Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie
Streszczenie. Celem badań było porównanie właściwości przeciwutleniających prepara-tów białek wyizolowanych z gryki odmiany Fagopyrum esculentum Moench oraz hydroli-zatów tych białek uzyskanych w wyniku działania pepsyny oraz proteinazy N. Właściwości przeciwutleniające preparatów zbadano oznaczając: zdolność do chelatowania żelaza(II), aktywność wobec kationorodników ABTS i wobec nadtlenków kwasu linolowego. Prze-prowadzono także podstawową charakterystykę białek i peptydów otrzymanych prepara-tów i hydrolizaprepara-tów białkowych oraz oznaczono zawartość polifenoli ogółem. Zawartość rozpuszczalnych związków peptydowych i polifenoli w hydrolizatach była większa niż w preparatach białek niehydrolizowanych, co prawdopodobnie przyczyniło się do ich lep-szej zdolności do chelatowania jonów żelaza(II). Hydrolizaty białkowe otrzymane za pomo-cą proteinazy N oraz preparaty białek charakteryzowały się mniejszą aktywnością wobec kationorodników ABTS niż hydrolizaty pepsynowe. Preparaty białek wykazywały najlepsze właściwości przeciwutleniające wobec nadtlenków w emulsji kwasu linolowego. Preparaty białkowe hydrolizowane proteinazą N działały w tym układzie reakcyjnym zdecydowanie najsłabiej. Uzyskane wyniki wskazują, że hydrolizaty i preparaty białek gryki mogą być stosowane do żywności jako naturalne składniki o właściwościach przeciwutleniających.
Słowa kluczowe: gryka, białka, hydroliza enzymatyczna, właściwości przeciwutleniające
WSTĘP
Procesy utleniania mogą wywoływać wiele niekorzystnych skutków w organizmie człowieka (uszkodzenie DNA, białek), jak i w żywności (zmiany sensoryczne, powstanie szkodliwych produktów). Zapobieganie tym reakcjom jest możliwe poprzez stosowanie i spożywanie przeciwutleniaczy, spośród których zaleca się szczególnie te pochodzenia
158 E. Worobiej, M. Sabat, M. Piecyk
Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych naturalnego [Drużyńska i in. 2015], w tym także białek i peptydów [McCarthy i in. 2013, Aluko 2015, Darewicz i in. 2015]. Ziarna gryki są dobrym źródłem zbilansowanego biał-ka, które nie zawiera frakcji glutenowych, co pozwala na wykorzystanie gryki jako skład-nika żywności funkcjonalnej m.in. dla osób cierpiących na nadwrażliwość pokarmową o podłożu nieimmunologicznym. Uznano, że białka gryki mogą nawet działać leczniczo w przypadku schorzeń, takich jak: cukrzyca, nadciśnienie tętnicze, hipercholesterolemia [Przybylski i Gruczyńska 2009]. Za efekt ten odpowiada mały stosunek aminokwasów lizyny do argininy oraz metioniny do glicyny. Zawartość białka ogółem w mące gryczanej mieści się w przedziale od 8,5 do 18,9%. Mimo że białka gryki mają korzystny skład ami-nokwasowy, to jednak charakteryzuje je relatywnie słaba strawność. Uwarunkowane jest to obecnością w ziarnie inhibitorów trypsyny oraz znacznych ilości błonnika [Krkošková i Mrázová 2005]. Skoncentrowaną i łatwiej przyswajalną formą peptydów i aminokwa-sów są hydrolizaty białkowe. Pojęciem hydrolizatu białkowego definiuje się mieszaninę polipeptydów, oligopeptydów i aminokwasów uzyskaną w wyniku częściowej hydrolizy białka. Mają one, oprócz działania fizjologicznego (m.in. aktywności antyoksydacyjnej, przeciwdrobnoustrojowej, antyamnezyjnej, opioidowej) czy budulcowego, także pozy-tywny wpływ na jakość sensoryczną spożywanych produktów – poprawiają teksturę, wa-lory smakowo-zapachowe [McCarthy i in. 2013, Darewicz i in. 2015]. Warto zaznaczyć, że hydrolizaty różnią się od białek, z których zostały otrzymane właściwościami funkcjo-nalnymi (m.in lepkością roztworów, rozpuszczalnością, zdolnością emulgowania), a także właściwościami przeciwutleniającymi, na które wpływa nie tylko obecność określonych aminokwasów i peptydów, ale także produktów reakcji Maillarda, związków fenolowych odpornych na hydrolizę oraz produktów degradacji lignin [Jędrusek-Golińska 2006]. Ce-lem badań było porównanie właściwości przeciwutleniających preparatów białek otrzy-manych z mąki gryczanej handlowej i laboratoryjnej oraz hydrolizatów tych białek.
