Drobnoustroje i czynniki biologiczne decydujące o postępie procesu

Świat mikroorganizmów (form żywych, niewidocznych gołym okiem [108]) bytu-jących w środowisku naturalnym – w wodzie, glebie i powietrzu – jest bardzo zróżni-cowany. Ogólnie mikroorganizmy ze względu na budowę komórki podzielono na

Protista (budowa komórki eukariotyczna) i Procaryota (budowa komórki

prokario-tyczna) [108–112]:

Do Protista należą: glony, pierwotniaki, grzyby, śluzowce (czasami zaliczane do grzybów) [109]. Do Procaryota należą: bakterie, sinice, archebakterie.

Protista są zdolne do wytwarzania błon jądrowych (mają prawdziwe jądro

komór-kowe) oraz organelli samoodtwarzających się, jak np. mitochondria. Procaryota na-tomiast nie wykształcają błon jądrowych i nie mają plastów autonomicznych charakte-rystycznych dla Protista.

Wśród Protista największy wpływ na procesy biodegradacji mają grzyby, natomiast spośród mikroorganizmów należących do Procaryota istotną rolę odgrywają bakterie.

Ocena udziału poszczególnych rodzajów bakterii i grzybów w procesie rozkładu biologicznego w środowisku naturalnym jest trudna, gdyż rozkład ten zależy zarówno

od cech charakterystycznych dla danego ekosystemu, jak i lokalnych warunków śro-dowiskowych.

W środowisku wodnym dominują bakterie. Można tu na przykład wymienić rodza-je Pseudomonas, Acinetobacter czy Bacillus. Występują one licznie również w środo-wisku glebowym [109].

W glebie zarówno bakterie, jak i grzyby występują pospolicie i biorą aktywny udział w procesie biodegradacji. Spośród grzybów obecnych w obydwu środowiskach (wodnym i glebowym) można wymienić np. Aspergillus oraz Penicillium [113].

Drobnoustroje reprezentują skrajności ewolucyjne i w ramach jednej grupy występu-je wiele dróg metabolicznych. Ze względu na typ odżywiania, bakterie i grzyby, które należą do heterotrofów, mają zdolność do wykorzystywania związków organicznych w charakterze jedynego źródła węgla i energii, dzięki czemu przyczyniają się do rozkła-du związków organicznych, zarówno naturalnych, jak i pochodzenia syntetycznego (antropogennego), oczyszczając i odtruwając środowisko naturalne. Cecha ta umożliwia wykorzystanie drobnoustrojów w praktyce, na przykład podczas biologicznego oczysz-czania ścieków, do remediacji gruntów zanieczyszczonych ksenobiotykami i w testo-wych ocenach podatności na biodegradację związków chemicznych, pozwalających przewidzieć zachowanie się badanych substancji w środowisku naturalnym.

Proces biodegradacji związków organicznych stanowiących bazowy olej smarowy to cały szereg reakcji związanych z procesami metabolizmu (przemiany materii), które zachodzą w mikroorganizmach.

Procesy i ciągi reakcji określane katabolizmem zachodzącym w komórkach mikro-organizmów, które prowadzą do rozpadu większych cząsteczek na mniejsze fragmenty z jednoczesnym zazwyczaj dostarczeniem energii, oraz szlaki reakcji określanych anabolizmem, w wyniku których biegnie synteza większych biocząsteczek z mniej-szych (wtedy zazwyczaj pochłaniana jest energia), są opisane w licznych publikacjach i opracowaniach zwartych [99, 108–116]. Opracowania te zawierają szczegółowe opisy dotyczące szlaków katabolicznych procesów degradacji węglowodanów, tłusz-czów i białek oraz ich prostych składników, takich jak glukoza, kwasy tłuszczowe i aminokwasy. W cytowanej literaturze przedstawione są opisy i ilustracje szlaków katabolicznych, które dostarczają energii oraz stanowią źródło podstawowych metabo-litów pośrednich – używanych w procesach syntezy komórkowej (a więc przemiany centralne metabolizmu – procesy amfiboliczne), jak również opis reakcji wspomaga-jących (anaplerotycznych) pozwalawspomaga-jących zachować w różnych sytuacjach ciąg reakcji szlaków amfibolicznych [113]. Dlatego, omawiając biodegradację olejów smarowych z cytowanej literatury, wykorzystano tylko niektóre pojęcia i ilustracje szlaków kata-bolicznych pozwalających wyjaśnić mechanizm rządzący procesem biodegradacji olejów i zrozumieć wpływ budowy chemicznej i właściwości bazowych olejów sma-rowych na ich biodegradowalność.

Biochemiczne transformacje związków organicznych, które mikroorganizmy wy-korzystują jako substraty pokarmowe, zachodzą z udziałem enzymów, działających

jako katalizatory reakcji biochemicznych. Większość enzymów zbudowana jest z czę-ści białkowej zwanej apoenzymem oraz częczę-ści niebiałkowej zwanej kofaktorem.

