NANOCZĄSTKI METALI

Nanocząstki metali szlachetnych, takich jak złoto i srebro, ze względu na ich łatwą preparatykę i możliwość modyfikacji powierzchni, specyficzne właściwości elektryczne i optyczne, które mogą być dostosowywane do potrzeb poprzez zmianę ich kształtu lub wielkości, stały się szczególnie ważne w procesie wzmacniania sygnału w urządzeniach bio-diagnostycznych [Huang i El-Sayed 2010].

Za specyficzne właściwości optyczne nanocząstek metali szlachetnych odpowia-da zjawisko rezonansu plazmonu powierzchniowego SPR (ang. surface plasmon reso-nance). Plazmony powierzchniowe to oscylujące powierzchniowe elektrony walencyj-ne w obrębie nanocząstek metali [Runowski 2014]. Rezonansowe wzbudzenie chmury elektronowej przez światło o określonej długości fali prowadzi do silnego rozproszenia promieniowania, a w widmie absorpcji pojawiają się dla plazmonu powierzchniowego silne pasma. Z użyciem nanocząstek uzyskuje się materiały idealne do zastosowania w powierzchniowo wzmocnionej spektroskopii Ramana (SERS, ang. surface enhanced Raman spectroscopy) – bardzo czułej metodzie detekcji, która polega na wykrywaniu sygnałów pochodzących od cząsteczek zaadsorbowanych na powierzchni nanocząsteczek [Huang i El-Sayed 2010]. Jest to jedna z najbardziej obiecujących i bezpiecznych technik do bezpośredniego wykrywania patogenów. Przykładem wykorzystana SERS do szybkiej identyfikacji szkodliwych mikroorganizmów związanych z zatruciami pokarmowymi są badania przeprowadzone przez Weidemaier i innych [2015], których celem była

mikro-Nanotechnologia w doskonaleniu oceny mikrobiologicznej jakości żywności 51

nr 586, 2016

biologiczna ocena jakości, między innymi mielonej wołowiny, mleka czekoladowego, sałatki z tuńczyka, soku pomarańczowego i sera brie pod względem obecności bakterii E. coli, Salmonella spp. i Listeria spp.

Wykorzystując fakt, że zagregowane nanocząstki złota (Au NPs, ang. gold nanopar-ticles) przyjmują zabarwienie niebieskie, a ich rozproszone roztwory kolor czerwony, opracowano testy kolorymetryczne do monitorowania w żywności m.in. obecności le-koopornego szczepu Salmonella Typhimurium DT104 [Wang i in. 2010]. W metodzie wykorzystano Au NPs sprzężone z przeciwciałami do selektywnego wykrywania i nisz-czenia komórek bakterii. Opracowana technika pozwoliła na detekcję wspomnianego szczepu na poziomie liczebności 10⁴ jtk·ml^–1, a po zastosowaniu promieniowania w bli-skiej podczerwieni zaobserwowano znaczne zmniejszenie żywotności bakterii na skutek fototermicznej lizy komórek.

Wśród metod detekcji mikroflory patogennej wykorzystujących nanocząstki złota i przeciwciała jako czynnik rozpoznający warto wymienić również układy przystosowa-ne do wykrywania bakterii E. coli O157:H7 [Cho i in. 2015] lub Vibrio cholerae O139 [Pengsuk i in. 2013].

W badaniach prowadzonych przez Jyoti i innych [2010] wykorzystano właściwości optyczne Au NPs przy opracowaniu biosensora do wykrywania w czasie rzeczywistym patogennego szczepu E. coli O157:H7. Ten enetrokrwotoczny szczep produkuje m.in.

toksynę kodowaną przez gen stx2, wywołującą krwawe biegunki. Autorzy sfunkcjo-nalizowali nanocząstki złota pojedynczą nicią DNA (sonda), o długości 19 i 22 pz, modyfikowaną grupami tiolowymi (–SH) na końcu 5’ i komplementarną do konserwa-tywnego regionu genu stx2 o długości 149 pz. Po hybrydyzacji nici DNA i sondy, agre-gacji i unieruchomieniu na powierzchni biosensora, obserwowano zmiany w widmie absorpcji dla plazmonu powierzchniowego. Dzięki zastosowaniu takiego rozwiązania możliwe było wykrycie badanego szczepu przy stężeniu 10⁶ kopii docelowego DNA.

Autorzy wskazali na szybkość i prostotę opracowanej procedury oraz możliwość stoso-wania jej do detekcji w czasie rzeczywistym, w przeciwieństwie do metod bazujących na amplifikacji DNA.