MATERIAŁ I METODY
Materiał badawczy stanowiły ziarna gryki odmiany Fagopyrum esculentum Moench oraz mąka gryczana dostępna w handlu detalicznym. Ziarna zostały obłuszczone, na-stępnie zmielone i przesiane dwukrotnie (sito o średnicach oczek 0,250 i 0,125 mm).
Podobnie postąpiono z mąką handlową. Materiał ten posłużył do otrzymania preparatów białkowych, a następnie hydrolizatów. Preparaty otrzymywano w wyniku godzinnej eks-trakcji białek z mąki w roztworze wodnym (stosunek 1 : 10, w/v) po osiągnięciu wartości pH 8,5 i przez wytrącenie białek (pH = 4,5). Osad białek odwirowywano, a następnie zobojętniano (pH 7,0) i liofilizowano.
Hydrolizaty białkowe uzyskiwano z preparatów białek pochodzących z mąki gry-czanej handlowej oraz laboratoryjnej z zastosowaniem dwóch enzymów (przy stosunku substratu do enzymu w przeliczeniu na białko wynoszącym 100 : 1) – pepsyny (Sig-ma P7000; 806 U·mg–1) oraz proteinazy N z Bacillus subtilis (Sigma 82458; 7 U·mg–1).
Użyte w badaniach enzymy różniły się pochodzeniem, optymalnym pH działania (co ma wpływ na konformację cząsteczek białek i dostępność wiązań peptydowych), a w mniejszym stopniu specyficznością – przede wszystkim powodują rozkład wiązań utwo-rzonych przez reszty hydrofobowych aminokwasów [Rao i in. 1998]. Hydrolizę
prowa-Wpływ procesu hydrolizy enzymatycznej... 159
nr 586, 2016
dzono w łaźni wodnej (temperatura 37°C) w przypadku pepsyny w pH 2,0 uzyskanym za pomocą 0,1 mol·dm–3 HCl, w przypadku proteinazy N roztwór był zaś doprowadzany do pH 7,0 za pomocą 0,1 mol·dm–3 NaOH. Po upływie 4 h (hydroliza pepsyną) oraz 6 h (dla proteinazy N), zaobserwowano zahamowanie dynamiki reakcji i przeprowadzono in-aktywację enzymów w wyniku ogrzewania próbek w temperaturze 100°C przez 10 min.
Następnie tak otrzymany roztwór schłodzono i wirowano (10 000·g, 15 min, 4°C), a uzy-skany supernatant liofilizowano. Hydrolizę enzymatyczną białek monitorowano poprzez oznaczenie ilości uwolnionych grup α-aminowych po kolejnych okresach trawienia me-todą z aldehydem o-ftalowym (OPA, Sigma) i przy użyciu chlorku amonu N,N-dimetylo--2-merkaptoetylu jako komponentu tiolowego [Church i in. 1983].
Preparaty otrzymane z gryki oznaczono kolejno:
PH, PL: preparaty białek wyizolowanych z mąki handlowej i otrzymanej w warun-kach laboratoryjnych,
HH-P, HL-P: hydrolizaty białkowe z mąki handlowej i laboratoryjnej, uzyskane w wyniku trawienia proteinazą N,
HH-PS, HL-PS: hydrolizaty białkowe z mąki handlowej i laboratoryjnej, uzyskane w wyniku trawienia pepsyną.
W otrzymanych z mąki gryczanej preparatach i hydrolizatach białkowych oznaczono:
zawartość azotu ogółem [AOAC 1990], rozpuszczalnych związków peptydowych meto-dą Lowry’ego [Lowry i in. 1951, Fan i in. 1974], powierzchniową hydrofobowość aroma-tyczną białek i peptydów z kwasem 8-anilino-1-naftalenosulfonowym (ANSA, Sigma) metodą spektrofluorymetryczną (λwz = 390 nm i λem = 479 nm) [Hayakawa i Nakai 1985], oraz zawartość polifenoli ogółem metodą z odczynnikiem Folina-Ciocalteu’a, którą wy-rażono w ekwiwalencie kwasu galusowego jako mg·g–1 preparatu [Singleton i in. 1965].
