STABILNOŚĆ METABOLICZNA

Zachowanie tego samego poziomu syntezy metabolitów wtórnych w danych wa-runkach środowiskowych może być uznane za marker stabilności genetycznej, ważny zwłaszcza w przypadku roślin leczniczych. Dixit i inni [2003] nie stwierdzili wpływu krioprezerwacji embriogenicznej tkanki Dioscorea bulbifera techniką kapsułkowania-de-hydratacji na jej zdolność do produkcji diosgeniny – steroidu o właściwościach cytotok-sycznych. Także dwustopniowe mrożenie nie wpłynęło na zdolność syntezy leczniczych alkaloidów u Catharanthus roseus [Chen i in. 1984]. U Chrysanthemum ×grandiflorum krioprezerwacja techniką kropli witryfikacji nie wpłynęła ani na zawartość jakościową,

118 D. Kulus

Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych ani ilościową metabolitów wtórnych [Bi et al. 2016]. Witryfikacja pąków wierzchołko-wych Hypericum perforatum nie doprowadziła także do zmiany zawartości leczniczej hiperycyny [Skyba i in. 2010]. Istnieją jednak doniesienia na temat wpływu krioprezer-wacji na aktywność metaboliczną komórek. U Chrysanthemum cinerariaefolium zaob-serwowano zwiększoną produktywność insektycydu pyretryny po mrożeniu w LN [Hitmi i in. 1997]. Stąd istnieje potrzeba monitorowania także zawartości metabolitów wtórnych w mrożonych tkankach.

PODSUMOWANIE

Krioprezerwacja, mimo że uważana jest za najbardziej przyszłościową metodę ochro-ny zasobów genowych, może sporadycznie przyczyniać się do wystąpienia zmienności genetycznej lub częściej epigenetycznej w obrębie przechowywanych prób. Trwałość i wielkość tych zmian jest różna i zależy od skuteczności zabezpieczenia tkanek. Wpły-wają na nie także indywidualne właściwości genotypu. Z tych powodów stabilność ma-teriału powinna być analizowana po każdorazowym wprowadzeniu do ciekłego azotu nowego materiału biologicznego lub po zastosowaniu nowych procedur krioprezerwacji.

Do tej pory najwięcej uwagi poświęcono chryzantemie wielkokwiatowej. Dotychcza-sowa analiza opublikowanych prac wskazuje, że technika kapsułkowania-dehydratacji (bazująca na silnym odwodnieniu tkanek bez użycia krioprotektantów) jest tą, która po-woduje największą zmienność (zwłaszcza gdy jej warunki są niedostatecznie dobrane i powodują nadmierną dehydratację). Analizując materiał roślinny, należy pamiętać, iż nie ma jednego uniwersalnego narzędzia oceny stabilności. Każdy z opisanych markerów ma określone wady i zalety. W efekcie brakuje kompleksowej informacji na temat stabil-ności materiału biologicznego poddanego mrożeniu, ponieważ w prowadzonych bada-niach (jeśli w ogóle) stosuje się niedostateczną liczbę metod oceny. Zwykle są to markery molekularne. Wskaźniki te są wiarygodne, gdyż ich ekspresja jest niezależna od czynni-ków środowiskowych. Ich zaletą jest też duża czułość, dokładność oraz fakt, iż wymagają one niewielkich ilości (15–25 ng) materiału genetycznego [Wilkinson i in. 2003]. Należy przy tym podkreślić, że zmiany na poziomie DNA niekoniecznie muszą ujawniać się na poziomie fenotypu i vice versa. Dlatego analizując stabilność poddanych krioprezerwacji prób, warto uwzględnić więcej niż jeden marker. Niezależnie od banku LN, w przypadku szczególnie popularnych odmian przynajmniej niewielką ilość materiału warto jest także utrzymywać w kulturze in vitro i w banku polowym.

Podziękowania

Praca naukowa finansowana w ramach programu Ministra Nauki i Szkolnictwa Wyż-szego pod nazwą „Iuventus Plus” w latach 2015–2017, projektu IP2014 023373.

