1.1. Wstęp
Chromatografia jest obecnie najbardziej rozpowszechnioną i jednocześnie najbardziej wszechstronną techniką instrumentalną dostępną w nowoczesnych laboratoriach. Umożliwia zarówno analizę jakościową jak i analizę ilościową. Próbki mogą być gazowe, ciekłe lub stałe, zaś sam proces chromatograficzny może być prowadzony albo przy użyciu kosztownych instrumentów albo powszechnie dostępnego sprzętu laboratoryjnego.
Chromatografia jest oparta na systemie dwóch niemieszających się faz: fazy stacjonarnej (nieruchomej) oraz fazy ruchomej, która porusza się wzdłuż fazy stacjonarnej. Próbka jest wprowadzana do kolumny w postaci wąskiego pasma, co znaczy, że ma niewielką objętość (rysunek 1).
Rysunek 1. Chromatografia kolumnowa
Składniki próbki są separowane dzięki temu, iż w różny sposób dzielą się pomiędzy obie fazy i tym samym przemieszczają się wraz z fazą ruchomą z różną prędkością. Kinetyczny ruch cząsteczek powoduje ciągłą wymianę składników próbki pomiędzy obydwoma fazami. Jednocześnie faza ruchoma porusza się wzdłuż fazy stacjonarnej zaś cząsteczki, które są w danym momencie rozpuszczone w fazie ruchomej poruszają się wraz z nią, natomiast te cząsteczki, które są w danym momencie zatrzymane przez fazę stacjonarną, nie przemieszczają się wzdłuż kolumny. Składniki próbki, które wykazują większe powinowactwo do fazy ruchomej poruszają się znacznie szybciej niż składniki, które wykazują większe powinowactwo do fazy stacjonarnej, i tym samym te pierwsze wcześniej opuszczają kolumnę chromatograficzną. Tak, więc separacja składników próbki jest spowodowana różnymi szybkościami migracji poszczególnych składników próbki. Powodem różnej prędkości migracji a tym samym różnego czasu opuszczania kolumny chromatograficznej przez składniki do niej wprowadzone są oddziaływania międzycząsteczkowe. Zachodzą one pomiędzy cząsteczkami próbki a cząsteczkami fazy stacjonarnej i fazy ruchomej a należą do nich siły
Faza ruchoma wprowadzana do kolumny w sposób ciągły
Związki rozdzielane na kolumnie Próbka naniesiona na kolumnę Faza stacjonarna Czas
196 dyspersyjne, polarne (oddziaływania dipol-dipol, oddziaływania π-π, wiązania wodorowe) oraz jonowe. Oddziaływania te powodują, że składniki mieszaniny są w różnym stopniu zatrzymywane przez fazę stacjonarną. Oczywiście silniejsze oddziaływanie z fazą stacjonarną powoduje większą retencję danego składnika próbki i tym samym późniejsze opuszczenie kolumny.
Proces chromatograficzny można prowadzić w kolumnach chromatograficznych (rysunek 1) bądź techniką planarną (rysunek 2). Najprostsza chromatografia kolumnowa wymaga jedynie szklanej rurki zakończonej zaworem, czyli kolumny. Szklana kolumna jest napełniona fazą stacjonarną, przez którą przepływa faza ruchoma. Badaną mieszaninę (próbkę) wprowadza się na początek (czoło) złoża fazy stacjonarnej i następnie przepuszcza się fazę ruchomą przez kolumnę. Przepuszczanie fazy ruchomej przez kolumnę nazywa się elucją (wymywaniem), gdyż w tym czasie następuje separacja składników próbki, które kolejno opuszczają kolumnę, czyli eluują z kolumny.
Rysunek 2. Chromatografia cienkowarstwowa, płytka przygotowana do rozdziału z naniesionymi plamkami badanych próbek (po lewej), płytka po wykonaniu rozdziału (po prawej)
Technika planarna polega na wykonaniu procesu chromatograficznego na bibule lub na cienkich warstwach fazy stacjonarnej osadzonych na podłożu z płytek szklanych, folii aluminiowej lub polimerach (chromatografia cienkowarstwowa) (rysunek 2). Główną różnicą pomiędzy chromatografią kolumnową a chromatografią cienkowarstwową jest kształt fazy stacjonarnej, czyli kształt złoża chromatograficznego. W chromatografii cienkowarstwowej faza ruchoma porusza się w górę płytki chromatograficznej dzięki działaniu sił kapilarnych.
