6. Metody chemiczne zagęszczania analitów
6.2. Derywatyzacja – tworzenie pochodnych dla analizy
W próbkach środowiskowych większość matryc jest skomplikowana i bogata w substancje o różnym charakterze chemicznym. Niekiedy substancje matrycy uniemożliwiają oznaczanie analitu w jego natywnej postaci i dopiero utworzenie, w wyniku reakcji chemicznej odpowiedniej pochodnej, o właściwościach dogodnych dla stosowanej techniki analitycznej, pozwoli na jego oznaczenie. Proces przeprowadzania analitu w substancję o innych właściwościach nazywa się tworzeniem pochodnych lub derywatyzacją i jest często stosowany,
131 zwłaszcza przy oznaczaniu związków polarnych i jonowych (np. alkoholi, kwasów karboksylowych, cukrów, amin, aminokwasów i innych).
W wyniku derywatyzacji można uzyskać z analitu związek:
• mniej reaktywny, przez zablokowanie aktywnych grup funkcyjnych, • bardziej trwały termicznie,
• bardziej lotny lub mniej lotny, • mniej polarny,
• barwny, odpowiedni do kolometrycznych oznaczeń,
• łatwiejszy do detekcji, przez wprowadzenie odpowiednich grup funkcyjnych.
Tworzenie pochodnych może odbywać się bez odczynnika derywatyzującego (reakcje termiczne, katalityczne, fotochemiczne, elektrochemiczne) lub z zastosowaniem odczynnika chemicznego (rysunek 26). Odczynnik derywatyzujący powinien łatwo tworzyć pochodną (być reaktywny), nie powodować reakcji ubocznych, zwiększać hydrofobowość i wprowadzać tzw. grupę sygnałową, czyli tę część molekuły, która ułatwia detekcję analitu, np. grupę chromoforową czy fluoroforową. Grupa chromoforowa to ta część cząsteczki, która jest odpowiedzialna za intensywną absorpcję promieniowania elektromagnetycznego w zakresie UV-Vis; grupa fluoroforowa wywołuje fluorescencję. Schemat reakcji spochadniania za pomocą takiego odczynnika pokazano na rysunku 27. W trakcie reakcji części reaktywne analitu i odczynnika („1”) zostają zablokowane, przez co pochodna ma mniejszą polarność, poza tym uzyskuje grupę sygnałową („2”). Zwiększanie hydrofobowości analitu ułatwia jego rozdział od matrycy w dalszych etapach analizy, np. metodami chromatograficznymi.
Rysunek 26. Schemat metod derywatyzacji
Rysunek 27. Schemat derywatyzacji analitu; „1”- część reaktywna odczynnika derywatyzującego i analitu, „2”-grupa sygnałowa odczynnika derywatyzującego
Analit - A Pochodna B Pochodne C + D + E Czynniki wywołujące przemianę chemiczną Analit - A Pochodna F Pochodne G + H + …
Ewentualne kolejne etapy derywatyzacji
Odczynniki derywatyzujące
+ Odczynnik → Pochodna analitu 2
derywatyzujący
1 2
132 Przykładem derywatyzacji analitu w celu jego wydzielenia i oznaczenia ilościowego jest spektrofotometryczne oznaczanie fenoli w wodzie w postaci pochodnej indofenolowej, otrzymanej w reakcji fenolu z 4-aminoantypiryną. Reakcja przebiega w środowisku zasadowym, w obecności heksacyjanożelazianu(III) potasu (rysunek 28). Otrzymana pochodna jest mniej polarna od fenolu (zablokowana grupa fenolowa) i od 4-aminoantypiryny (zablokowana grupa aminowa), łatwo ekstrahowana z wody chloroformem i oznaczana spektrofotometrycznie, przy długości fali λ= 460 nm z dużą czułością (wysoka wartość molowego współczynnika absorpcji).
Rysunek 28. Schemat reakcji fenolu z 4-aminoantypiryną
Poza charakterystycznymi dla poszczególnych analitów pochodnymi, w analityce substancji organicznych stosuje się związki, powstające w reakcjach znanych pod ogólnymi nazwami, jak: sililowanie, acylowanie, alkilowanie czy kondensacja ketonowo-zasadowa. W analityce związków nieorganicznych stosuje się reakcje tworzenia wodorków, etylowanie czy alkilowanie z wykorzystaniem odczynnika Grignarda.