Właściwości przeciwutleniające preparatów zbadano, oznaczając: zdolność do chela-towania jonów żelaza(II) [Lai i in. 2001], aktywność (wyrażoną w %) wobec kationorod-ników ABTS [Re i in. 1999] oraz wobec nadtlenków kwasu linolowego [Li i in. 1999].
Próbki do oznaczeń ekstrahowano odpowiednio buforem PBS i buforem fosforanowym o pH 7,0 w stosunku 1 : 10 (w/v). Wszystkie oznaczenia wykonano co najmniej w trzech powtórzeniach.
Wyniki oznaczeń poddano analizie statystycznej przy użyciu programu Statgraphics, obliczając istotności różnic między wynikami za pomocą testu Tukeya (α = 0,05) oraz współczynniki korelacji liniowej.
WYNIKI I DYSKUSJA
W tabeli przedstawiono podstawowy skład badanych w pracy preparatów białek nie-hydrolizowanych i hydrolizatów białek pochodzących z gryki.
Zawartość azotu ogółem w hydrolizatach białkowych uzyskanych przez zastosowanie zarówno proteinazy N i pepsyny była większa niż w preparatach białek. Wyniki uzyskane w oznaczeniu azotu ogółem w przypadku hydrolizatów białkowych z mąki gryczanej otrzymanych przy użyciu proteinazy N były nieco niższe w porównaniu z hydrolizatami białkowymi otrzymanymi w czasie procesu hydrolizy za pomocą pepsyny.
– – –
160 E. Worobiej, M. Sabat, M. Piecyk
Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych Jak podaje Krkošková i Mrázová [2005], podstawowe frakcje białek ziarna gryki to rozpuszczalne w roztworach soli i w wodzie albuminy oraz globuliny. Zawartość białka rozpuszczalnego wpływa m.in. na właściwości przeciwutleniające danego surowca roślinnego, co wykazali Okada i Okada [1998], badając rozpuszczalne białko wyizolowane z bobu. Wyniki oznaczenia zawartości rozpuszczalnych związków peptydowych dla pre-paratów i hydrolizatów z mąki handlowej i laboratoryjnej otrzymanych z zastosowaniem poszczególnych enzymów różniły się istotnie statystycznie. Najwięcej rozpuszczalnych związków peptydowych zawierały hydrolizaty z białek gryki uzyskane za pomocą pep-syny (58,3 i 61,9%). Preparaty z mąki laboratoryjnej i handlowej (PL i PH) zawierały najmniej rozpuszczalnych związków peptydowych, odpowiednio 43,3 i 45,9%.
W celu scharakteryzowania białek i peptydów preparatów oraz hydrolizatów z gryki wykonano oznaczenie powierzchniowej hydrofobowości aromatycznej (tab.). Najwięk-szą wartość hydrofobowości wykazywały białka preparatów z mąki handlowej i laborato-ryjnej (ok. 100 j.u. FI·%–1). Porównując uzyskane wyniki do wyników badań Wołosiaka i Worobiej [1999] dotyczących preparatów białek z nasion grochu, można stwierdzić, że powierzchniowa hydrofobowość aromatyczna białek preparatów z ziaren gryki była ponaddwukrotnie mniejsza. Średnio sześciokrotnie większe wartości tego parametru stwierdzono w badaniach preparatów białek z nasion komosy ryżowej [Worobiej i in.
2016]. Różnica między wartościami hydrofobowości uzyskanymi w przypadku prepa-ratów a hydrolizatami białkowymi z gryki była znaczna (ok. 3,5–8-krotna) i istotna sta-tystycznie. Można wysunąć wniosek, że zastosowana modyfikacja enzymatyczna białka spowodowała obniżenie powierzchniowej hydrofobowości aromatycznej. Hydrofobo-wość aromatyczna hydrolizatów z gryki była, podobnie jak w przypadku preparatów, mniejsza od wyników badań uzyskanych dla hydrolizatów białkowych z nasion grochu przez Wołosiaka i Worobiej [1999].
Tabela. Charakterystyka podstawowego składu chemicznego badanych preparatów i hydroliza-tów białek z ziaren gryki i mąki handlowej
Table. The characteristics of protein preparations and hydrolysates from buckwheat grains and commercial buckwheat fl our Objaśnienia: a–e – różnice między wartościami średnimi oznaczonymi różnymi literami są statystycznie istot-ne (p < 0,05) – Explanations: a–e differences among mean values denoted by different letters are statistically significant (p < 0.05).