Kofaktorami mogą być albo jony nieorganiczne, takie jak Zn2+, albo małe cząstki

organiczne, tak zwane koenzymy [116].

Koenzymami są między innymi witaminy, nukleotydy adeninowe (NAD) i flawi-nowe (FAD), odgrywające istotną rolę w procesach metabolicznych [99, 108]. Każdy szlak metaboliczny obejmuje dużą liczbę reakcji enzymatycznych. Enzymy sklasyfi-kowane są w sześciu grupach określanych mianem klas, w zależności od rodzaju reak-cji, które katalizują [99, 108, 116]:

• hydrolazy – katalizują rozkład substratu po przyłączeniu wody, np.

powo-dując rozerwanie wiązań estrowych, eterowych i peptydo-wych,

• oksydoreduktazy – przenoszą elektrony i protony z substratu na akceptor, powo-dując np. utlenienie, redukcję i wprowadzenie wiązania

po-dwójnego przez oderwanie H2,

• transferazy – przenoszą określone grupy chemiczne jednego związku na

drugi, np. przeniesienie grupy fosforanowej lub aminowej,

• izomerazy – powodują przekształcenie struktury związku bez jego roz-

kładu,

• liazy – odszczepiające grupy chemiczne (bez udziału wody),

katali-zują rozszczepienie wiązań C–C, C–O, C–N, C–S, powodując

np. utratę CO₂, H₂O,

• ligazy – katalizują procesy biosyntezy i wytwarzania nowego wiązania

C–C, C–N, C–O itp., np. biorą udział w przyłączaniu CO₂.

Mikroorganizmy wytwarzają enzymy wewnątrz komórek (endoenzymy) lub na zewnątrz komórek (egzoenzymy) [99]. Liczne enzymy są produkowane przez komór-kę ciągle, w związku z tym znajdują się w komórce zawsze, niezależnie od warunków środowiska. Stanowią one stałe składniki komórki i nazywają się enzymami konstytu-tywnymi.

Najłatwiej procesom metabolicznym ulegają glukoza, kwasy tłuszczowe i białka. Jeśli ich nie ma, mikroorganizmy wykorzystują jako źródło węgla i energii związki organiczne o bardziej złożonej budowie, chociaż wymaga to skomplikowanego proce-su przygotowawczego, związanego z syntezą wielu enzymów i modyfikacją ich katali-tycznej aktywności.

Podstawowymi mechanizmami, dzięki którym następuje proces adaptacji, są

in-dukcja lub represja/derepresja specyficznych enzymów oraz zmiany genetyczne

pro-wadzące do powstania nowych możliwości metabolicznych.

Synteza wielu katabolicznych enzymów jest regulowana na drodze indukcji, co znaczy, że komórka syntezuje odpowiednie enzymy dopiero wtedy, gdy jest na nie zapotrzebowanie, gdy są potrzebne do wykorzystania pojawiającego się w środowisku związku jako substancji pokarmowej.

Podobnie w drodze represji regulowane jest wytwarzanie licznych anabolicznych enzymów, co oznacza, że nagromadzenie końcowego produktu reakcji jest sygnałem do represji, a więc do zmniejszenia szybkości syntezy wszystkich enzymów związa-nych z określonym szlakiem biosyntezy tego produktu. Natomiast pozbawienie komó-rek źródła końcowego produktu szlaku anabolicznego powoduje derepresję syntezy enzymów potrzebnych do wytwarzania tego produktu.

Regulacja syntezy enzymów może też wynikać ze zjawiska tzw. represji

katabolicz-nej [111], która zachodzi wtedy, gdy obecne są np. dwa substraty jako źródło pokarmu,

i kiedy jeden z substratów zapewnia lepszy wzrost komórek, wtedy hamowana jest syn-teza enzymów katabolicznych koniecznych do wykorzystania drugiego substratu.

Synteza enzymów de novo lub ich rozcieńczanie podczas wzrostu komórki prowa-dzi do stopniowej powolnej adaptacji do zmian warunków środowiska. O wiele szyb-sza adaptacja do nagłych wahnięć metabolicznych może być osiągnięta drogą modyfi-kacji aktywności katalitycznej enzymów. Procesy kataboliczne i anaboliczne są katalizowane przez odrębne enzymy, co umożliwia prawidłową regulację i sterowanie tymi procesami w zależności od potrzeb komórki mikroorganizmów. Ponieważ proce-sy te odbywają się wewnątrz komórek, do ich stałego podtrzymywania konieczne jest dostarczanie odpowiednich związków chemicznych ze środowiska zewnętrznego.

W przypadku bazowych olejów smarowych stanowiących mieszaninę związków chemicznych o mniej lub bardziej zróżnicowanej budowie, które jako źródło węgla i energii mogłyby zostać wykorzystane przez mikroorganizmy, musi zostać pokonana istotna przeszkoda, jaką jest ograniczona rozpuszczalność olejów w wodzie. Dlatego mikroorganizmy zmuszane są do wykształcenia kilku podstawowych mechanizmów, które umożliwiają im wykorzystanie komponentów olejowych w charakterze substratu pokarmowego.