Wzmocnienie sygnału detekcji możliwe jest przy zastosowaniu nanocząstek srebra (Ag NPs, ang. silver nanoparticles). Przykładem takiego rozwiązania są wyniki badań zespołu Cao i innych [2011], który spreparował struktury składające się z rdzenia zawie-rającego Au NPs i otoczki utworzonej z Ag NPs. Taki zabieg zwiększa gęstość ładunków elektronów, co prowadzi do większej intensywności barwy i zmian w widmie absorpcji UV-Vis oraz do większej czułości technik wykorzystujących pomiar ilościowy. Wytwo-rzone struktury typu core/shell (rdzeń/powłoka) miały duże powinowactwo do określone-go białka znajdująceokreślone-go się na powierzchni komórki Campylobacter jejuni, umożliwiając wykrycie bakterii w żywności.

Nanocząstki srebra mogą się łączyć z różnymi ligandami, np. białkami, przeciwciała-mi, oligonuktleotydaprzeciwciała-mi, peptydami i małymi molekułami. Mogą być wykorzystywane do kolorymetrycznego wykrywania i kwantyfikacji patogenów. Stosowane są również jako nowej generacji czynniki przeciwdrobnoustrojowe, wpływające negatywnie na wzrost takich patogenów pokarmowych, jak: E. coli, S. aureus, Salmonella spp., Bacillus cereus i L. monocytogenes [Kaittanis i in. 2010, Dunkan 2011].

52 N. Kordala, W. Bednarski, M. Lewandowska

Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych NANORURKI WĘGLOWE

Nanorurki węglowe (CNT, ang. carbon nanotubes) mają postać otwartych lub za-mkniętych cylindrów o średnicy rzędu kilku nanometrów. Odznaczają się niezwykłymi cechami fizyczno-chemicznymi, są: twarde jak diament, elastyczne, sprężyste, wytrzy-małe na zrywanie i zgniatanie oraz bardzo dobrze przewodzą ciepło. Nanorurki mają również dużą powierzchnię i są czułe na oddziaływania sił międzycząsteczkowych [Sokół 2012]. Ze względu na swoje unikalne właściwości fizyczne, optyczne i elektryczne CNT służą do wzmacniania sygnału w procesie wykrywania patogenów przenoszonych drogą pokarmową. Przykładem są wyniki badań przeprowadzone przez Tang i innych [2010].

Celem tych badań było opracowanie procedury elektrochemicznego wykrywania ente-rotoksyny B (SEB) w soku z arbuza, wieprzowinie, mleku sojowym i soku jabłkowym.

Procedura obejmowała użycie enzymu peroksydazy (HRP, ang. horseradish peroxida-se), immobilizowanego na nanokrzemionce oraz nanorurek węglowych dla amplifikacji sygnału (struktura HRPSiCNTs). Królicze poliklonalne przeciwciała anty-SEB zostały kowalencyjnie związane z elektrodą węglową oraz strukturą HRPSiCNTs. W obecności enterotoksyny B w analizowanej próbce następowała reakcja typu sandwich, czyli po-dwójnego wiązania między antygenem (toksyną) a przeciwciałami, unieruchomionymi na elektrodzie i znakowanymi enzymem HRP. W kolejnym etapie dochodziło do redukcji H₂O₂ katalizowanej przez HRP, w obecności tioniny, co uruchamiało elektrochemiczny mechanizm detekcji wspomnianej toksyny z granicą wykrywalności (LOD) na poziomie 10 pg·ml^–1 próby.

BIOSENSORY

Podstawowe cechy biosensorów predestynujące je do zastosowania w procesie kon-troli i monitorowania jakości żywności to ich niska cena, duża selektywność oraz możli-wości miniaturyzacji, co umożliwia tworzenie czujników przenośnych. W przemysłowej analizie żywności najbardziej atrakcyjnym obszarem, gdzie biosensory mogą znaleźć szerokie zastosowanie, jest analiza patogenów, wykrywanie genetycznych modyfikacji, monitorowanie zawartości pestycydów, antybiotyków oraz toksyn [Radecki i in. 2006, Fournier-Wirth i Coste 2010, Głód i in. 2014].

Biosensor jest urządzeniem analitycznym, stosowanym do wykrywania, przekazy-wania i rejestroprzekazy-wania informacji o biochemicznych i fizjologicznych zmianach. Zasada jego pracy polega na przekształceniu wyniku reakcji biologicznej na sygnał analityczny.

