KONTROLA PLOIDALNOŚCI I ZAWARTOŚCI JĄDROWEGO DNA

Zmiany ploidalności to jedna z najczęściej obserwowanych zmian u roślin uprawia-nych in vitro [Hirano i in. 2005]. Zmiany w obrębie DNA materiału roślinnego podda-nego krioprezerwacji mogą mieć zarówno charakter ilościowy, jak i jakościowy. Mogą skutkować zmianą liczby chromosomów (rzadziej zmianą ich kształtu lub wielkości), a w konsekwencji ploidalności roślin, co może być wykryte na drodze kariotypowania lub cytometrii przepływowej (FCM). Cytometria przepływowa wykorzystuje prostą za-leżność między intensywnością fluorescencji a zawartością DNA. Zawartość DNA okre-ślana jest na podstawie pomiarów emisji fluorescencji fluorochromu (zwykle DAPI) w uwolnionych jądrach komórkowych. Pierwszy cytometr zbudowano w okresie II wojny światowej. Od tego czasu technika ta wykorzystywana jest w symultanicznej ocenie wielu parametrów komórek (ziarnistości, średnicy) i innych cząstek zawieszonych w płynnym medium [Pasqual i in. 2012]. Analizy kariotypu natomiast ze względu na często spoty-kaną dużą liczbę i niewielki rozmiar chromosomów oraz trudności w przygotowywaniu preparatów stosowane są rzadko. Zdarza się także, że komórki mogą różnić się tymi pa-rametrami. Przykładowo większość komórek Chrysanthemum ×grandiflorum ‘Princess Anne’ zawierała standardowo 54 chromosomy, ale były też z 51 lub 55 chromosomami [Dowrick i El-Bayoumi 1966]. Z tych względów częściej w badaniach wykorzystuje się cytometrię przepływową.

Badanie wielkości genomów ma duże znaczenie w cytotaksonomii, a także w oce-nie odporności roślin na niskie temperatury oraz inne źródła stresu. Znalazły one także zastosowanie w kriobiologii. Zawartość DNA jest jednym z parametrów określanych w materiale roślinnym poddanym krioprezerwacji. Dotychczasowe badania wskazują, że ploidalność i zawartość DNA raczej nie ulegają modyfikacjom [Bi i in. 2016]. Mi-krosadzonki Grammatophyllum speciosum uzyskane z eksplantatów zamrożonych tech-niką kropli-witryfikacji, kapsułkowania-witryfikacji oraz kapsułkowania-dehydratacji poddane analizie cytometrycznej nie wykazały żadnych zmian ploidalności [Sopalun i in. 2010]. Lee i inni [2011] przeprowadzili analizy porównawcze, które wykluczyły pojawienie się jakiejkolwiek zmienności na poziomie fenotypu oraz w zawartości DNA między mrożonymi i kontrolnymi roślinami Chrysanthemum ×grandiflorum ‘Peak’.

Przeprowadzone analizy cytometryczne nie wykazały także żadnych zmian poziomu ploidalności przechowywanego materiału Solanum tuberosum [Zarghami i in. 2008].

W przypadku goryczek nie odnotowano również zmian wielkości genomu [Mikuła i in. 2008]. W przypadku Cocos nucifera krioprezerwacja nie doprowadziła do zmian liczby chromosomów, ich typu, długości ramion krótkich, stosunku długości ramion i indeksu centromerowego. Analizy idiogramów wykazały większy udział ciemnych prążków (wynikających z denaturacji białek) w materiale wyizolowanym z zarodków zygotycznych przechowywanych w ciekłym azocie [Rival i in. 2010]. Z kolei rośliny uzyskane z kapsułkowanych i mrożonych nasion Cyrtopodium hatschbachii były sta-bilne na poziomie kariotypu i fenotypu, jednak cechowały się mniejszą kondensacją chromatyny na początku rozwoju [Surenciski i in. 2007]. Cytometria przepływowa, mimo że jest prosta i szybka, nie pozwala na wykrycie zmian w sekwencji DNA po-wstałych na przykład w wyniku rearanżacji czy mutacji punktowych, których źródłem są substytucje, delecje czy inwersje.

