania konformacji zamkniętej, gdzie reszty aminokwasów, wchodzących w skład centrum aktywnego, są bliżej koenzymu NADH. Przejście z konformacji otwartej w zamkniętą stwarza dogodne warunki dla katalizy, gdyż zapewnia odpowiednią orientację substratu ułatwiając dostęp cząsteczek wody i amoniaku do centrum aktywnego [36].
Wiązanie enzymu AlaDH z NAD+
Podczas wiązania enzymu z kofaktorem w pozycji C-’2 pierścienie rybozy, wchodzące w skład dinukleotydu, przyjmują w kompleksie konformacje endo, a pierścień adeniny wiąże się z resztami Ile 199, Val 239, Leu 240 i Leu 249 poprzez oddziaływania hydrofobowe. Dodatkowo, w tworzeniu kompleksu uczestniczą wiązania wodorowe, zarówno pomiędzy grupami 2’- i 3’- hydroksylowymi nukleotydu adeninowego i resztą kwasową Asp 198, jak również między grupą 2’-hydroksylową i atomem azotu w pozycji ε reszty Lys 203. Grupa difosforanowa kontaktuje się z atomami reszt aminokwasów pętli 178-179 i łańcuchem bocznym Ser 134 poprzez wiązania wodorowe, które występują również między grupami hydroksylowymi rybozy nukleotydu nikotynoamidowego a resztą Asp 270 [36].
Pro-R stereospecyficzność enzymu AlaDH jest determinowana przez ukierunkowanie grupy amidowej, związanej mostkiem wodorowym z łańcuchem aminokwasów Ile 267, Val 298 i Met 301 tak, że wodór z pozycji 4-pro-R zwraca się w kierunku centrum aktywnego [39]. Forma zredukowana koenzymu jest silniej wiązana przez enzym niż utleniona, co wynika z wartości stałych dysocjacji (Kd NAD+ = 12,81, Kd NADH = 0,276). Znacznie niższa wartość Kd dla zredukowanej formy koenzymu wskazuje na to, że preferowanym kierunkiem reakcji in vivo katalizowanej przez AlaDH jest redukcyjne aminowanie PA, czyli tworzenie L-Ala.
Struktura potrójnego kompleksu AlaDH-NAD+-PA
Zapoczątkowanie etapu katalitycznego wymaga utworzenia kompleksu enzymu AlaDH z PA i NADH (rysunek 3.5). Reszty Arg 15 i Lys 75 stabilizują pirogronian w centrum aktywnym poprzez wiązania wodorowe i elektrostatyczne z atomem tlenu grupy karboksylowej (rysunek 3.6). W rezultacie przesunięcia domeny katalitycznej względem domeny wiążącej NAD+ pirogronian znajduje się w mniejszej odległości od koenzymu, co sprzyja przeniesieniu anionu wodorkowego [36].
Rysunek 3.5. Struktura podjednostki enzymu tworzącej kompleks z pirogronianem i NADH [36]
Rysunek 3.6. Oddziaływania enzymu AlaDH z NAD+ i PA w ramach potrójnego kompleksu AlaDH-NAD+- PA (wiązania wodorowe zaznaczone przerywaną linią, atomy tlenu cząsteczki wody zaznaczone czerwonymi kropkami)[37]
3.3.4.3. Mechanizm reakcji katalizowanej przez AlaDH
Postulowany mechanizm działania enzymu dehydrogenazy L-alaninowej obejmuje w pierwszym etapie związanie koenzymu NAD+ przez apoenzym i utworzenie holodehydrogenazy L-alaninowej. W trakcie tworzenia kompleksu AlaDH-NAD+ domena katalityczna przesuwa się względem domeny wiążącej koenzym, stabilizując konformację zamkniętą holoenzymu. W kolejnym etapie, w zależności od kierunku
reakcji, substrat – L-alanina lub pirogronian w postaci monoanionów – przyłącza się do centrum aktywnego enzymu AlaDH. Mechanizm katalizy przebiega poprzez dwa związki pośrednie – iminopirogronian i karbinoloaminę.
W procesie oksydacyjnej deaminacji L-alaniny w pierwszej kolejności następuje przeniesienie anionu wodorkowego i redukcja koenzymu NAD+ do NADH, co skutkuje utworzeniem iminopirogronianu (1) (schemat 3.6). Cząsteczka wody, aktywowana przez resztę His 96 pełniącą rolę katalizatora kwas/zasada, atakuje pośredni iminopirogronian w wyniku czego powstaje karbinoloamina (2). W kolejnym etapie następuje protonowanie przez resztę His 96 grupy aminowej powstałego produktu pośredniego (3) a następnie oderwanie protonu z grupy hydroksylowej przez resztę His 96 (lub Asp 270), inicjujące proces eliminacji cząsteczki amoniaku (4). Poza pirogronianem, produktem końcowym jest jon amonowy, gdyż amoniak jest prawdopodobnie protonowany przez resztę His 96. W reakcji oksydacyjnej deaminacji reszta His 96 jest aktywna w formie nieprotonowanej, natomiast względem redukcyjnego aminowania występuje w postaci protonowanej [17,37,40].