1.2. Podział metod chromatograficznych
Techniki chromatograficzne dzieli się według następujących kryteriów: • stanu skupienia fazy ruchomej,
• mechanizmu rozdzielania,
• sposobu prowadzenia procesu chromatograficznego.
Ze względu na stan skupienia fazy ruchomej wyróżnia się następujące rodzaje chromatografii: • chromatografia gazowa (GC) – technika rozdzielania, gdzie fazą ruchomą jest gaz. W
chromatografii gazowej zawsze stosuje się kolumny chromatograficzne;
• chromatografia cieczowa (LC) – technika rozdzielania, gdzie fazą ruchomą jest ciecz. W chromatografii cieczowej proces rozdzielania można prowadzić w kolumnach (chromatografia
Faza stacjonarna Faza ruchoma Czoło fazy ruchomej Rozdzielone związki Linia startu
197 niskociśnieniowa lub wysokosprawna chromatografia cieczowa, HPLC) bądź techniką planarną;
• chromatografia z fazą ruchomą w stanie nadkrytycznym (SFC) – technika rozdzielania, w której faza ruchoma jest płynem powyżej jego krytycznej temperatury i krytycznego ciśnienia. Stosuje się również terminy: chromatografia fluidalna czy chromatografia nadkrytyczna. Ze względu na mechanizm rozdzielania wyróżnia się następujące rodzaje chromatografii: • chromatografia adsorpcyjna – rozdzielanie jest wynikiem różnic pomiędzy składnikami próbki
w zdolności do adsorbowania się na powierzchni ciała stałego (adsorbentu);
• chromatografia podziałowa – rozdzielanie jest wynikiem różnej rozpuszczalności składników próbki w fazie stacjonarnej (w przypadku chromatografii gazowej) lub różnej rozpuszczalności składników w fazie stacjonarnej i ruchomej (w przypadku chromatografii cieczowej);
• chromatografia jonowa (jonowymienna) – technika, w której rozdzielanie jest wynikiem różnej zdolności składników próbki do ulegania wymianie jonowej;
• chromatografia wykluczania – technika, w której o rozdzieleniu składników próbki decydują różnice w wielkościach cząsteczek i/lub w ich kształcie. W przeszłości stosowane były również nazwy: chromatografia żelowa, sączenie molekularne, chromatografia sitowa;
• chromatografia powinowactwa - technika, w której rozdzielanie jest wynikiem biologicznej specyficzności oddziaływań składników próbki i ligandu. Ten rodzaj chromatografii jest stosowany do izolacji i oczyszczania białek oraz kwasów nukleinowych.
Ze względu na sposób prowadzenia procesu chromatograficznego wyróżniamy chromatografię kolumnową (rysunek 1) oraz chromatografię cienkowarstwową (rysunek 2).
1.3. Podstawowe pojęcia stosowane w chromatografii
Poniżej przedstawiono podstawowe pojęcia i definicje wybrane z nomenklatury chromatograficznej [Witkiewicz et al., Nomenklatura chromatograficzna, 1996].
Chromatografia jest fizyczną metodą rozdzielania, w której składniki rozdzielane ulegają podziałowi pomiędzy dwie fazy; jedna z nich jest nieruchoma (faza stacjonarna), a druga (faza ruchoma) porusza się w określonym kierunku.
Faza stacjonarna – jedna z dwóch faz tworzących układ chromatograficzny. Określana jest też terminem złoże chromatograficzne. Faza stacjonarna może być stała lub ciekła. Jeżeli faza stacjonarna jest cieczą, to może być albo związana chemicznie z ciałem stałym (nośnikiem) albo unieruchomiona na nim fizycznie.
Faza ruchoma – płyn, który przemieszcza się przez nieruchomą fazę stacjonarną albo wzdłuż niej w określonym kierunku. W chromatografii gazowej stosuje się termin gaz nośny natomiast w chromatografii cieczowej stosuje się termin eluent dla określenia fazy ruchomej.