112 D. Kulus

Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych STABILNOŚĆ GENETYCZNA I EPIGENETYCZNA

Wśród mikrosadzonek utrzymywanych in vitro zmiany genetyczne zachodzą częściej niż w przypadku roślin uprawianych ex vitro. Wynika to z działania licznych czynników stresowych związanych z izolacją eksplantatu oraz nienaturalnymi warunkami uprawy w szkle. Stąd uzyskane w kulturze in vitro rośliny różnią się czasami od roślin wyjścio-wych. Zmienność występująca wśród roślin otrzymywanych in vitro zwana jest zmienno-ścią somaklonalną, a same rośliny – somaklonami. Warunkowana jest ona przez genotyp i indukowana czynnikami stresowymi. Zmienność taka może ujawniać się samoczynnie lub być indukowana de novo warunkami kultury. Stwierdzono ją u wielu gatunków roślin. Dotyczyła niemal wyłącznie genomowego DNA, zdecydowanie rzadziej spotyka się ją w plastomie [Malepszy i in. 1989].

Zmienność somaklonalną indukowaną w kulturach in vitro można ograniczyć, za-bezpieczając tkanki w ciekłym azocie. Doskonałym przykładem może być Wasabia ja-ponica. U tego gatunku nie zaobserwowano różnic między roślinami utrzymywanymi przez krótki czas in vitro oraz tymi przechowywanymi w LN przez 2 h. Podczas gdy po 10 latach przechowywania tkanki w LN odtworzone rośliny wciąż były identyczne z kontrolami, to w przypadku mikrosadzonek pochodzących z 10-letniej kultury wykryto mutacje [Maki i in. 2015]. Zahamowany metabolizm oraz brak pasaży znacząco ogra-niczają ryzyko wystąpienia genetycznej i epigenetycznej zmienności. Przyjmuje się, że jedynie promieniowanie jonizujące może być uznane za przyczynę niewielkich zmian genetycznych w czasie długoterminowego przechowywania w LN [Grout 1995], Aronen i inni [1999] sugerują, że krioprezerwacja przez eliminację zmutowanych komórek może wręcz redukować naturalną zmienność genetyczną.

Jednak pomimo że samo utrzymywanie materiału roślinnego w LN najprawdopo-dobniej nie jest przyczyną zmian, to mogą one wystąpić na etapie procedury przygo-towywania tkanki na przykład w czasie dehydratacji, traktowania krioprotektantami (DMSO, glikol etylenowy – co może być przyczyną stresu oksydacyjnego) czy prowa-dzenia kultur pre- i post-mrożeniowej. Istnieją doniesienia informujące o pojawiającej się zmienności po rozmrożeniu [Castillo i in. 2010]. Jej podłoże może być genetyczne i/lub epigenetyczne i objawiać się w formie zmiany poziomu metylacji DNA, rearan-żacji chromosomów i/lub mutacji punktowych [Mikuła 2010], co zaobserwowano na przykład u Chrysanthemum ×grandiflorum [Martín i González-Benito 2009]. Castillo i inni [2010] sugerują wręcz, że śmiertelność, obserwowana wśród mrożonych eksplan-tatów lub brak dalszego wzrostu żywego materiału po rozmrożeniu mogą być wywołane nagromadzonymi letalnymi zmianami genetycznymi. Niektóre genotypy są szczególnie podatne na jej wystąpienie. Zmienność ta ma niewielkie znaczenie, o ile nie dotyczy ważnych komercyjnie cech.

W wielu pracach poświęconych badaniom wpływu mrożenia na stabilność genetycz-ną różnych gatunków nie stwierdzono żadnych zmian [Harding 2010, Rival i in. 2010].

Analizy molekularne RAPD dostarczyły dowodów na obecność identycznych z kontrolą wzorów prążkowych w mrożonych protokormach Vanda coerulea oraz uzyskanych z nich mikrosadzonek [Jitsopakul i in. 2009]. Zarghami i inni [2008] określili wpływ kriopre-zerwacji na stabilność genetyczną Solanum tuberosum. Uzyskane po zabiegu mrożenia mikrosadzonki ‘Agria’ w 97% były identyczne z próbami kontrolnymi, a w przypadku

Stabilność materiału roślinnego po krioprezerwacji 113

nr 586, 2016

odmiany ‘Morphona’ stwierdzono 100% homologię. Harding [1991] nie stwierdził rów-nież zmienności w obrębie genów kodujących rybosomalne RNA tego gatunku po mro-żeniu, pomimo jej wystąpienia po przechowywaniu materiału roślinnego w warunkach spowolnionego wzrostu w kulturze in vitro. Niewielkie mutacje obserwowane są rzadko [Antony i in. 2012]. U Carica papaya stosując markery RAF (Randomly amplified DNA fingerprinting), wykryto zmienność na poziomie 0,0–8,3% na etapach wzrostu in vitro, aklimatyzacji oraz uprawy polowej [Kaity i in. 2009]. W przypadku osobników Pistacia vera współczynnik podobieństwa wyniósł 0,978. Tę niewielką zmienność autorzy tłuma-czą toksycznym wpływem krioprotektantów (PVS2).