Pierwszy z mechanizmów obejmuje biodegradację jedynie związków rozpuszczal-nych w wodzie, zdolrozpuszczal-nych do przenikania przez błonę cytoplazmatyczną. W tym przy-padku postęp biodegradacji zależy przede wszystkim od szybkości ich przechodzenia do fazy rozpuszczonej. Za rozpuszczone substancje organiczne uznawane są

substan-cje o średnicy cząstek poniżej 10–3 μm, które mogą występować w formie jonowej,

w postaci monomerów oraz niskocząsteczkowych polimerów. Substancje o średnicy

1–10^–3 μm klasyfikowane są jako substancje koloidalne, a powyżej 1 μm jako

sub-stancje o charakterze zawiesin [99]. Średnica większości bakterii nie przekracza zwy-kle 1 μm, a wymiary małych sinic, drożdży i pierwotniaków zwyzwy-kle nie przekraczają

10 μm [111]. Dlatego pobieranie związków olejowych przez komórki

mikroorgani-zmów, gdy oleje w wodzie tworzą emulsję, wymaga uruchomienia dodatkowych me-chanizmów. Na przykład krople większe od komórek bakterii są rozkładane przez bezpośredni kontakt bakterii z zawieszonymi w wodzie cząstkami związków orga-nicznych. Na ich powierzchni rozwija się populacja mikroorganizmów i w miejscu kontaktu dochodzi do przechodzenia cząstek przez błonę cytoplazmatyczną. Utyliza-cja kropel mniejszych od komórek mikroorganizmów jest możliwa dzięki procesowi

pseudosolubilizacji. Wytwarzane przez mikroorganizmy zewnątrzkomórkowe

sub-stancje powierzchniowo czynne emulgują krople o rozmiarach mniejszych niż jeden mikrometr i ułatwiają przenikanie związków przez błonę komórkową.

Zarówno wymienione mechanizmy uruchamiane przez mikroorganizmy, jak i zja-wiska selekcji i adaptacji pozwalające na rozwój mikroorganizmów w zanieczyszczo-nym środowisku umożliwiają wykorzystanie drobnoustrojów obecnych w środowisku naturalnym do procesów degradacji nie tylko cukrów prostych, kwasów organicznych czy aminokwasów, ale również związków wielkocząsteczkowych wyprodukowanych przemysłowo (tzw. ksenobiotyków). W przypadku wielu związków rozkład mikrobio-logiczny nie jest łatwy, gdyż struktura chemiczna może utrudniać ich wykorzystanie jako źródła węgla, mogą też być toksyczne dla mikroorganizmów.

Niektóre związki podlegają degradacji przez drobnoustroje jedynie wówczas, gdy występują razem z innymi substancjami. Tego typu degradacja jakiegoś związku, któ-ra sama nie podtrzymuje wzrostu komórki, ale przebiega w obecności innej degktó-rado- degrado-wanej substancji (kosubstratu), nosi nazwę kometabolizmu lub koutleniania [99–111]. W wyniku selekcji mikroorganizmów, polegającej na eliminacji gatunków wrażli-wych na toksyczne oddziaływanie wprowadzonych do środowiska związków, oraz w wyniku stopniowej adaptacji mikroorganizmów do nowego substratu wzrostowego liczebność drobnoustrojów zdolnych do rozkładu biologicznego wzrasta.

W technologiach oczyszczania opartych na procesach biologicznych często są wy-korzystywane mutanty uzyskane metodami inżynierii genetycznej, zdolne do wyjąt-kowo aktywnego rozkładu poszczególnych ksenobiotyków. Wielu badaczy wskazuje, że stosowanie drobnoustrojów tego typu jest ryzykowne, gdyż istnieje niebezpieczeń-stwo utraty możliwości sterowania ich metabolizmem w warunkach naturalnych [99].

Czynniki biologiczne mogą być także przyczyną nieprawidłowego przebiegu pro-cesu biodegradacji lub jego całkowitego zahamowania. Powszechne w środowisku wodnym i glebowym populacje drapieżników i pasożytów bakterii powodują zmniej-szenie liczebności drobnoustrojów i zdolności do odnawiania populacji.

W testach na biodegradację najczęstszą formą inokulum jest osad czynny pobiera-ny z biologiczpobiera-nych oczyszczalni ścieków, który jest zespołem mikroorganizmów, najczęściej bakterii heterotroficznych i pierwotniaków, wśród których występują orzę-ski i wiciowce. Tworzy on zawiesinę zlepionych śluzem drobnoustrojów formujących się w kłaczki, które są widoczne gołym okiem. Osad czynny jest używany przede wszystkim do biologicznego usuwania organicznych związków ze ścieków.