Związki organiczne, takie jak cukry, aminokwasy, kwasy tłuszczowe, alkohole, steroidy i inne, zawierające w cząsteczkach grupy -OH, -SH, -NH2, -NHR są nielotne i często nietrwałe. Zastąpienie atomów wodoru grupą sililową (najczęściej trimetylosililową) lub acylową (najczęściej acetylową), zwiększa lotność substancji i jej trwałość, co jest szczególnie korzystne w analizach chromatograficznych. Z podobnych powodów przeprowadza się estryfikację kwasów tłuszczowych oraz alkilowanie amin. Niektóre sposoby derywatyzacji przedstawiono na rysunku 29.
Przykładem wydzielania i oznaczania ilościowego analitów w postaci pochodnych w analityce związków nieorganicznych jest oznaczanie niektórych pierwiastków w postaci wodorków techniką absorpcyjnej spektrometrii atomowej (ASA). Takie pierwiastki jak: Se, Te, As, Sb, Bi, Ge, Sn i Pb w roztworach kwaśnych, pod wpływem silnego środka redukującego, jakim jest borowodorek sodu (NaBH4), tworzą lotne wodorki, z których łatwo otrzymuje się wolne atomy, oznaczane następnie techniką ASA. Zaletą techniki wodorkowej jest możliwość wydzielenia oznaczanego pierwiastka z matrycy i wprowadzenia do kuwety spektrometru ASA w postaci czystej. Reakcję tworzenia wodorku selenu przedstawiono poniżej:
O
4H
SeH
2H
8H
SeO
8H
B(OH)
H
O
3H
BH
2 2 2 4 3 2 -4+
→
+
+
+
→
+
+
+ − +133 Rysunek 29. Przykłady reakcji derywatyzacji zwiększających lotność i trwałość substancji
organicznych
6.3. Mineralizacja
Szeroko stosowanym sposobem pozyskiwania analitów w dogodnej postaci chemicznej jest mineralizacja, stosowana przy oznaczaniu pierwiastków, zwłaszcza metali ciężkich.
W środowisku naturalnym procesy mineralizacji zachodzą z udziałem najczęściej organizmów żywych (bakterii, robaków i in.), w przypadku mineralizacji z dostępem tlenu mówimy o butwieniu, w warunkach beztlenowych zaś o gniciu.
W chemii analitycznej, mineralizacja próbki stałej prowadzi do otrzymania związków mineralnych, które łatwo przeprowadza się ilościowo do roztworu. Podczas mineralizacji ogólna struktura poszczególnych części próbki, w tym minerałów, ulega destrukcji. Wybór sposobu mineralizacji zależy od rodzaju analizowanej próbki i od oznaczanego pierwiastka. Mineralizacja musi zachodzić ilościowo, a matryca odbierająca nie może przeszkadzać w analizie właściwej. Poza tym proces
Mineralizacja (pokrewne określenia to dekompozycja, destrukcja, roztwarzanie, rozkład,
spopielanie) jest zespołem procesów, w których związki organiczne przekształcane są w proste
związki mineralne takie, jak: CO2, H2O, NH3 i inne, a nieorganiczne - w formy rozpuszczalne. Reakcja sililowania alkoholu za pomocą bis(trimetylosililo)acetamidu
(BSA)
Reakcja acetylowania alkoholu za pomocą bezwodnika kwasu octowego
Reakcja acylowania aminy za pomocą chlorku kwasowego
134 rozkładu powinien zachodzić szybko, z możliwością automatyzacji i być tani. Do najważniejszych sposobów mineralizacji zaliczamy mineralizację na mokro oraz mineralizację na sucho, a każdą z nich można przeprowadzić metodą redukcyjną lub utleniającą.
Najczęściej stosowaną metodą uzyskiwania analitów w postaci dogodnej do oznaczenia jest mineralizacja utleniająca mokra. W tej technice używa się mieszaniny jednego lub kilku kwasów mineralnych (najczęściej: HNO3, H2SO4, HClO4, HF) oraz związku o właściwościach utleniających (np. H2O2). Jako dodatki stosuje się azotany(V): Mg(NO3)2, KNO3, NaNO3, jak również HBr, HCl, H3PO4, K2S2O7 i HCOOH. Rozkład próbki następuje pod wpływem tlenu, uwalniającego się podczas ogrzewania kwasów. Przykładem mineralizacji utleniającej mokrej jest metoda Kjeldahla, wykorzystywana głównie do oznaczania azotu organicznego. Mineralizację w kwasie azotowym z dodatkiem kwasu nadchlorowego lub wody utlenionej stosuje się do pozyskiwania metali, boru, fosforu, siarki i chlorowców z próbek organicznych. Do rozkładu próbek gleb lub osadów, dla oznaczania metali ciężkich, stosuje się mieszaninę królewską, składającą się z 1 części kwasu chlorowodorowego i 3 części kwasu azotowego, roztwór kwasu chlorowodorowego (rozcieńczony 5x), roztwór stężonego kwasu azotowego z dodatkiem 30%-owego H2O2 oraz kwas fluorowodorowy z dodatkiem innych kwasów.