Nie odnotowano negatywnego wpływu krioprezerwacji na ekspresję transgenów [Wang i in. 2012]. Zmodyfikowane genetycznie komórki zawiesinowe Oryza sativa podda-ne prekulturze roztworem 0,5 M sacharozy i zabezpieczopodda-ne mieszaniną krioprotektantów (1,0 M sacharoza, 1,0 M glicerol i 1,0 M DMSO) przeżyły mrożenie w 88%, zachowując przy tym stabilną ekspresję zrekombinowanej ludzkiej cytotoksyny hCTLA41g [Cho i in.

2007]. Podobnie było w przypadku transgenicznych zarodków Quercus suber odpornych na herbicydy trzy miesiące po rozmrożeniu [Álvarez i in. 2007].

Poszczególne techniki kiroprezerwacji mogą różnić się między sobą pod względem skuteczności w zabezpieczaniu stabilności materiału roślinnego. Martín i inni [2011] wy-korzystując markery RAPD oraz AFLP, przeanalizowali stabilność genetyczną Chrysan-themum ×grandiflorum po kolejnych etapach procedury kapsułkowania-dehydratacji pą-ków wierzchołkowych. Badania te wykazały pojawienie się zmienności już pod wpływem szoku osmotycznego (wysokiego stężenia sacharozy), tj. jeszcze na etapie przedtrakto-wania materiału. Wykorzystując natomiast technikę witryfikacji i kropli-witryfikacji, nie zaobserwowano polimorficznych prążków [Martín i González-Benito 2005, Popova i in.

2010]. W przypadku storczyka Dendrobium protokormy poddane krioprezerwacji meto-dą kapsułkowania-dehydratacji (w przeciwieństwie do witryfikacji) także nie zachowały stabilności genetycznej [Poobathy i in. 2013]. Z kolei w przypadku mieszańców Populus, wykorzystując markery RAPD, nie wykazano polimorfizmów ani w przypadku techniki powolnego schładzania, ani po witryfikacji [Jokipii i in. 2004]. Dane te wskazują, że technika kapsułkowania-dehydratacji może nie w pełni zabezpieczać materiał roślinny.

Skutki rearanżacji genetycznych mogą być niewidoczne we wszystkich etapach roz-woju rośliny, lecz zmieniać się w czasie [Antony i in. 2015]. Interesujące wyniki badań uzyskano w przypadku Picea glauca oraz Rubus grabowskii, u których polimorfizmu produktów RAPD oraz AFLP nie zaobserwowano bezpośrednio po rozmrożeniu mate-riału roślinnego, lecz po kilku miesiącach od odtworzenia roślin w kulturze in vitro [De Verno i in. 1999, Castillo i in. 2010]. Zmienność ta cofnęła się po przeniesieniu roślin do warunków polowych. Podobnie u jednego z mrożonych zarodków somatycznych Quer-cus robur wykryto polimorfizm w produktach RAPD, który nie był obecny w zregenero-wanej roślinie [Sánchez i in. 2008]. Stwierdzono także, że polimorfizm u Picea glauca obserwowany był jedynie wśród tych drzew, które rozwinęły się ze zdeformowanych, nieprawidłowo rozwiniętych zarodków. U drzew uzyskanych z typowych zarodków zmian nie obserwowano [De Verno i in. 1999]. Prowadzi to do wniosku, że już na podsta-wie deformacji zarodków można podejrzewać wystąpienie mutacji także w uzyskanych z nich roślinach. W przypadku Dendrobium ‘Bobby Messina’ wśród protokormów pod-danych krioprezerwacji techniką witryfikacji markery RAPD wykryły 10%

polimorficz-114 D. Kulus

Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych nych prążków trzy miesiące po rozmrożeniu [Antony i in. 2012], zaś w zregenerowanych z nich 18-miesięcznych roślinach nawet 40% [Antony i in. 2015].

Analiza zmienności sekwencji nukleotydowej DNA jest istotnym elementem oceny materiału roślinnego po krioprezerwacji. O ile zmiany fenotypowe mogą mieć odwracal-ny charakter (jako odpowiedź na stres), o tyle zmiaodwracal-ny na poziomie genetyczodwracal-nym pozo-stawiają trwałe piętno [Wilkinson i in. 2003]. Wadą markerów molekularnych jest jednak analiza niewielkiego obszar genomu. Należy mieć także na uwadze, że zmiany sekwencji DNA nie muszą rzutować na fenotyp rośliny, na przykład jeśli mają one miejsce w ob-szarach niekodujących – intronach [Kaity i in. 2008, 2013]. W związku z tym zaleca się stosowanie więcej niż jednego typu markerów molekularnych. Martín i inni [2011] anali-zując zmienność chryzantem uzyskanych z pąków wierzchołkowych poddanych kriopre-zerwacji techniką kapsułkowania-dehydratacji, zastosowali markery RAPD oraz AFLP.