Wpływ procesu hydrolizy enzymatycznej... 161
nr 586, 2016
W preparatach i hydrolizatach białkowych otrzymanych z mąki gryki oznaczono zawar-tość polifenoli, które występują w gryce w znacznych ilościach w porównaniu do typowych zbóż. Mniejszą zawartość związków polifenolowych stwierdzono w preparatach uzyska-nych zarówno z mąki gryczanej handlowej (11,27 mg·g preparatu–1), jak i z mąki labora-toryjnej (16,39 mg·g preparatu–1) niż w hydrolizatach (23,56–27,36 mg·g preparatu–1). Jak podaje Inglett i inni [2011], zawartość polifenoli w mące gryczanej mieści się w zakresie od 2 do 15 mg·g s.m.–1. Górny zakres tych danych jest zbliżony do wyników uzyskanych w pracy dla preparatów. Mąka gryczana wykorzystana do badań była oczyszczona z frakcji zewnętrznych, które są bogate w związki fenolowe. Oznacza to, że te które w niej zostały przeszły do preparatu, gdyż były silnie związane z białkiem. W badaniach białek izolowa-nych z ziaren gryki Wang i inni [2012] doszli do wniosku, że reakcja hydrolizy prowadzi do znacznego obniżenia zawartości polifenoli związanych z białkiem oraz zwiększenia za-wartości wolnych związków fenolowych. Ilość tych związków zależy od czasu hydrolizy.
Hydroliza prowadzona trypsyną przez 2–4 h wpływała na zwiększenie zawartości związ-ków fenolowych w preparatach w porównaniu z hydrolizą prowadzoną przez 1 h. W niniej-szych badaniach hydroliza pepsyną i proteinazą N białek ziaren gryki również przyczyniła się do uwolnienia związków fenolowych, gdyż znacznie większą ich zawartość oznaczono w hydrolizatach niż preparatach.
Chelatowanie jonów żelaza jest jednym z mechanizmów działania przeciwutleniają-cego peptydów [Darewicz i in. 2015]. Stwierdzono znaczące różnice w zdolności wią-zania jonów żelaza między działaniem badanych preparatów i hydrolizatów (rys. 1).
Hydrolizaty wykazywały od około czterokrotnie do ponad 20-krotnie większą zdolność chelatowania jonów żelaza(II) niż preparaty. Najsłabszymi właściwościami chelatujący-mi charakteryzował się preparat białek z mąki gryczanej handlowej (0,2 mg Fe(II)·g–1), drugi z preparatów działał zaś znacznie skuteczniej (1,41 mg Fe(II)·g–1). Hydrolizaty otrzymane za pomocą proteinazy N charakteryzowała mniejsza aktywność chelatowania żelazo niż hydrolizaty pepsynowe.
Rys. 1. Zdolność chelatowania jonów żelaza(II) przez badane preparaty i hydrolizaty białkowe z gryki
Fig. 1. Chelating ions iron(II) ability in buckwheat protein preparations and hydrolysates
162 E. Worobiej, M. Sabat, M. Piecyk
Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych Znaczne zwiększenie zdolności do chelatowania jonów żelaza po procesie hydrolizy główniej frakcji białek fasoli – fazeoliny (z 18 do 81%) oraz izolatu białek fasoli (do 23%) stwierdzili Carrasco-Castillaa i inni [2012]. Właściwości chelatowania żelaza(II) przez hydrolizaty białek ciecierzycy wykazali także w swoich badaniach Torres-Fuentes i inni [2012], przy czym były one słabsze niż w przypadku oczyszczonych frakcji peptydów.
Właściwości przeciwutleniające badano także, oznaczając aktywność przeciwrodni-kową wobec kationorodników ABTSorazaktywność wobec nadtlenków kwasu linolo-wego ekstraktów preparatów białek z ziaren gryki i ich hydrolizatów.