Mineralizacja jest procesem długotrwałym, dlatego wspomagana jest: • podwyższoną temperaturą,
• promieniowaniem UV, jako katalizatorem reakcji utleniania,
• promieniowaniem ultradźwiękowym (wykorzystanie zjawiska kawitacji),
• promieniowaniem mikrofalowym, jako nośnikiem energii docierającym bezpośrednio do cząsteczki związku mineralizowanego,
• podwyższonym ciśnieniem.
Mineralizację „na sucho” stosuje się kilkoma metodami:
• poprzez spopielanie, polegające na powolnym rozkładzie próbki w temperaturze 400÷600°C a następnie roztworzeniu powstałego popiołu w kwasie,
• poprzez mineralizację w plazmie tlenowej (tzw. spopielanie czyste), którą uzyskuje się w temperaturze 80÷200°C przez działanie pola elektromagnetycznego o częstotliwości ponad 27MHz,
• poprzez utlenianie pod normalnym ciśnieniem tlenu, w tzw. butli Schönigera lub pod podwyższonym ciśnieniem tlenu, w bombie tlenowej, np. bombie Paara,
• poprzez stapianie z solami mineralnymi o właściwościach utleniających, jak NaNO3, KNO3, Na2CO3, zwanymi topnikami, ułatwiającymi rozpuszczanie próbek w kwasach lub wodzie, • poprzez utlenianie w strumieniu czystego tlenu, przepływającego nad próbką umieszczoną w
rurze kwarcowej podgrzanej do temperatury 800÷1000°C – tzw. rozkład w układzie dynamicznym, stosowany w organicznej analizie elementarnej; anality (C, H, N, O, S) wychwytywane są z gazu techniką absorpcji.
135
6.4. Analiza specjacyjna
Pierwiastki obecne w środowisku występują w różnych formach chemicznych i fizycznych. Występują zarówno w postaci stałej jak i rozpuszczonej. W roztworach występują w postaci hydratowanych jonów, kompleksów organicznych i nieorganicznych oraz różnego rodzaju asocjatów. Metale występują na więcej niż jednym stopniu utlenienia. Różne formy pierwiastków są zaadsorbowane przez cząstki iłów, są związane z żelazem, manganem lub związkami wapnia i in., a połączenie ich z matrycą mineralną można uszeregować od słabej adsorpcji do wiązania kowalencyjnego.
Wiedza o formach pierwiastka występujących w danym elemencie środowiska ma ogromne znaczenie, ponieważ toksyczność, ruchliwość, bioprzyswajalność i bioakumulacja zależą od jego chemicznej formy.
Podstawowym celem analizy specjacyjnej jest określenie toksycznego i ekotoksycznego działania poszczególnych pierwiastków. Sposób oddziaływania toksycznego pierwiastków na wodę, glebę, osady oraz na ludzi, zwierzęta i rośliny jest bardzo zależny od ich formy chemicznej. Działanie toksyczne, np. metali jest silniej związane z ich formą chemiczną niż z całkowitym stężeniem. Na bioprzyswajalność różnych form pierwiastków wpływa również ich rozmieszczenie w poszczególnych elementach środowiska naturalnego. Analizę specjacyjną wykonuje się w kontroli produktów żywnościowych, badaniu leków i innych produktów farmaceutycznych, w kontroli procesów technologicznych, kontroli stanowisk pracy i in. Badania specjacji są wykonywane również dla poznania pełnych cykli biogeochemicznych poszczególnych pierwiastków.
Analiza specjacyjna nastręcza dużo trudności. Pierwszym problemem jest stężenie pierwiastków, już całkowite bywa często bliskie progu detekcji a jeszcze jest zmniejszane przez podział na frakcje. Poza tym, niektóre formy pierwiastków pozostają w równowadze z innymi, obecnymi w próbce, dlatego warunki ekstrakcji muszą być takie, aby nie naruszyć ogólnej równowagi lub przynajmniej w nieznacznym stopniu. W analizie specjacyjnej wykorzystuje się wszystkie dostępne techniki rozdzielania, w tym techniki ekstrakcyjne. Do izolacji różnych form pierwiastków stosuje się ekstrakcję chemiczną, polegającą na traktowaniu próbki odczynnikiem lub odczynnikami symulującymi warunki środowiskowe naturalne lub zmienione antropogenicznie.