W procesie odwrotnym – redukcyjnym aminowaniu – oddziaływania pirogronianu z centrum aktywnym obejmują wiązania wodorowe grupy karboksylowej z resztą aminokwasową Arg 15 oraz wiązanie wodorowe grupy karbonylowej z resztą protonowanej Lys 75, która polaryzuje atom tlenu ułatwiając w ten sposób atak nukleofilowy cząsteczki amoniaku i utworzenie karbinoloaminy. Prawdopodobnie amoniak nie tworzy kompleksu z AlaDH-NADH-PA, tylko reaguje bezpośrednio z utworzeniem karbinoloaminy. Protonowanie grupy hydroksylowej i uwolnienie cząsteczki wody sprawia, że powstaje pośredni iminopirogronian, który jest następnie redukowany z utworzeniem L-alaniny w wyniku przeniesienia anionu wodorkowego z pozycji 4-pro-R koenzymu NADH. W kilku etapach reakcji reszta His 96 jest potencjalnym katalizatorem kwas/zasada i uczestniczy w przeniesieniu protonu. Według niektórych doniesień w literaturze, w pewnych stadiach rolę His 96 przejmuje Asp 270, jednak nie jest do końca jasne, czy Asp 270 jest donorem protonu dla cząsteczki wody po ataku nukleofilowym, a His 96 akceptorem protonu grupy aminowej karbinoloaminy, czy odwrotnie. Konformacja zamknięta kompleksu AlaDH-NADH- PA zapewnia środowisko hydrofobowe a niewielka odległość (3 Ǻ) między atomem wodoru C-4 pierścienia nikotynoamidowego i C-2 pirogronianu tworzy dogodne
warunki do przeniesienia anionu wodorkowego. Ze względu na zwartą strukturę kompleksu enzymu z PA i NADH substrat jest niedostępny dla rozpuszczalnika na tym etapie katalizy. Ścisłe upakowanie pirogronianu względem pierścienia nikotynoamidowego w kompleksie AlaDH-NADH-PA sprawia, że enzym musi zmienić konformację na bardziej otwartą, aby umożliwić dostęp cząsteczki amoniaku.
Jest to możliwe dzięki wytworzeniu wąskiego tunelu, którym wnika on do miejsca aktywnego [36].
NH2 H
C
H3 CO2-
N+
NH2 O
R
NH2+ C
H3 CO2-
N
NH2 O
R H H
O NH2 H
C
H3 CO2-
N
NH2 O
R H H
O NH3+ H
C
H3 CO2-
N
NH2 O
R H H
O C
H3 CO2-
N
NH2 O
R H H
N H H
H H O
H
Lys 75 NH3+ His 96 N:
Lys 75 NH3+
Lys 75 NH3+ His 96 NH+
Lys 75 NH3+ : N
Lys 75 NH3+
(1) (2)
(3)
(4) ..
..
:
:
His 96
His 96 NH+
:
Schemat 3.6. Prawdopodobny mechanizm działania dehydrogenazy L-alaninowej [17,36,37]
3.3.5. Dehydrogenaza L-mleczanowa
3.3.5.1. Ogólna charakterystyka enzymu LDH
Dehydrogenaza L-mleczanowa (LDH, EC 1.1.1.27) należy do klasy oksydoreduktaz i katalizuje odwracalną przemianę pirogronianu w L-mleczan z udziałem koenzymu NADH (schemat 3.7).
O
OH O
OH
OH O
+ NADH + NAD+
dehydrogenaza L-mleczanowa
EC 1.1.1.27
Schemat 3.7. Redukcja kwasu pirogronowego katalizowana przez dehydrogenazę L-mleczanową
Optymalne warunki do działania LDH
Optymalne pH do działania enzymu LDH zależy od źródła jego pozyskania. Dla przykładu, enzym wyizolowany z mięśnia królika ma optimum pH 7-8, natomiast ze szczepu Lactobacillus 4,5-6 [21].
Specyficzność substratowa
Substratami dla enzymu LDH, poza L-mleczanem i pirogronianem, są kwasy:
α-ketoglutarowy, 2-oksowalerianowy, szczawiowy, glioksalowy, fenylopirogronowy, hydroksypirogronowy oraz halogenopochodne kwasu pirogronowego [21].
Inhibitory LDH
Inhibitorami enzymu LDH są jony Hg2+, sole kwasu p-chlorortęciobenzoesowego, kwas glikolowy i winowy, a także 1,10-fenantrolina oraz pochodne kwasu 2,3-dihydroksynaftalenowego, w tym gossypol (2,2’-bis(8-formylo- 1,6,7-trihydroksy-5-izopropylo-3-metylonaftalen) [21,41].