Stabilność materiału roślinnego po krioprezerwacji 119

nr 586, 2016 LITERATURA

Adu-Gyamfi R., Wetten A., Lopez C.M.R., 2016. Effect of cryopreservation and post-cryopreserva-tion somatic embryogenesis on the epigenetic fidelity of cocoa (Theobroma cacao L.).

Plos One, doi: 10.1371/journal.pone.0158857.

Ai P.F., Lu L.P., Song J.J., 2012. Cryopreservation of in vitro-grown shoot-tips of Rabdosia rube-scens by encapsulation-dehydration and evaluation of their genetic stability. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 108, 381–387.

Álvarez R., Revilla M.A., Ordás R.J., 2007. Transgene stability in cryopreserved cork oak somatic embryos. Cryopreservation of Crop Species in Europe, Oviedo, 46–47.

Antony J.J.J., Poobathy R., Danial M., Sinniah U.R., Subramaniam S., 2012. Polymorphism analy-sis of cryopreserved Dendrobium Bobby Messina protocorm-like bodies (PLBs) using RAPD markers. Plant Omics 5, 427–431.

Antony J.J.J., Wai L.K., Oyunbileg Y., Subramaniam S., 2015. Characterization of the second gen-eration cryopreserved Dendrobium Bobby Messina using histological and RAPD analy-ses. Mongolian J. Biol. Sci. 13(1–2), 13–18.

Aronen T.S., Krajnakova J., Haggman H., Ryynänen L., 1999. Genetic fidelity of cryopreserved embryonic cultures of open-pollinated Abies cephalonica. Plant Sci. 142, 163–172.

Berjak P., Bartels P., Benson E.E., Harding K., Mycock D.J., Pammenter-Sershen N.W., Wesley-Smith J., 2011. Cryoconservation of South African plant genetic diversity. In Vitro Cell.

Dev. Biol. – Plant 47, 65–81.

Bi W.-L., Pan C., Liu J., Wang Q-C., 2016. Greenhouse performance, genetic stability and bio-chemical compounds in Chrysanthemum morifolium ‘Hangju’ plants regenerated from cryopreserved shoot tips. Acta Physiol. Plant. 38, 268.

Burritt D.J., 2008. Efficient cryopreservation of adventitious shoots of Begonia ×erythrophylla using encapsulation-dehydration requires pretreatment with both ABA and proline. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 95, 209–215.

Castillo N.R.F., Bassil N.V., Wada S., Reed B.M., 2010. Genetic stability of cryopreserved shoot tips of Rubus germplasm. In Vitro Cell. Dev. Biol. – Plant 46, 246–256.

Chen T.H., Kartha K.K., Leung N.L., Kurz W.G., Chatson K.B., Constabel F., 1984. Cryopreser-vation of alkaloid-producing cell cultures of periwinkle (Catharanthus roseus). Plant Physiol. 75(3), 726–731.

Cho J.S., Hong S.M., Joo S.Y., Yoo J.S., Kim D.I., 2007. Cryopreservation of transgenic rice suspen-sion cells producing recombinant hCTLA4Ig. App. Microbiol. Biotech. 73, 1470–1476.

De Verno L.L., Park Y.S., Bonga J.M., Barrett J.D., Simpson C., 1999. Somaclonal variation in cryopreserved embryogenic clones of white spruce [Picea glauca (Moench) Voss.]. Plant Cell Rep. 18(11), 948–953.

Dixit S., Mandal B.B., Ahuja S., Srivastava P.S., 2003. Genetic stability assessment of plants regen-erated from cryopreserved embryogenic tissues of Dioscorea bulbifera L. using RAPD, biochemical and morphological analysis. CryoLett. 24, 77–84.

Dowrick G.J., El-Bayoumi A., 1966. The origin of new forms of the garden chrysanthemum. Eu-phytica 15, 32–38.

Fukai S., Goi M., Tanaka M., 1991. Cryopreservation of shoot tips of Chrysanthemum morifolium and related species native to Japan. Euphytica 54, 201–204.

Fukai S., Goi M., Tanaka M., 1994. The chimeric structure of the apical dome of chrysanthemum (Dendranthema grandiflorum (Ramat.) Kitam.) is affected by cryopreservation. Sci. Hor-tic. 57, 347–351.