Ekstrakcja może być jednoetapowa lub wieloetapowa. Ekstrakcję jednoetapową przeprowadza się odczynnikiem, który podobnie jak w naturze, umożliwia przechodzenie metali do gleby, wód czy roślin. Jest to najczęściej roztwór o odczynie obojętnym i o dużej sile jonowej lub kompleksujący, powodujący uwalnianie zaadsorbowanych składników, np.:
• niezbuforowane roztwory soli (CaCl2, NaNO3, NH4NO3, BaCl2), • roztwory buforowe (NH4OAc/AcOH),
• roztwory związków kompleksujących (kwas etylenodiaminotetraoctowy EDTA, kwas dietylenotriaminopentaoctowy DTPA, EDTA-AcOH/NH4OAc, DTPA + trietanoloamina, TEA). Współistnienie wszystkich form danego pierwiastka w badanym materiale nazywa się
specjacją.
Identyfikacja i ilościowe oznaczanie form fizycznych i chemicznych pierwiastka łącznie z jego całkowitym stężeniem w próbce nazywa się analizą specjacyjną (ang. speciation analysis).
136 Ekstrakcja wieloetapowa polega na kolejnych ekstrakcjach roztworami o wzrastającej sile ługowania i może być prowadzona równolegle oraz sekwencyjnie. Ekstrakcje równoległe prowadzi się, aby wyeliminować wpływ innych odczynników. Ekstrakcja sekwencyjna polega na roztwarzaniu i ługowaniu tej samej próbki kolejno różnymi odczynnikami, którymi najczęściej są, stosowane w kolejności:
• niezbuforowane roztwory soli,
• roztwory buforowe lub roztwory słabych kwasów, • roztwory związków redukujących,
• roztwory związków utleniających, • mocne kwasy.
Ekstrakcje wieloetapowe przeprowadzane są wg różnorodnych procedur i z zastosowaniem różnych odczynników. Schemat przykładowej ekstrakcji wieloetapowej przedstawiono na rysunku 30.
Rysunek 30. Schemat ekstrakcji sekwencyjnej wg A. Tessiera i wsp. Próbka 1 M MgCl2, pH 7,0 lub 1M NaOAc, pH 8,2 Frakcja jonowymienna, metale zaadsorbowane na powierzchni ciał stałych 1M NaOAc, pH 5 Frakcja węglanowa, metale związane z węglanami 0,04M NH2OH·HCl/25%AcOH lub 0,3 M Na2S2O4/0,175 M cytrynian trisodu/0,025M
kwas cytrynowy Frakcja tlenkowa,
metale związane z uwodnionymi tlenkami żelaza i manganu Frakcja organiczna i siarczkowa, metale związane lub zaadsorbowane na powierzchni materii organicznej Pozostałość Pozostałość a)0,02M HNO3+30%H2O2pH 2 b)30%H2O2pH 2 (HNO3) c)3,2 M NH4AcOH/20%HNO3 Frakcja pozostała, metale trwale związane z minerałami, wbudowane w sieć krystaliczną HF + HClO4 Pozostałość Pozostałość
137 Dla umożliwienia porównywania wyników, Komisja Unii Europejskiej w ramach Programu Pomiarów i Testowania (Standard Measurement and Testing Programme, SM&T) przyjęła wspólne procedury ekstrakcji metali ciężkich z gleb mineralnych, zarówno dla metody jednoetapowej jak i sekwencyjnej. Do izolacji Cd, Pb, Cr, Ni, Cu, i Zn zatwierdzono 0,43 M kwas octowy i 0,005 M EDTA. Zatwierdzone przez SM&T warunki ekstrakcji sekwencyjnej przedstawiono w tabeli 10.
Tabela 10. Schemat procedury analizy sekwencyjnej wg europejskiego programu standaryzacji SM&T Etap
ekstrakcji
Frakcja metali (śladów)
Skład wodnego roztworu ekstrahującego c[mol L-1]
1 Jonowymienna i węglanowa CH3COOH (0,11 )
2 Tlenkowa NH2OH·HCl (0,1) przy pH 2 (HNO3)
3 Organiczna i siarczkowa H2O2 (8,8) przy pH 2(HNO3) następnie CH3COONH4 (1.0), pH 2