W budowie biosensora wyróżnia się dwa podstawowe elementy – warstwę analitycznie aktywną (detekcyjną) wyposażoną w element dokonujący rozpoznania biologicznego oraz przetwornik, który wytwarza mierzalny sygnał proporcjonalny do badanej właści-wości oznaczanej substancji (rys.). Jako pracujące w warstwie detekcyjnej bioreceptory wykorzystywane są najczęściej przeciwciała, kwasy nukleinowe, enzymy lub całe mi-kroorganizmy. Z kolei w roli przetwornika, w zależności od sposobu transdukcji sygnału stosuje się układ optyczny, elektrochemiczny, piezoelektryczny, termometryczny lub ma-gnetyczny [Lazcka i in. 2007, Grieshaber i in. 2008, Velusamy i in. 2010].

Nanotechnologia w doskonaleniu oceny mikrobiologicznej jakości żywności 53

ƒ mikrowaga krysztaáu kwarcu/

/quartz crystal microbalance

ƒ powierzchnia fali akustycznej/

/surface acoustic wave

Rys. Wybrane elementy budujące typowy biosensor. Opracowanie własne na podstawie Grie-shaber i inni [2008], Fournier-Wirth i Coste [2010]

Fig. Selected components of a typical biosensor. Own study based on Grieshaber et al. [2008], Fournier-Wirth and Coste [2010]

Wśród obecnie rozwijających się alternatywnych sposobów monitorowania skażenia mikrobiologicznego wymieniane są biosensory o wrażliwości na specyficzne fragmenty kwasów nukleinowych drobnoustrojów obecnych w badanych próbkach żywności [Ve-lusamy i in. 2010].

Idea pracy tego typu urządzenia polega na reakcjach hybrydyzacji komplementar-nych nici DNA. Warstwą detekcyjną takiego biosensora jest powierzchnia przetworni-ka, na której zostały umocowane pojedyncze nici DNA (ssDNA, sondy). Proces rozpo-znania międzymolekularnego odpowiedzialny za generację sygnału analitycznego jest realizowany poprzez reakcję hybrydyzacji pomiędzy sondą ssDNA unieruchomioną na powierzchni przetwornika a komplementarną do niej nicią tDNA (ang. target DNA) znaj-dującą się w roztworze analizowanej próbki [Radecki i in. 2006].

Modyfikując miedzianą elektrodę roboczą sondami ssDNA komplementarnymi do fragmentów genu wirulencji hlyA, otrzymany został elektrochemiczny biosensor do wy-krywania bakterii L. monocytogenes [Oczkowski i Filipiak 2009]. Po hybrydyzacji sond z docelowymi fragmentami tDNA wyniki tej interakcji były badane woltamperometrycz-nie przy użyciu elektroaktywnego wskaźnika hybrydyzacji – kompleksu kobaltu i fenan-troliny (Co(phen)₃³⁺) lub błękitu metylenu. Związki te w większym stopniu akumulowały się w dwu- niż w jednoniciowej strukturze DNA, pozwalając tym samym na wykrycie w badanej próbce fragmentów kwasów nukleinowych specyficznych dla L. monocyto-genes. Badania przeprowadzono dla próbek pochodzących z mleka, mięsa, sera i ryby

54 N. Kordala, W. Bednarski, M. Lewandowska

Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych wędzonej. Potwierdziły one możliwość zastosowania opracowanego biosensora do de-tekcji wspomnianego patogenu w żywności.

Techniki biosensorowe do wykrywania patogenów mogących zanieczyszczać pro-dukty żywnościowe oparte o użycie aptamerów DNA w literaturze przedstawiane są najczęściej w połączeniu z różnorodnymi nanostrukturami. W biosensorze do detekcji Salmonella enterica wykorzystano nanocząstki magnetyczne zmodyfikowane aptamera-mi DNA, specyficznyaptamera-mi dla białek błony zewnętrznej, które pozwoliły na wyizolowanie z próbek żywności (mięso drobiowe) poszukiwanych komórek bakteryjnych [Joshi i in.

2009]. Następnie były one poddawane ilościowym oznaczeniom techniką real-time PCR obserwowanym w czasie rzeczywistym.

Charakterystykę nanosensorów oraz kierunki ich stosowania w przemyśle spożyw-czym przedstawiono także w pracy Głód i inni [2014].

WNIOSKI

1. Poznanie struktury materiałów (nanomateriałów), których właściwości fizyczne, chemiczne i biologiczne są znacząco inne niż ich odpowiedników makroskopowych, daje możliwość doskonalenia metod detekcji patogenów i zapewnienia bezpieczeństwa żyw-ności.

2. Przedstawione w artykule przykłady potwierdzają, że dzięki nanotechnologii moż-liwe jest opracowanie szybkich, czułych oraz przydatnych praktycznie procedur wykry-wania i kwantyfikacji patogenów pokarmowych.