Największą aktywnością przeciwrodnikową wobec kationorodników ABTS charak-teryzowały się hydrolizaty białkowe uzyskane w wyniku zastosowania pepsyny – 71%
(rys. 2). Warto zauważyć, że hydrolizaty (z mąki handlowej oraz laboratoryjnej) uzyska-ne przez działanie proteinazy N wykazywały natomiast znacznie mniejszą aktywność przeciwrodnikową. Wartości te wynosiły odpowiednio: 45% dla HH-P oraz 36% dla HL-P. Zastosowanie modyfikacji enzymatycznej spowodowało w zależności od rodzaju enzymu zróżnicowany rozkład białek i odsłonięcie w różnym stopniu reszt aminokwaso-wych uczestniczących w dezaktywacji rodników. Karaś i inni [2014] także wykazali, że hydrolizaty pepsynowe otrzymane z surowych i poddanych obróbce termicznej strąków fasoli szparagowej odznaczały się lepszą aktywnością wobec rodników ABTS i DPPH niż izolaty białkowe. W badaniach produktu dwustopniowej hydrolizy białek gryki pep-syną i pankreatyną stwierdzono z kolei, że zawiera on frakcje peptydów dezaktywujące skuteczniej rodniki hydroksylowe oraz kationorodniki ABTS niż mieszanina wszystkich frakcji. Zidentyfikowanymi peptydami w tych frakcjach były: Trp-Pro-Leu, Val-Pro-Trp, Val-Phe-Pro-Trp, Pro-Trp [Ma i in. 2010].
Rys. 2. Aktywność przeciwutleniająca badanych preparatów białkowych i hydrolizatów z gryki wobec kationorodników ABTS oraz nadtlenków kwasu linolowego (LOO)
Fig. 2. Antioxidant activity of buckwheat protein preparations and hydrolysates against cation radicals ABTS and against linoleic acid peroxides (LOO)
Wpływ procesu hydrolizy enzymatycznej... 163
nr 586, 2016
W badaniu właściwości przeciwutleniających wobec nadtlenków w emulsji kwasu linolowego preparaty białek uzyskane z mąki gryczanej handlowej i laboratoryjnej wy-kazywały blisko 100% aktywność (rys. 2). Aktywność na poziomie około 100% i nie-co mniejszą – 82% uzyskano po zastosowaniu w układzie reakcyjnym hydrolizatów pepsynowych. Najmniejszą aktywność przeciwutleniającą spośród wszystkich badanych preparatów i hydrolizatów białkowych miały HH-P (38%) oraz HL-P (28%). Zastoso-wanie enzymu, którym była proteinaza N, w procesie hydrolizy przyczyniło się więc do znaczącego obniżenia zdolności inhibicji reakcji tworzenia nadtlenków w porównaniu do preparatów białek.
Występowanie w związkach pochodzenia białkowego aminokwasów aromatycznych na powierzchni cząsteczki ułatwia kontakt z kwasami tłuszczowymi i tym samym może powodować ich lepszą ochronę (aktywność przeciwutleniającą). Można sądzić, że ma to kluczowe znaczenie w większej skuteczności preparatów białek w inhibicji utleniania emul-sji kwasu linolowego. Przeprowadzona w niniejszej pracy analiza statystyczna pozwoliła wyciągnąć wnioski o pewnej korelacji (r = 0,56) między aktywnością przeciwutleniającą wobec nadtlenków w emulsji kwasu linolowego a hydrofobowością preparatów z ziaren gryki. Wyniki uzyskane przez Worobiej i innych [2016] wskazują natomiast na zależność pomiędzy zdolnością preparatów białek (izolaty z nasion komosy ryżowej) do chelatowa-nia jonów żelaza(II) a powstawaniem nadtlenków w emulsji kwasu linolowego.
Uzyskane wyniki wskazują, że hydrolizaty i preparaty białek niehydrolizowanych po-chodzących z ziaren gryki mogą być stosowane do żywności jako naturalne składniki o właściwościach przeciwutleniających, także w przypadku produktów funkcjonalnych ze względu na brak w nich frakcji glutenu i cenny skład aminokwasowy.
WNIOSKI
1. Zawartość rozpuszczalnych związków peptydowych i polifenoli ogółem w hydro-lizatach białkowych z gryki była większa niż w preparatach białek, co mogło przyczynić się do ich lepszej zdolności do chelatowania jonów żelaza(II).
2. Najlepsze właściwości przeciwutleniające wobec nadtlenków w emulsji kwasu linolowego wykazywały preparaty białek niehydrolizowanych, które miały największą powierzchniową hydrofobowość aromatyczną. Preparaty białkowe hydrolizowane prote-inazą N działały w tym układzie reakcyjnym zdecydowanie najsłabiej. Proces hydrolizy enzymatycznej białek spowodował znaczne obniżenie powierzchniowej hydrofobowości aromatycznej, przy czym nie stwierdzono jednoznacznego wpływu rodzaju użytego en-zymu na stopień tych zmian.