Te pierwsze wykryły 5,8% polimorfizmów, a drugie – aż 40,1%.

Analiza zmienności epigenetycznej odgrywa także istotną rolę w badaniu stabilności przechowywanego w LN materiału. W poddanych krioprezerwacji 12 genotypach Citrus nie stwierdzono zmian ploidalności ani zmian w obrębie sekwencji DNA (RAPD), wystą-piły one jednak w poziomie metylacji cytozyny [Hao i in. 2002b]. Podobnie Revilla i inni [2009] stosując markery RAPD oraz REMAP (Retrotransposon Microsatelite Amplified Polymorphism), nie wykazali żadnych zmian genetycznych nawet po 12 cyklach mikro-rozmnażania odtworzonych w kulturze post-mrożeniowej roślin Humulus lupulus. Analiza MSAP (Methylation Sensistive Amplification Polimorphism) wykazała z kolei zmiany o podłożu epigenetycznym dotykające prawie 30% amplikonów w roślinach utrzymy-wanych w kulturze in vitro w porównaniu z profilami uzyskanymi w polowych roślinach donorowych. U Chrysanthemum ×grandiflorum obserwowano obniżenie poziomu mety-lacji po krioprezerwacji [Martín i González-Benito 2006]. W przypadku krioprezerwacji techniką witryfikacji stożków wzrostu 12 genotypów Carica papaya uzyskano zmienność DNA na poziomie 0–10,07% oraz metylacyjną w zakresie 0,52–6,62% [Kaity i in. 2008].

W przypadku rodzaju Ribes stwierdzono, że u gatunków o małej kriotolerancji dochodzi do obniżenia poziomu metylacji cytozyny w trakcie kolejnych etapów procedury kapsuł-kowania-dehydratacji. Rzecz ma się odwrotnie u gatunków o dużej kriotolerancji, u któ-rych metylacja zachodzi de novo [Johnston i in. 2009]. Mikuła i Rybczyński [2009] oraz Mikuła i inni [2011a] zaobserwowali z kolei w obrębie zawiesin komórkowych Gentiana cruciata i G. tibetica mniejsze zachwiania poziomu metylacji DNA u roślin mrożonych niż u nietraktowanych kontroli. W przypadku Cocos nucifera krioprezerwacja zarodków zygotycznych techniką suszenia również nie wywołała zmian epigenetycznych [Rival i in. 2010].

Zmienność epigenetyczna ujawnia się w trakcie odtwarzania kultury, a nawet na eta-pie aklimatyzacji [Johnston i in. 2009]. Do tej pory sądzono, iż zmiany wzorów metylacji są niedziedziczne. Jednak wyniki badań uzyskanych przez Vázquez [2007] podważają to założenie. Zmiana poziomu metylacji DNA (cytozyny) może prowadzić do zaburzeń struktury chromatyny, a tym samym ekspresji genów związanych z rozwojem rośliny – różnicowaniem tkanek i organów [Wang i He 2009]. Mikuła i inni [2011b] zaobser-wowali na przykładzie roślin otrzymanych z zawiesin komórkowych Gentiana kurroo, że zmiany poziomu metylacji mogą być źródłem większej zmienności niż mutacje w obrębie sekwencji DNA. W przypadku zarodków somatycznych Theobroma cacao

Stabilność materiału roślinnego po krioprezerwacji 115

nr 586, 2016

krioprezerwacja przyczyniła się do większych zamian w poziomie metylacji cytozyny niż sama kultura in vitro. Zmienność ta spotęgowała się po regeneracji wtórnych zarod-ków z rozmrożonych tkanek [Adu-Gyamfi i in. 2016]. Zmiany te nie muszą znajdować odzwierciedlenia w fenotypie. Koniecznym jest wówczas zweryfikowanie, czy mają one charakter dziedziczny oraz czy mogą ulegać akumulacji po kilkakrotnie powtórzonym zabiegu mrożenia [Wang i He 2009]. Stwierdzono bowiem, że zmiany poziomu metylacji mogą ulegać przynajmniej częściowemu odwróceniu w trakcie prowadzenia kolejnych pasaży [Johnston i in. 2009, Adu-Gyamfi i in. 2016]. Stabilność epigenetyczna (wzory metylacji) może zostać zweryfikowana z wykorzystaniem techniki CRED-RA (Coupled Restriction Enzyme Digestion and Random Amplification). Istota tej techniki polega na wykorzystaniu enzymów restrykcyjnych, których aktywność nukleolityczna zależy od poziomu metylacji DNA.