120 D. Kulus

Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych González-Arnao M.T., Durán-Sánchez B., Jiménez-Francisco B., Lázaro-Vallejo C.E., Valdés--Rodríguez S.E., Guerrero A., 2009. Cryopreservation and proteomic analysis of vanilla (V. planifolia A.) apices treated with osmoprotectants. Acta Hortic. 908, 67–72.

Grapin A., Gallard A., Le Bras C., Dorion N., 2011. Cryopreservation, an efficient tool for Pelargo-nium species long-term conservation. W: A. Grapin i in. (red.) Cryopreservation of crop species in Europe. COST Europ. Coop. Sci. Technol., Angers, 138–140.

Grotewold E., 2006. The genetics and biochemistry of floral pigments. Ann. Rev. Plant Biol. 57, 761–780.

Grout B.W.W., 1995. Genetic preservation of plant cells in vitro. Springer-Verlag, Berlin, Heidel-berg.

Häggman H.M., Ryynänen L.A., Aronen T.S., Krajnakova J., 1998. Cryopreservation of embryoge-nic cultures of Scots pine. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 54(1), 45–53.

Halmagyi A., Deliu C., 2007. Cryopreservation of carnation (Dianthus caryophyllus L.) shoot tips by encapsulation-vitrification. Sci. Hortic. 113, 300–306.

Hao Y.J., You C.X., Deng X.X., 2002a. Analysis of ploidy and the patterns of amplified fragment length polymorphism and methylation sensitive amplified polymorphism in strawberry plants recovered from cryopreservation. CryoLett. 23(1), 37–46.

Hao Y.J, You C.X., Deng X.X., 2002b. Effects of cryopreservation on developmental competency, cytological and molecular stability of citrus callus. CryoLett. 23(1), 27–35.

Harding K., 1991. Molecular stability of the ribosomal RNA genes in Solanum tuberosum plants recovered from slow growth and cryopreservation. Euphytica 55(2), 141–146.

Harding K., 2010. Plant and algal cryopreservation, issues in genetic integrity, concepts in cryobio-nomics and current application in cryobiology. Asia–Pacific J. Mol. Biol. Biotech. 18(1), 151–154.

Hirano T., Godo T., Mii M., Ishikawa K., 2005. Cryopreservation of immature seeds of Bletilla striata by vitrification. Plant Cell Rep. 23(8), 534–539.

Hitmi A., Sallanon H., Barthomeuf C., 1997. Cryopreservation of Chrysanthemum cinerariaefo-lium Vis. cells and its impact factor on their pyrethrin biosynthesis ability. Plant Cell Rep.

17, 60–64.

Hosoki T., 1989. In vitro storage of Chrysanthemum morifolium at room temperature. Plant Tiss.

Cult. Lett. 6(2), 86–87.

Jitsopakul N., Thammasiri K., Ishikawa K., 2009. Cryopreservation of Vanda coerulea protocorm-like bodies by droplet-vitrification. Acta Hortic. 908, 207–213.

Johnston J.W., Benson E.E., Harding K., 2009. Cryopreservation induces temporal DNA methyla-tion epigenetic changes and differential transcripmethyla-tional activity in Ribes germplasm. Plant Physiol. Biochem. 47(2), 123–31.

Jokipii S., Ryynänen L., Kallio P.T., Aronen T., Häggman H., 2004. A cryopreservation method maintaining the genetic fidelity of a model forest tree, Populus tremula L. × Populus tremuloides Michx. Plant Sci. 166, 79–806.

Kaity A., Ashmore S.E., Drew R.A., 2009. Field performance evaluation and genetic integrity as-sessment of cryopreserved papaya clones. Plant Cell. Rep. 28(9), 1421–1430.

Kaity A., Ashmore S.E., Drew R.A., Dulloo M.E., 2008. Assessment of genetic and epigenetic changes following cryopreservation in papaya. Plant Cell Rep. 27(9), 1529–1539.

Lee G-J., Chung S.J., Park I.S., Lee J.S., Kim J-B., Kim D.S., Kang S-Y., 2008. Variation in the phenotypic features and transcripts of color mutants of chrysanthemum (Dendranthema grandiflorum) derived from gamma ray mutagenesis. J. Plant Biol. 51(6), 418–423.

