Podstawowe definicje i zasady oceny biodegradowalności

Biodegradacja jest procesem usuwania organicznych składników ze środowiska pod wpływem mikroorganizmów i ich enzymów funkcjonujących w danym ekosys-temie.

Badania biodegradacji pojedynczych związków organicznych, w tym węglowodo-rów i ich mieszanin, które pozwoliły uzyskać informacje o drogach ich metabolicznych przemian w środowisku naturalnym, są przedmiotem licznych publikacji i wydań książ-kowych podsumowujących ich wyniki [96–98]. Innym celem kontynuowanych badań biodegradacji substancji organicznych jest prognozowanie możliwości ich biochemicz-nego rozkładu w wodzie, gruntach i oczyszczalniach ścieków, co pozwala wyznaczać dopuszczalne stężenia substancji w wodach powierzchniowych i ściekach, a także

optymalizować warunki remediacji gruntów skażonych, np. produktami naftowymi [99, 100]. Istotne znaczenie mają również prace związane z doborem optymalnych me-tod pozwalających oceniać biodegradowalność produktów chemicznych tak, aby uzy-skiwane wyniki były porównywalne w różnych placówkach badawczych i uznawane przez organizacje wykorzystujące te wyniki do klasyfikacji produktów [6, 16].

Wzrastające zainteresowanie oceną biodegradowalności, która pozwala przewidzieć zachowanie się substancji i preparatów chemicznych w środowisku, stanowi asumpt do upowszechniania znanych w nauce i zdefiniowanych pojęć i zjawisk dotyczących bio-degradacji [99, 101–105]. Dlatego przed omówieniem standardowych metod zalecanych do oceny biodegradowalności omówiono krótko najczęściej używane pojęcia związane z procesem biodegradacji. Niektóre z nich nie są powszechnie używane i są to często tłumaczenia określeń stosowanych w literaturze anglojęzycznej.

Biodegradacja – rozkład cząsteczek i cząstek substancji w wyniku komplekso-wych oddziaływań organizmów żykomplekso-wych oraz ich enzymów.

Biodegradacja może zachodzić w środowisku tlenowym i beztlenowym, w glebie, wodzie słodkiej i morskiej. Większość testów oceniających biodegradowalność sub-stancji opracowano w celu śledzenia biodegradacji w środowisku tlenowym, definio-wanej jako:

1) usuwanie materii organicznej z roztworu w wyniku przebiegu biologicznych procesów enzymatycznego utleniania i asymilacji,

2) utylizacja substancji jako źródła energii i węgla przez mikroorganizmy (prze-kształcenie związków do niskocząsteczkowych form nieorganicznych, takich jak dwu-tlenek węgla, azotany, siarczany i woda).

Oceniając podatność na biodegradację, należy zwrócić uwagę na możliwość śle-dzenia biodegradacji wstępnej i całkowitej:

Biodegradacja wstępna (primary) – czasami określana jako biodegradacja

„pier-wotna” lub „częściowa” jest oceniana wtedy, gdy analizowany jest rozkład substancji organicznej, jaki zachodzi w stopniu wystarczającym, aby utraciła ona swoje charakte-rystyczne, pierwotne właściwości, co w praktyce oznacza ubytek związku macierzy-stego w wyniku zmian strukturalnych. Zasada ta jest stosowana w badaniach olejów smarowych w teście CEC L-33-A-93 [106].

Biodegradacja ostateczna (ultimate) – zwana też biodegradacją całkowitą (patrz

Polskie Normy) – jest oceniana, gdy analizowane jest całkowite (maksymalne) wyko-rzystanie substancji jako źródła energii i węgla przez mikroorganizmy, co w praktyce

oznacza rozkład substancji organicznej do CO2, H2O, soli mineralnych pierwiastków

wchodzących w skład substancji i biomasy.

Biodegradowalność – opisuje podatność związku na rozkład w środowisku pod

wpływem mikroorganizmów; w przypadku degradacji wstępnej – do produktów po-średnich, a w przypadku degradacji całkowitej – do dwutlenku węgla, wody, soli

mi-neralnych i biomasy (biodegradacja tlenowa) lub do CO₂, CH₄, a także NH₃ i H₂S

pro-centach obliczanych na podstawie zmian określonych wskaźników (w zależności od testu), które pozwalają śledzić postęp biodegradacji w warunkach testu.

Inokulum – mieszanina bakterii i innych mikroorganizmów używana w teście na

biodegradację. Źródło inokulum może znacząco wpływać na wyniki testu; szybkie nam-nażanie bakterii i wcześniejsza adaptacja do podobnych jak użyte w teście substancji, może zwiększyć prawdopodobieństwo zajścia degradacji. Najpowszechniejsze źródła inokulum to rzeki, morza, gleba, odpływy ścieków, odpływ osadu i osad czynny.

Adaptacja inokulum – proces, w wyniku którego mikroorganizmy adaptują się

i pomnażają swoją masę przez metabolizm substancji, z którą nigdy wcześniej nie miały kontaktu. Proces może trwać godziny, tygodnie, a w niektórych przypadkach może nie zachodzić w ogóle.

Najczęściej stosowane parametry w ocenie podatności na biodegradację to: • Teoretyczne Zapotrzebowanie Tlenu (TZT),

• Biochemiczne Zapotrzebowanie Tlenu (BZT), • Chemiczne Zapotrzebowanie Tlenu (ChZT), • Rozpuszczony Węgiel Organiczny (RWO),

• Teoretyczna ilość wydzielonego CO2 (TCO2).

