2 PRZEGLĄD LITERATUROWY
3.5 Metodyka i aparatura badań
3.5 Metodyka i aparatura badań
W ramach części doświadczalnej niniejszej pracy doktorskiej zastosowano autoską metodykę i metody znormalizowane w zakresie badań paliw silnikowych pod kątem składników śladowych steroli i nasyconych acylogliceroli w FAME i oleju napędowym z dodatkiem biokomponentu wykorzystując techniki chromatografii gazowej, cieczowej, jak również technikę miareczkowania
kulometrycznego oraz techniki optycznej w badaniach mętności roztworów w zależności od temperatury.
3.5.1 Metody badań składników śladowych FAME i oleju napędowego 3.5.1.1 Metody znormalizowane
Znormalizowane metody badania zawartości śladowych struktur FSG i SMG w przedmiotowych paliwach silnikowych objęły:
- metodykę oznaczania zawartości wolnego i ogólnego glicerolu oraz mono-, di- i triacylogliceroli w FAME, techniką chromatografii gazowej wg normy PN-EN 14105:2012,
- metodykę oznaczania zawartości estrów i estru metylowego kwasu linolenowego, techniką chromatografii gazowej wg normy PN-EN 14103:2012, - metodykę oznaczania zawartości wody metodą miareczkowania
kulometrycznego wg Karla Fischera wg normy PN-EN 12937:2005.
Badania zawartości estrów i estru metylowego kwasu linolenowego w FAME wg normy PN-EN 14103 wykonano przy użyciu chromatografu gazowego firmy Agilent Technologies model 7890B przedstawionego na Rys. 8.
Rys.8. Chromatograf gazowy 7890B do oznaczania zawartości estrów i estru metylowego kwasu linolenowego wg normy PN-EN 14103
Zestaw analityczny składał się z następujących komponentów:
- dozownik z podziałem strumienia split/splitless, umożliwiał wprowadzenie precyzyjnie odmierzonej objętości badanej próbki analitycznej na kolumnę
analityczną oraz jej zabezpieczenie przed zanieczyszczeniem składnikami o podwyższonej temperaturze wrzenia,
- kolumna chromatograficzna o wymiarach: 30 m x 0,32 mm, z filmem fazy stacjonarnej AT-WAX (usieciowany polietylenoglikol) o grubości 0,5 μm, firmy Alltech Corp., USA. Polarny film fazy stacjonarnej umożliwiał rozdział poszczególnych estrów metylowych kwasów tłuszczowych, względem ich rosnącej polarności, co zapewniło selektywność rozdziału pomiędzy pikami, z możliwością badania poszczególnych izomerów strukturalnych FAME,
- detektor płomieniowo – jonizacyjny (FID),
- program „OpenLab CDS Chemstation Edition” do integracji i obróbki chromatogramów, firmy Agilent Technologies.
Badania zawartości wody w mieszaninach modelowych wykonano przy użyciu aparatu do miareczkowania kulometrycznego firmy Mettler Toledo model DL39 – rys 9 wg normy PN-EN 12937.
Rys. 9. Aparat do oznaczania zawartości wody metodą miareczkowania kulometrycznego Karla Fishera
Zawartość wody dla przedmiotowych mieszanin wykonano metodą kulometryczną z pomiarem ładunku powstającego w reakcji wody obecnej w badanej próbce podczas jej miareczkowania z tzw. odczynnikiem Karla Fishera.