Według Kaity i innych [2009] przyczyną wykrywania polimorfizmów przez markery molekularne może być wiązanie lub dysocjacja regulatorowych białek, które w ten spo-sób wpływają na hybrydyzację odcinków starterowych i/lub czynników transkrypcyj-nych. González-Arnao i inni [2009] poddali analizie proteomicznej pąki wierzchołkowe Vanilla planifolia po zastosowaniu techniki kropli-witryfikacji. Zaobserwowali zmiany ilościowe wśród 15 wyizolowanych białek (13 zwiększyło, a 2 obniżyły poziom eks-presji) po traktowaniu PVS3. Odnotowano też zmiany jakościowe dwóch białek. Takie zmiany aktywności mogą być jednak traktowane jako typowa reakcja komórek na stres.

Inną przyczyną obserwowanych po rozmrożeniu zmienności może być pośrednia re-generacja organów przez kalus [Castillo i in. 2010]. Formowaniu kalusa sprzyjają błędy w izolacji eksplantatów i uszkodzenie tkanek. Kalogenezie może towarzyszyć zakładanie się merystemoidów de novo (nieposiadających typowej warstwowej struktury tuniki i korpusu) oraz regeneracja pędów przybyszowych, co sugeruje niepełne zabezpieczenie tkanek [Wilkinson i in. 2003]. Wiadomo, iż komórki roślinne regenerujące przez kalus nie gwarantują zachowania stabilności genetycznej. Stwierdzono u nich występowanie bardzo szerokiego spektrum aberracji chromosomowych: pęknięć, delecji, translokacji, obecności fragmentów acentrycznych i policentrycznych, pierścieni, mikrojąder oraz licznych zaburzeń w rozchodzeniu się chromosomów w trakcie cyklu komórkowego, a w efekcie powstania poliploidów: aneuploidów lub euploidów [Malepszy i in. 1989].

W związku z tym można spodziewać się, że procedury krioprezerwacji/regeneracji in vitro, które wiążą się z obecnością tej tkanki, nie będą gwarantowały utrzymania stabil-ności materiału roślinnego, tak jak w przypadku Oryza rufipogon [Zeliang i in. 2010].

W wielu pracach dotyczących krioprezerwacji nie odnotowano powstawania kalusa. Jego obecność stwierdzono jednak m.in. w przypadku Cosmos atrosanguineus [Wilkinson i in.

2003] oraz Chrysanthemum ×grandiflorum, która była poddana krioprezerwacji techni-ką powolnego schładzania [Fukai i in. 1991, 1994]. Rozwojowi kalusa można zapobiec przez minimalizowanie stężeń regulatorów wzrostu użytych w pożywce.

Szczególnym przypadkiem są niestabilne chimeralne odmiany otrzymywane na dro-dze hodowli mutacyjnej, bardzo popularne wśród roślin ozdobnych (Pelargonium spp., Datura spp., Chrysanthemum ×grandiflorum, Taxus baccata, Laburnocytisus adamii, Epipremnum aureum, Euphorbia pulcherrima, Ficus benjamina, Saintpaulia ionantha i in.), które są bardziej narażone na wystąpienie zmienności (wynikającej z niejednorodnej struktury genetycznej takich organizmów). Może się ona nasilać, zwłaszcza gdy

regene-116 D. Kulus

Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych racja następuje przez kalus – dochodzi do rearanżacji warstw histogenowych wskutek uszkodzeń mrożeniowych komórek i następuje po tym krioselekcja [Hao i in. 2002a].

Gatunki te wymagają szczególnego dopracowywania procedury krioprezerwacji. Jak do tej pory jednak niewiele uwagi poświęcono badaniom nad stabilnością genetyczną chimer poddanych mrożeniu. Wpływ krio-uszkodzeń na genom tej grupy roślin często pozostaje nieznany. Gatunki z rodzajów Begonia [Burritt 2008], Dianthus [Halmagyi i Deliu 2007]

oraz Pelargonium [Grapin i in. 2011] poddane krioprezerwacji nie były badane na pozio-mie molekularnym. Badania takie przeprowadzili Martín i González-Benito [2005], Lee i inni [2011] oraz Martín i inni [2011] z wykorzystaniem Chrysanthemum ×grandiflorum, nie podając jednak, czy badane przez nich odmiany są chimerami. Ponadto wykorzystali oni tylko markery RAPD, których wiarygodność i powtarzalność są kwestionowane [Antony i in. 2012].