7 14 21 28 B iodegr adacj a [ % ] 90 czas [dni] 100 80 70 60 50 40 30 20 10 faza adaptacji faza biodegradacji faza plateau

warunek 10-dniowego okna dla szybko biodegradowalnych

Rys. 10. Przykład krzywej biodegradacji

Wynik oceny biodegradowalności, wyrażanej w procentach, jest przedstawiany w postaci krzywej (rys. 10), na której można wyróżnić trzy zasadnicze etapy: 1) adap-tacja inokulum do substancji testowanej; 2) degradacja substancji testowanej przez

mikroorganizmy, które wykorzystują ją do własnych procesów metabolicznych, 3) fa-za plateau, w której degradacja fa-zanika.

Do oceny biodegradowalności substancji organicznej opracowano różne standar-dowe testy. Najczęściej biodegradowalność jest oceniana na podstawie standardowych testów umożliwiających analizę całkowitej tlenowej biodegradacji substancji w śro-dowisku wodnym. Największe znaczenie mają standardowe testy ISO, których proce-dury są zgodne z zalecanymi przez OECD testami, co pozwala porównywać wyniki oceny biodegradowalności.

Rys. 11. Zasady oceny tlenowej biodegradowalności substancji organicznych w środowisku wodnym w testach przesiewowych

Według OECD [107] biodegradację związków organicznych rozpuszczalnych

w wodzie i nielotnychpowinno się prowadzić z zastosowaniem testów przesiewowych

i symulacyjnych. Zasady oceny tlenowej biodegradowalności substancji organicznych w środowisku wodnym w testach przesiewowych zalecanych przez OECD przedsta-wiono na rysunku 11. Zgodnie z wytycznymi, pierwszym krokiem w ocenie dowalności substancji jest zbadanie, czy substancja jest skłonna do szybkiej biodegra-dacji. Służą do tego testy OECD 301A-F oraz OECD 310, w których stosowane są zaostrzone warunki, między innymi małe stężenia inokulum nieadaptowanego wstęp-nie do badanej substancji. Test trwa 28 dni. Gdy substancja w tych testach osiąga wy-soki wymagany poziom biodegradowalności, należy uznać, że będzie ulegać degrada-cji w środowisku w krótkim czasie. Jeśli substancja nie jest skłonna do szybkiej biodegradacji, to za pomocą testów przesiewowych OECD 302 A–C można zbadać czy wykazuje potencjalną biodegradowalność. W celu ustalenia dokładniejszych da-nych na temat szybkości degradacji substancji w środowisku lub w biologicznej oczyszczalni ścieków zalecane są testy symulacyjne OECD 303 A i B. Tak więc testy OECD, których procedury są zazwyczaj zgodne z testami ISO (tabele 4 i 5), pozwala-jące w badaniach laboratoryjnych oznaczać biodegradowalność substancji organicz-nych możemy podzielić na trzy grupy:

• testy do oceny szybkiej biodegradowalności (ready biodegrability), • testy do oceny potencjalnej biodegradowalności (inherent biodegrability), • testy symulacyjne.

Testy OECD serii 301 oraz 310 pozwalają śledzić szybką biodegradowalność oraz zakwalifikować substancję do łatwo biodegradowalnych, jeżeli osiągnie w ciągu 28 dni wymagany poziom biodegradacji, wynoszący 70% w przypadku oznaczania ubytku rozpuszczonego węgla organicznego (RWO) i 60% w przypadku oznaczania

bioche-micznego zapotrzebowania tlenu (BZT) lub wytworzonego CO₂. Żeby zakwalifikować

substancję do szybko biodegradowalnych nie wystarczy, że osiągnie ona wymagany procent biodegradacji, ale musi zostać również spełnione dodatkowe kryterium tzw. okresu 10-dniowego (10 day window), co oznacza, że od dnia, w którym 10% substancji uległo biodegradacji do uzyskania wymaganego poziomu nie powinno upłynąć więcej niż 10 dni (rys. 10). Warunek ten zazwyczaj jest bardzo trudny do spełnienia w przy-padku olejów smarowych, gdyż biodegradacji ulega nie pojedyncza substancja, lecz mieszanina związków.

Jeśli badana substancja nie kwalifikuje się do łatwo biodegradowalnych, to prowa-dzone są testy pozwalające ocenić jej potencjalną zdolność do biodegradacji.

Aktualnie proponowane są przez OECD trzy testy określające potencjalną biode-gradowalność. Należą do nich: OECD 302 A, OECD 302 B, OECD 302 C oraz opra-cowany przez CONCAWE projekt testu OECD 302 D (draft). Jednakże testy OECD 302 A i 302 B nie są wskazane dla substancji nierozpuszczalnych w wodzie.

Nato-miast test OECD 302 C (MITI II), polegający na pomiarze ubytku O₂, może być

techniczne i złożony proces przygotowania inoculum wychodzi on z użycia. Zarówno ten test, jak i test OECD 301 C (MITI-I) są powszechnie stosowane w Japonii.

W testach do oceny potencjalnej biodegradowalności stosuje się większe stężenia inokulum, które może być również adaptowane do substancji testowej i przewidziany jest też wydłużony czas testu w procedurze OECD 302D (draft). W testach serii

OECD 302 uzyskany poziom biodegradacji powyżej 20% (na podstawie pomiaru CO₂,

BZT, RWO lub ChZT) pozwala uznać substancję za potencjalnie zdolną do wstępnej

biodegradacji. Poziom biodegradacji powyżej 60%, gdy oznaczany jest CO₂ lub BZT,

oraz poziom powyżej 70%, gdy oznaczane jest RWO lub ChZT, pozwala uznać bada-ną substancję za potencjalnie zdolbada-ną do całkowitej biodegradacji.