Chromatografia w odwróconym układzie faz – rodzaj chromatografii cieczowej, w której faza ruchoma jest znacznie bardziej polarna niż faza stacjonarna.
Chromatografia w normalnym układzie faz – rodzaj chromatografii cieczowej, w której faza ruchoma jest mniej polarna niż faza stacjonarna.
198 Elucja izokratyczna – rodzaj elucji, podczas którego skład jakościowy i ilościowy fazy ruchomej pozostaje stały.
Elucja gradientowa – rodzaj elucji, w którym skład fazy ruchomej zmienia się w sposób ciągły lub stopniowo.
Kolumna – rurka ze znajdującą się w niej fazą stacjonarną, przez którą przepływa faza ruchoma (eluent). Faza ruchoma wraz z rozpuszczonymi w niej składnikami próbki, opuszczająca kolumnę nazywa się eluatem.
Chromatograf jest to przyrząd lub zestaw przyrządów służący do wykonania rozdzielania chromatograficznego. Najważniejsze części chromatografu to dozownik, kolumna chromatograficzna oraz detektor.
Dozownik – urządzenie, za którego pomocą wprowadza się próbkę do fazy ruchomej przed złożem chromatograficznym lub na to złoże.
Detektor – urządzenie, które określa zmiany w składzie fazy ruchomej przepływającej przez niego, poprzez pomiar jej właściwości fizycznych lub chemicznych. Innymi słowy jest to urządzenie, które monitoruje w sposób ciągły skład fazy ruchomej opuszczającej kolumnę. Z chwilą pojawienia się substancji w detektorze, pojawia się sygnał chromatograficzny (pik), obrazujący zmiany stężenia w czasie lub zmiany stężenia wraz ze zmianą objętości fazy ruchomej wypływającej z kolumny. Sygnały chromatograficzne zapisywane przez rejestrator (komputer) dają chromatogram.
Chromatogram - wynik analizy chromatograficznej; jest to wykres przedstawiający zmiany stężenia w fazie ruchomej substancji rozdzielanych w czasie lub zmiany stężenia wraz ze zmianą objętości fazy ruchomej wypływającej z kolumny.
Chromatogram (rysunek 3) jest źródłem informacji:
• o składzie jakościowym rozdzielanej próbki (położenie piku (sygnału chromatograficznego) substancji na chromatogramie, czyli czas retencji piku, pozwala na jej identyfikację); • o składzie ilościowym (wysokość i pole powierzchni piku substancji odpowiada jej stężeniu
w próbce).
Poniżej przedstawiono podstawowe pojęcia związane z chromatogramem.
Wysokość piku (h) – jest to odległość pomiędzy podstawą piku a maksimum piku. Wysokość piku jak i jego powierzchnia są proporcjonalne do ilości rozdzielanej substancji a więc służą do analizy ilościowej. Dokładniejsze i bardziej rozpowszechnione w analizie ilościowej jest korzystanie z pola powierzchni piku.
Linia podstawowa (linia zerowa) – jest to część chromatogramu ilustrująca sygnał detektora w czasie, gdy z kolumny wypływa jedynie faza ruchoma. Podstawa piku – jest wyznaczana poprzez interpolację linii podstawowej chromatogramu pomiędzy końcami piku.