LITERATURA

Bruno J.G., Phillips T., Carrillo M.P, Crowell R., 2009. Plastic-adherent DNA aptamer-magnetic bead and quantum dot sandwich assay for Campylobacter detection. J. Fluoresc. 3, 427–435.

Cao C., Gontard L.C., Tram L.L.T., Wolff A., Bang D.D., 2011. Dual enlargement of Au NPs: from mechanism to scanometric detection of pathogenic bacteria. Small 12, 1701–1708.

Cho I.H., Bhunia A., Irudayaraj J., 2015. Rapid pathogen detection by lateral-flow immuno-chromatographic assay with gold nanoparticle-assisted enzyme signal amplification.

Int. J. Food Microbiol. 206, 60–66.

Colvin V., 2003. The potential environmental impacts of engineered nanomaterials. Nature Bio-technol. 1, 1166–1170.

Dudak F.C., Boyaci I.H., 2009. Multiplex detection of E. coli and S. enteritidis by using quantum dot-labelled antibodies. J. Rapid Methods Autom. Microbiol. 3, 315–327.

Dunkan T.V., 2011. Applications of nanotechnology in food packaging and food safety: Barrier materials, antimicrobials and sensors. J. Colloid Interface Sci. 363(1), 1–24.

Fournier-Wirth C., Coste J., 2010. Nanotechnologies for pathogen detection: Future alternatives?

Biologicals 38, 9–13.

Gilmartin N., O’Kennedy R., 2012. Nanobiotechnologies for the detection and reduction of patho-gens. Enzyme Microb. Technol. 50, 87–95.

Nanotechnologia w doskonaleniu oceny mikrobiologicznej jakości żywności 55

nr 586, 2016

Głód D., Adamczak M., Bednarski W., 2014. Wybrane aspekty zastosowania nanotechnologii w produkcji żywności. ŻNTJ 5(96), 36–52.

Goldman E.R., Clapp A.R., Anderson G.P., Uyeda H.T., Mauro J.M., Medintz I.L., Mattoussi H., 2004. Multiplexed toxin analysis using four colors of quantum dot fluororeagents. Anal.

Chem. 76, 684–688.

Grieshaber D., MacKenzie R., Vörös J., Reimhult E., 2008. Electrochemical Biosensors – Sensor Principles and Architectures. Sensors 8, 1400–1458.

Hahn M., Tabb J., Krauss T., 2005. Detection of single bacterial pathogens with semiconductor quantum dots. Anal. Chem. 15, 4861–4869.

Havelaar A.H., Brul S., de Jong A., de Jonge R., Zwietering M.H., Ter Kuile B.H., 2010. Future challenges to microbial food safety. Int. J. Food Microbiol. 139, S79–S94.

Huang X., El-Sayed M.A., 2010. Gold nanoparticles: Optical properties and implementations in cancer diagnosis and photothermal therapy. J. Adv. Res. 1, 13–28.

Joshi R., Janagama H., Dwivedi H.P., Kumar S.T.M.A., Jaykus L.A., Schefers J., Sreevatsan S., 2009. Selection, characterization, and application of DNA aptamers for the capture and detection of Salmonella enterica serovars. Mol. Cell Probe. 23, 20–28.

Jyoti A., Pandey P., Singh S.P., Jain S.K., Shanker R., 2010. Colorimetric detection of nucleic acid signature of shiga toxin producing E. coli using Au NPs. J. Nanosci. Nanotechnol. 7, 4154–4158.

Kaittanis C., Nath S., Perez J.M., 2008. Rapid nanoparticle-mediated monitoring of bacterial meta-bolic activity and assessment of antimicrobial susceptibility in blood with magnetic re-laxation. PLoS ONE 3, e3253.

Kaittanis C., Santra S., Perez J.M., 2010. Emerging nanotechnology-based strategies for the identi-fication of microbial pathogenesis. Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 408–423.

Lazcka O., Del Campo F.J., Munoz F.X., 2007. Pathogen detection: A perspective of traditional methods and biosensors. Biosens. Bioelectron. 22, 1205–1217.

Lewandowska M., Kordala N., Bednarski W., 2014. Współczesne możliwości stosowania nano-technologii w doskonaleniu katalizy enzymatycznej. ZPPNR 579, 37–47.

Medintz I.L., Mattoussi H., Clapp A.R., 2008. Potential clinical applications of quantum dots.

Int. J. Nanomedicine 3(2), 151–167.

Murthy S.K., 2007. Nanoparticles in modern medicine: State of the art and future challenges.