3. Hydrolizaty proteinazowe wykazywały znacznie słabsze właściwości przeciwu-tleniające niż hydrolizaty pepsynowe, uwzględniając wszystkie wyniki z tego zakresu badań.
4. Preparat białek wyizolowanych z mąki gryczanej uzyskanej w warunkach labo-ratoryjnych charakteryzował się lepszą zdolnością do chelatowania jonów żelaza(II) i aktywnością wobec kationorodników ABTS oraz zbliżoną aktywnością wobec nadtlen-ków kwasu linolowego w porównaniu do preparatu z mąki handlowej, jednocześnie nie zaobserwowano podobnej zależności w przypadku hydrolizatów białek tych preparatów.
164 E. Worobiej, M. Sabat, M. Piecyk
Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych LITERATURA
Aluko R.E., 2015. Amino acids, peptides, and proteins as antioxidants for food preservation.
W: red. F. Shahidi, Handbook of antioxidants for food preservation, Woodhead Publi-shing, Cambridge.
AOAC, 1990. Official methods of analysis of the association on official analytical chemists. Ken-neth, Helrich, Arlington.
Carrasco-Castillaa J., Hernández-Álvareza A.J., Jiménez-Martíneza C., Jacinto-Hernándezb C., Alaizc M., Girón-Callec J., Vioquec J., Dávila-Ortiza G., 2012. Antioxidant and metal chelating activities of peptide fractions from phaseolin and bean protein hydrolysates.
Food Chem. 135 (30), 1789–1795.
Church F.C., Swaisgood H.E., Porter D.H., Catignani G.L., 1983. Spectrophotometric Assay Using o-Phthaldialdehyde for Determination of Proteolysis in Milk and Isolated Milk Proteins.
J. Dairy Sci. 66, 1219–1227.
Darewicz M., Borawska J., Minkiewicz P., Iwaniak A., Starowicz P., 2015. Biologicznie aktywne peptydy uwalniane z białek żywności. ŻNTJ 3 (100), 26–41.
Drużyńska B., Kostrzewski K., Majewska E., Kowalska J., Derewiaka D., Ciecierska M., 2015.
Zawartość wybranych składników bioaktywnych i ich aktywność przeciwrodnikowa w kiełkach nasion. ZPPNR 583, 45–54.
Fan T,Y., Sosulski F.W., 1974. Dispersibility and isolation of protein from legume flours. Can.
Institute Food Sci. Technology J. 7 (4), 256–259.
Hayakawa S., Nakai S., 1985. Relationships of hydrophobicity and net charge to the solubility of milk and soy proteins. J. Food Sci. 50, 486–491.
Inglett G.E., Chen D., Berhow M., Lee S., 2011. Antioxidant activity of commercial buckwheat flours and their free and bound phenolic compositions. Food Chem. 125, 923–929.
Jędrusek-Golińska A., Korczak J., Białas W., Hęś M., Gramza A., 2006. Ocena właściwości przeciwutleniających hydrolizatów białkowych śruty rzepakowej w wybranych testach.
Rośliny oleiste – Oilseed Crops 27, 107–117.
Karaś M., Jakubczyk A., Szymanowska U., Materska M., Zielińska E., 2014. Antioxidant activity of protein hydrolysates from raw and heat-treated yellow string beans (Phaseolus vul-garis L.). Acta Sci. Pol., Technol. Aliment. 13 (4), 385–391.
Krkošková B., Mrázová Z., 2005. Prophylactic components of buckwheat. Food Res. Inter. 38, 561–568.
Kuo J.-M., Yeh D.-B., Pan B.S., 1999. Rapid photometric assay evaluating antioxidative activity in edible plant material. J. Agric. Food Chem. 47, 3206–3209.
Lai L.S., Chou S.T., Chao W.W., 2001. Studies on the Antioxidative Activities of Hasian-tsao Leaf Gum. J. Agric. Food Chem. 49, 963–968.
Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A., Randall R.J., 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193 (1), 265–75.
Ma Y., Xiong Y. L., Zhai J., Zhu H., Dziubla T., 2010. Fractionation and evaluation of radical scavenging peptides from in vitro digests of buckwheat protein. Food Chem. 118 (3), 582–588.