Lee Y.G., Popova E., Cui H.Y., Kim H.H., Park S.U., Bae C.H., Lee S.C., Engelmann F., 2011.

Improved cryopreservation of chrysanthemum (Chrysanthemum morifolium) using drop-let–vitrification. CryoLett. 32(6), 486–497.

Stabilność materiału roślinnego po krioprezerwacji 121

nr 586, 2016

Maki S., Hirai Y., Niino T., Matsumoto T., 2015. Assessment of molecular genetic stability between long-term cryopreserved and tissue cultured wasabi (Wasabia japonica) plants. CryoLett.

36(5), 318–324.

Malepszy S., Niemrowicz-Szczytt K., Przybecki Z., 1989. Biotechnologia w genetyce i hodowli roślin. Państwowe Wydawnictwo Naukowe, Warszawa.

Martín C., Cervera M.T., González-Benito M.E., 2011. Genetic stability analysis of chrysanthe-mum (Chrysanthechrysanthe-mum ×morifolium Ramat) after different stages of an encapsulation-dehydration cryopreservation protocol. J. Plant Physiol. 168, 158–166.

Martín C., González-Benito E., 2005. Survival and genetic stability of Dendranthema grandiflora Tzvelev shoot apices after cryopreservation by vitrification and encapsulation-dehydra-tion. Cryobiol. 51, 281–289.

Martín C., González-Benito E., 2006. Sequence comparison in somaclonal variant of cryopreserved Dendranthema grandiflora shoot apices. Cryobiol. 53, 367–446.

Martín C., González-Benito E., 2009. Cryopreservation and genetic stability of Dendranthema grandiflora Tzvelev in vitro cultures. Agric. Food Sci. 18, 129–135.

Medina J.J., Clavero-Ramírez I., González-Benito M.E., Gálvez-Farfán J., López-Aranda J.M., Soria C., 2007. Field performance characterization of strawberry (Fragaria ×ananassa Duch.) plants derived from cryopreserved apices. Sci. Hortic. 113, 28–32.

Meyer V.G., 1966. Flower abnormalities. Bot. Rev. 32, 165–195.

Mikuła A., 2010. Krioprezerwacja w zabezpieczaniu (epi)genetycznej stabilności materiału roślin-nego. Biotechnologia 2(89), 23–37.

Mikuła A., Olas M., Śliwińska E., Rybczyński J.J., 2008. Cryopreservation by encapsulation of Gentiana spp. cell suspensions maintains regrowth, embryogenic competence and DNA content. CryoLett. 29(5), 409–418.

Mikuła A., Rybczyński J.J. 2009. Assesement of Gentiana cruciata and G. tibetica regenerants derived from cryopreserved cell suspensions. Acta Hortic. 908, 27.

Mikuła A., Tomiczak K., Rybczyński J.J., 2011a. Cryopreservation enhances embryogenic capacity of Gentiana cruciata (L.) suspension culture and maintains (epi)genetic uniformity of regenerants. Plant Cell Rep. 30(4), 565–574.

Mikuła A., Tomiczak K., Wójcik A., Rybczyński J.J., 2011b. Encapsulation–dehydration method elevates embryogenic abilities of Gentiana kurroo cell suspension and carrying on ge-netic stability of its regenerants after cryopreservation. Acta Hortic. 908, 143–154.

Nery F.C., Paiva R., da Silva D.P.C., Campos A.C.A.L., de Campos M.S., 2009. Nuclear DNA integrity of cryopreserved embryonic axes of Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan.

Acta Hortic. 908, 139–141.

Pasqual M., Salles Pio M.A., Lima Oliveira A.C., Rodrigues Soares J.D., 2012. Flow cytometry applied in tissue culture. W: A. Leva i L.M.R. Rinaldi (red.) Recent Advances in Plant In Vitro Culture. InTech, str. 109–122.

Poobathy R., Xavieer R., Sinniah U.R., Subramaniam S., 2013. Molecular stability of protocorm--like bodies of Dendrobium sonia-28 after encapsulation-dehydration and vitrification.