Odważoną dokładnie ilość próbki, od 1 do 2 ml, wprowadzano do naczynka - urządzenia miareczkowania. Proces miareczkowania kulometrycznego zachodzi poprzez wydzielanie jodu na anodzie. Wodę obecną w próbce miareczkuje się, aż do pojawienia się nadmiaru jodu, który wykrywany jest przez czujnik elektrometryczny. Pojawienie się jodu świadczy o punkcie końcowym miareczkowania. Zgodnie ze stechiometrią reakcji 1 mol J2 reaguje z 1 molem H2O. A zatem, ilość wody w próbce jest proporcjonalna do całkowitego zsumowanego prądu zgodnie z prawem Faradaya [Szczepaniak W., 1999]. Istotnym zagadnieniem procedury badania jest zapewnienie jednorodności próbki. Próbki niejednorodne miesza się intensywnie mieszadłem z dodatkiem roztworu dioktylo-sulfobursztynianu sodu w ksylenie (mieszaninie izomerów o-, m- lub p-). Do czynników zakłócających oznaczenie wody w próbce zalicza się obecność ketonów, siarkowodoru i siarki merkaptanowej. Zarówno w przypadku badania oleju napędowego z dodatkiem biokomponentów, jak również podczas badania FAME mamy do czynienia z produktami klarownymi, jednorodnymi i pozbawionymi wymienionych związków interferujących. Oznaczenie zawartości wody podczas badań było niezakłócone i precyzyjne.
3.5.1.2 Metoda własna oznaczania zawartości FSG i SMG
Wykorzystano nowatorską, opracowaną przez Autora pracy, metodę badania próbek paliw pod kątem zawartości składników śladowych FAME. Metoda jest zwalidowana i umożliwia wykonanie badań zawartości FSG i SMG zarówno w FAME, jak i w mieszaninach FAME z olejem napędowym. Dzięki połączeniu technik chromatografii gazowej z detekcją płomieniowo – jonizacyjną GC-FID oraz chromatografii cieczowej LC z zastosowaniem żelu krzemionkowego o obniżonej polarności możliwe było uzyskanie wysokiej selektywności metody oraz niskiej granicy oznaczalności przy zachowaniu wysokiej precyzji oznaczeń.
Do oznaczenia zawartości śladowych składników FSG i SMG w FAME oraz w oleju napędowym z dodatkiem biokomponentów, wykorzystano chromatograf
gazowy TRACE GC ULTRA firmy Thermo Electron Corporation przedstawiony na Rys. 10.
Rys.10. Chromatograf gazowy TRACE GC ULTRA do oznaczania zawartości FSG i SMG w FAME i oleju napędowym z dodatkiem biokomponentów
Kluczowymi elementami zestawu analitycznego są:
- dozownik z bezpośrednim dozowaniem na kolumnę cool on-column, umożliwiający wprowadzenie próbki na kolumnę chromatograficzną, przy minimalizacji strat substancji o wysokiej masie cząsteczkowej, takich jak FSG, - kolumna chromatograficzna o wymiarach: 15 m x 0,32 mm, z filmem fazy
stacjonarnej 007-1 (dimetylopolisiloksan) o grubości 0,10 μm, firmy Quadrex, USA, posiadająca charakterystykę elucyjną umożlwiającą rozdział mieszanin substancji względem temperatury wrzenia, z zachowaniem wysokiej selektywności względem substancji zakłócających,
- przedkolumna zabezpieczająca kolumnę analityczną: Guard column, 0,4 m x 0,53 mm dezaktywowana, połączona z kolumną analityczną przy użyciu łącznika uniwersalnego do kolumn kapilarnych Universal Fused Silica Press-Tight Connector – Restek Corp,
- detektor płomieniowo – jonizacyjny (FID), stanowiący najbardziej uniwersalny detektor do badania substancji organicznych, posiadający szeroki zakres liniowości odpowiedzi detektora względem stężenia analizowanej substancji, - program „Chrom-Card for USB” do integracji i obróbki chromatogramów,
Podczas badań śladowych składników w przedmiotowych mieszaninach paliw oznaczenie zawartości FSG i SMG wykonano techniką chromatografii cieczowej. Sposób przygotowania próbek przez Autora umożliwił oddzielenie pozostałych składników matrycy z FAME i składników węglowodorowych oraz uzyskanie frakcji z zatężonymi substancjami FSG i SMG.