199 Rysunek 3. Chromatogram elucyjny oraz podstawowe parametry retencyjne: czas retencji substancji niezatrzymywanej tM, całkowity czas retencji tR oraz zredukowany czas retencji t’R badanej substancji Z chromatogramu określa się parametry retencyjne substancji rozdzielanej. Najczęściej stosowane w chromatografii parametry retencyjne to:
• czas retencji substancji niezatrzymywanej tM - czas liczony od momentu wprowadzenia do kolumny (od początku analizy) substancji niezatrzymywanej przez fazę stacjonarną do momentu pojawienia się na chromatogramie maksimum piku; odpowiada czasowi, w którym faza ruchoma migruje przez kolumnę chromatograficzną oraz przez dozownik, detektor i łączniki; poprzednio nazywany czasem martwym lub czasem zerowym;
• objętość retencji substancji niezatrzymywanej VM - objętość fazy ruchomej, która jest potrzebna do elucji substancji niezatrzymywanej przez fazę stacjonarną; poprzednio nazywana objętością martwą lub zerową; objętość retencji substancji niezatrzymywanej jest oczywiście proporcjonalna do czasu retencji substancji niezatrzymywanej:
c M M
t F
V =
(1)gdzie:
Fc - natężenie przepływu fazy ruchomej (objętościowa prędkość przepływu fazy ruchomej) w danej temperaturze kolumny;
• całkowity czas retencji tR - czas liczony od momentu wprowadzenia badanej substancji do kolumny (od początku analizy) do momentu pojawienia się na chromatogramie maksimum piku, czyli momentu maksymalnego stężenia substancji na wyjściu z kolumny;
• całkowita objętość retencji VR - objętość fazy ruchomej, która jest potrzebna do elucji badanej substancji, mierzona od momentu wprowadzenia substancji do kolumny do momentu pojawienia się na chromatogramie maksimum piku; całkowita objętość retencji jest proporcjonalna do całkowitego czasu retencji:
Czas tR
Początek analizy
t’R
Pik badanej substancji
Pik substancji niezatrzymywanej na fazie stacjonarnej Linia podstawowa tM h
200
c R R
t F
V =
(2)• zredukowany czas retencji t’R – różnica pomiędzy całkowitym czasem retencji badanej substancji i czasem retencji substancji niezatrzymywanej:
M R R
t t
t
'= −
(3)Zredukowany czas retencji charakteryzuje retencję substancji na fazie stacjonarnej i jest charakterystyczny dla danej substancji a więc może służyć do jej identyfikacji;
• zredukowana objętość retencji V’R – różnica pomiędzy całkowitą objętością retencji badanej substancji i objętością retencji substancji niezatrzymywanej:
M R R
V V
V
'= −
(4)• współczynnik retencji k – miara czasu, w jakim substancja przebywa w fazie stacjonarnej w stosunku do czasu, w którym przebywa ona w fazie ruchomej. Określa, ile razy dłużej substancja jest zatrzymywana przez fazę stacjonarną niż potrzebowałaby na przejście przez kolumnę z szybkością fazy ruchomej. Współczynnik retencji liczy się z następującego wzoru:
M R
t
t
k =
'/
(5) Współczynnik retencji jest to jednocześnie stosunek ilości substancji w fazie stacjonarnej do ilości tej substancji w fazie ruchomej w stanie równowagi.1.4. Analiza jakościowa w chromatografii
Analizę jakościową technikami chromatograficznymi można wykonać dwoma sposobami poprzez: • wykorzystanie parametrów retencyjnych analitu (całkowity czas retencji, zredukowany
czas retencji),
• stosowanie detektorów jakościowych, takich jak spektrometr mas czy spektroskop FTIR. Parametry retencyjne służą do identyfikacji związków chemicznych analizowanych technikami chromatograficznymi, ponieważ w danych warunkach chromatograficznych, określony związek chemiczny ma zawsze taką samą retencję. Jednakowe warunki chromatograficzne oznaczają jednakowy rodzaj i wymiary kolumny chromatograficznej, rodzaj fazy ruchomej, szybkość przepływu fazy ruchomej, temperaturę analizy itd.
Do identyfikacji związków chemicznych metodą chromatografii gazowej oraz chromatografii cieczowej stosuje się czas retencji lub zredukowany czas retencji, względny czas retencji odniesiony do retencji substancji wzorcowej oraz indeksy retencji odzwierciedlające względne położenie piku analitu w stosunku do substancji wzorcowych. Identyfikację składnika próbki wykonuje się w ten sposób, że w stałych warunkach chromatograficznych analizuje się bezpośrednio po sobie badaną próbkę oraz wzorzec (rysunek 4). Następnie porównuje się czasy retencji składników próbki oraz wzorca. Jeżeli są inne, to na pewno nie są to identyczne substancje. Jeżeli są takie same, to istnieje duże prawdopodobieństwo, że są to identyczne substancje. Jednakże niektóre związki chemiczne o różnej budowie mogą przypadkowo wykazywać taką samą retencję. Aby mieć pewność należy powtórzyć analizę jakościową stosując inne warunki chromatograficzne, to znaczy używając kolumny chromatograficznej wypełnionej fazą stacjonarną o innej polarności.