Australian J. Crop Sci. 7(2), 189–195.

Popova E.V., Kim H.H., Yi J.Y., Choi Y.M., Sung J.S., Jeon Y.A., Kang M., 2010. Cryopreservation of chrysanthemum via droplet–vitrification method. Cryobiol. 64(3), 1.

Revilla M.A., Arroyo-Garcia R., Peredo E.L., 2009. Is the in vitro establishement a critical point in the (epi)genetic stability of the cryopreserved material? W: 1^st Symposium, Cryoprese-rvation in Horticultural Species, Book of Abstracts. ISHS, Leuven.

Rival A., Turquay P., Samosir Y., Adkins S.W., 2010. Cryopreservation of coconut (Cocos nucifera L.) zygotic embryos does not induce morphological, cytological or molecular changes in recovered seedlings. Planta 232, 435–447.

122 D. Kulus

Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych Salaj T., Matusikova I., Fraterova L., Pirselova B., Salaj J., 2011. Regrowth of embryogenic tissues

of Pinus nigra following cryopreservation. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 106, 55–61.

Sánchez C., Martínez M.T., Vidal N., San-Jose M.C., Valladare S., Vieitez A.M., 2008. Preserva-tion of Quercus robur germplasm by cryostorage of embryogenic cultures derived from mature trees and RAPD analysis of genetic stability. CryoLett. 29(6), 493–504.

Skyba M., Urbanová M., Kapchina-Toteva V., Kosuth J., Harding K., Cellárová E., 2010. Physi-ological, biochemical and molecular characteristics of cryopreserved Hypericum perfo-ratum L. shoot tips. CryoLett. 31(3), 249–60.

Sopalun K., Kanchit K., Ishikawa K., 2010. Vitrification–based cryopreservation of Grammato-phyllum speciosum protocorm. CryoLett. 31(4), 347–357.

Surenciski M.R., Dematteis M., Flachsland E., 2007. Chromosome stability in cryopreserved germ-plasm of Cyrtopodium hatschbachii (Orchidaceae). Ann. Bot. Fennici 44, 287–292.

Van Huylenbroeck J., Calsyn E., 2009. Cryopreservation of an azalea germplasm collection. Acta Hortic. 908, 489–493.

Vázquez A.M., 2007. Cryopreservation and genetic instability. COST Eur. Coop. Sci. Technol., Oviedo.

Volk G.M., Henk A., Basu C., 2011. Gene expression in response to cryoprotectants and liquid nitrogen exposure in Arabidopsis shoot tips. Acta Hortic. 908, 55–66.

Wang Q., Wang R., Li B., Cui Z., 2012. Cryopreservation, a strategy technique for safe preservation of genetically transformed plant materials. Adv. Genet. Eng. Biotech. 1(1), 1–2.

Wang Z., He Y., 2009. Effect of cryopreservation on the development and DNA methylation pat-terns of Arabidopsis thaliana. Life Sci. J. 6(1), 55–60.

Wilkinson T., Wetten A., Prychid C., Fay M.F., 2003. Suitability of cryopreservation for the long--term storage of rare and endangered plant species, a case history of Cosmos atrosan-guineus. Ann. Bot. 91, 65–74.

Zarghami R., Pirseyedi M., Hasrak S., Pakdaman Sardrood B., 2008. Evaluation of genetic stability in cryopreserved Solanum tuberosum. Afr. J. Biotech. 7(16), 2798–2802.

Zeliang P.K., Pattanayak A., Iangrai B., Khongwir E.A., Sarma B.K., 2010. Fertile plant regenera-tion from cryopreserved calli of Oryza rufipogon Griff. And assessment of variaregenera-tion in the progeny of regenerated plants. Plant Cell Rep. 29, 1423–1433.

Zhang Z., Skjeseth G., Elameen A., Haugslien S., Sivertsen A., Clarke J.L., Wang Q.-C., Blystad D.R., 2015. Field performance evaluation and genetic integrity assessment in Argyran-themum ‘Yellow Empire’ plants recovered from cryopreserved shoot tips. In Vitro Cell.

Dev. Biol. – Plant 51(5), 505–513.