Int. J. Nanomedicine 2(2), 129–141.

Newell D.G., Koopmans M., Verhoef L., Duizer E., Aidara-Kane,A., Sprong H., Opsteegh M., Langelaar M., Threfall J., Scheutz F., van der Giessen J., Kruse H., 2010. Food-borne diseases – The challenges of 20 years ago still persist while new ones continue to emerge.

Int. J. Food Microbiol. 139, S3–S15.

Nowak A., Ołtuszak-Walczak E., Świtoniak T., 2008. Zatrucia i zakażenia pokarmowe. W: Z. Libu-dzisz, K. Kowal, Z. Żakowska (red.), Mikrobiologia techniczna. Mikroorganizmy w bio-technologii, ochronie środowiska i produkcji żywności (tom II). Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa.

Oczkowski T., Filipiak M., 2009. Startery, elektrochemiczny biosensor DNA oraz sposób wykry-wania mikroorganizmu Listeria monocytogenes w substancjach organicznych, zwłaszcza żywności. Patent PL 200797 B1.

Pengsuk C., Chaivisuthangkura P., Longyant S., Sithigorngul P., 2013. Development and evalua-tion of a highly sensitive immunochromatographic strip test using gold nanoparticle for direct detection of Vibrio cholerae O139 in seafood samples. Biosens. Bioelectron. 42, 229–235.

56 N. Kordala, W. Bednarski, M. Lewandowska

Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych Radecki J., Radecka H., Cieśla J., Tudek B., 2006. Sensory chemiczne i biosensory w kontroli

żywności zmodyfikowanej genetycznie. Biotechnologia 74, 67–78.

Runowski M., 2014. Nanotechnologia – nanomateriały, nanocząstki i wielofunkcyjne nanostruktu-ry typu rdzeń/powłoka. Chemik 68(9), 766–775.

Quested T.E., Cook P.E., Gorris L.G.M., Cole M.B., 2010. Trends in technology, trade and con-sumption likely to impact on microbial food safety. Int. J. Food Microbiol. 139, S29–

–S49.

Sokół J.L., 2012. Nanomateriały w życiu człowieka. Ekonomia i Zarządzanie 1, 18–29.

Sung Y.J., Suk H.J., Sung H.Y., Li T., Poo H., Kim M.G., 2013. Novel antibody/gold nanoparticle/

/magnetic nanoparticle nanocomposites for immunomagnetic separation and rapid colori-metric detection of Staphylococcus aureus in milk. Biosens. Bioelectron. 43, 432–439.

Szewczyk P., 2011. Nanotechnologie aspekty techniczne, środowiskowe i społeczne. Wyd. Poli-techniki Śląskiej, Gliwice.

Tang D., Tang J., Su B., Chen G., 2010. Ultrasensitive electrochemical immunoassay of staphylo-coccal enterotoxin B in food using enzyme-nanosilica-doped carbon nanotubes for signal amplification. J. Agric. Food Chem. 20, 10824–10830.

Tully E., Hearty S., Leonard P., O’Kennedy R., 2006. The development of rapid fluorescence-based immunoassays, using quantum dot-labelled antibodies for the detection of L. monocyto-genes cell surface proteins. Int. J. Biol. Macromol. 39, 127–134.

Velusamy V., Arshak K., Korostynska O., Oliwa K., Adley C., 2010. An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors. Biotechnol Adv. 28, 232–254.

Wang S., Singh A.K., Senapati D., Neely A., Yu H., Ray P.C., 2010. Rapid colorimetric identifica-tion and targeted photothermal analysis of Salmonella bacteria by using bioconjugated oval-shaped Au NPs. Chem. Eur. J. 19, 5600–5606.

Weidemaier K., Carruthers E., Curry A., Kuroda M., Fallows E., Thomas J., Sherman D., Muldoon M., 2015. Real-time pathogen monitoring during enrichment: a novel nanotechnology--based approach to food safety testing. Int. J. Food Microbiol. 198, 19–27.

WHO, 2003. Heterotrophic Plate Counts and Drinking-water Safety. London.

Yang L., Li Y., 2006. Simultaneous detection of E. coli O157:H7 and S. typhimurium using quan-tum dots as fluorescence labels. Analyst. 3, 394–401.

Zhao Y., Ye M., Chao Q., Jia N., Ge Y., Shen H., 2009. Simultaneous detection of multifood-borne pathogenic bacteria based on functionalized quantum dots coupled with immunomag-netic separation in food samples. J. Agric. Food Chem. 2, 517–524.

APPLICATION OF NANOTECHNOLOGY IN IMPROVING