McCarthy A.L., O’Callaghan Y.C., O’Brien N.M., 2013. Protein hydrolysates from agricultural crops – bioactivity and potential for functional food development. Agriculture 3, 112–
–130.
Okada Y., Okada M., 1998. Scaveniging Effect of water Soluble Protein in Broad Beans on Free Radicals and Active Oxygen Species. J. Agric. Food Chem. 46, 401–406.
Przybylski R., Gruczyńska E., 2009. A review of nutritional and nutraceutical components of buck-wheat. Eur. J. Plant Sci. Biotechnol. 3, 10–22.
Wpływ procesu hydrolizy enzymatycznej... 165
nr 586, 2016
Rao M.B., Tanksale A.M., Ghatge M.S., Deshpande V.V., 1998. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (3), 597–635.
Re R., Pellergrini N., Proleggente A., Pannala A., Yang M., Rice-Evans C., 1999. Antioxidant activ-ity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Rad. Biol. Med.
9–10, 1231–1237.
Singleton V.L., Rossi J. A., 1965. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybolic – phos-photungastic acid reagents. Am. J. Enol. Viticult. 16, 144–158.
Torres-Fuentes C., Alaiz M., Vioque J., 2012. Iron-chelating activity of chickpea protein hydroly-sate peptides. Food Chem. 134, 1585–1588.
Wang X.Y. Tang C.H., 2012. Physicochemical and antioxidant properties of trypsin-modified buck-wheat protein isolates. Food Technol. Biotechnol. 50 (1), 17–24.
Worobiej E., Kaliszuk P., Piecyk M., 2016. Porównanie właściwości przeciwutleniających prepara-tów białek z nasion komosy ryżowej, Bromat. Chem. Toksykol. 49, 3, 437–441.
Wołosiak R., Worobiej E., 1999. Aktywność antyoksydacyjna izolatu i hydrolizatów białek grochu.
ŻNTJ 3 (20) [supl.], 105–111.
INFLUENCE OF ENZYMATIC HYDROLYSIS ON THE ANTIOXIDANT PROPERTIES OF PROTEIN PREPARATIONS FROM BUCKWHEAT
Summary. The aim of this study was to compare the antioxidant properties of protein preparations isolated from buckwheat and hydrolysates of these proteins achieved due to the reaction of pepsin and proteinase N. The research material consisted of buckwheat grain of Fagopyrum esculentum Moench cv. from the cultivation in Poland, from which the flour was produced in the laboratory, as well as buckwheat flour available on markets. Both types of flour were subjected to obtain the protein preparations. To produce buckwheat protein hydrolysates, two enzymes were used: pepsin and proteinase N. Hydrolysis of the isolate using pepsin was carried out for 4 h, while proteinase N was applied – for 6 h. Basic characteristics of the resulting protein preparations and hydrolysates included determination of: the content of total nitrogen, soluble peptide compounds, surface aromatic hydrophobicity of protein-origin compounds, and content of total polyphenols. The antioxidant properties of preparations were examined by determining: the ability to chelate iron(II) ions, activity against cation radicals ABTS, and against linoleic acid peroxides. Contents of soluble peptide compounds and polyphenols in protein hydrolysates from buckwheat was higher than in the preparations, which probably contributed to their better ability to chelate the iron(II) ions. The protein hydrolysates produced by means of proteinase N demonstrated lower activity against cation radicals ABTS and chelating properties than hydrolysates obtained by the application of pepsin. Buckwheat protein preparations deactivated the cation radicals ABTS to a lesser extent than pepsin hydrolysates.
The process of enzymatic protein hydrolysis resulted in a decrease (up to eight-fold) of the surface aromatic hydrophobicity, wherein there was no any clear influence of the type of enzyme used on the degree of these changes. The best antioxidant properties against peroxides in linoleic acid emulsion were showed by protein preparations having the highest surface aromatic hydrophobicity. Protein preparations hydrolyzed using proteinase N had
The process of enzymatic protein hydrolysis resulted in a decrease (up to eight-fold) of the surface aromatic hydrophobicity, wherein there was no any clear influence of the type of enzyme used on the degree of these changes. The best antioxidant properties against peroxides in linoleic acid emulsion were showed by protein preparations having the highest surface aromatic hydrophobicity. Protein preparations hydrolyzed using proteinase N had