W skład autorskiej metody chromatograficznej zalicza się:
- kolumnę szklaną do chromatografii elucyjnej o wymiarach 20 cm x 0,5 cm, - probówki stożkowe ze szlifem 29/32 do zbierania frakcji zawierających składniki FSG i SMG,
- fiolki szklane do chromatografii gazowej o pojemności 2,0 ml z kapslami z uszczelkami pokrytymi warstwą teflonu (PTFE),
butelki Simax o pojemności 50 ml,
- cylindry pomiarowe o pojemności: 10 ml o dokładności ± 0,10 ml, 50 ml i 100 ml o dokładności ± 0,50 ml.
W celu wydzielenia frakcji wolnych glukozydów steroli w badanych próbkach przyjęto następujące warunki rozdziału przy użyciu chromatografii elucyjnej:
Żel krzemionkowy typ 60:
- rozmiar cząstek: 63 – 200 µm, (70 – 230 MESH),
- dodatek wody: 10 %(m/m), przy użyciu wagi analitycznej, - zastosowana masa żelu w kolumnie szklanej: 0,5 g.
Kolumna szklana do chromatografii elucyjnej: - długość: 20 cm,
- średnica wewnętrzna 0,5 cm, w górnej części kolumny 3 cm (zbiorniczek na próbkę o długości 6 cm),
- wata celulozowa umieszczana każdorazowo w dolnej części kolumny, celem zapobiegnięcia wypadania żelu krzemionkowego z kolumny.
Etapy wydzielania przy użyciu kolumny z żelem krzemionkowym: - kolumnę kondycjonowano przy użyciu 6 ml n-heptanu,
- wprowadzenie naważonych 20 g próbki na kolumnę - przemycie pojemnika na próbkę 3 x 2 ml n-heptanu,
- przemycie kolumny z próbką 6 x 1,5 ml rozpuszczalnika 2 (75:20:5 n-heptan: octan etylu: izopropanol) i odrzucenie eluatu,
- wymycie i zebranie frakcji wolnych glukozydów steroli przy użyciu 3 x 3 ml rozpuszczalnika 3 (45:55 tetrahydrofuran: etanol),
- odparowanie zebranej frakcji do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem w probówce stożkowej.
Próbki materiału badawczego przeznaczone do wykonania badań techniką chromatografii gazowej GC-FID, stanowiły wydzieloną frakcję zawierającą anality z każdorazowym dodatkiem 0,200 ml pirydyny, a następnie 0,100 ml czynnika silanującego MSTFA i całość zamkniętą korkiem szklanym. Materiał badawczy delikatnie potrząsano przez 3 minuty, tak, aby zapobiec rozprowadzania mieszaniny reakcyjnej w probówce, utrzymując zawartość w dolnej, zwężonej jej części. Następnie materiał zawarty w probówce odstawiano na 15 minut, po czym dodano do niej 0,200 ml n-heptanu. Tak przygotowany roztwór podlegał badaniu techniką chromatografii gazowej przedstawionej poniżej:
Program temperaturowy termostatu:
- izoterma początkowa: 100 oC przez 1 minutę, - przyrost temperatury 15 oC/min do 345 oC, - izoterma końcowa 345 oC przez 7 minut. czas trwania analizy – 24,3 minuty,
Ciśnienie gazu nośnego programowane:
- izobara początkowa: 100 kPa przez 1 minutę, - przyrost ciśnienia 15 kPa/min do 200 kPa, - izobara końcowa 200 kPa przez 5 minut.
Dozownik z bezpośrednim dozowaniem na kolumnę cool on-column stale chłodzony powietrzem,
Objętość dozy: 1µl,
Wartości natężenia przepływu wodoru i powietrza do detektora FID zostały zoptymalizowane wg instrukcji chromatografu gazowego TRACE GC ULTRA.
3.5.1.3 Walidacja metody własnej w zakresie oznaczania zawartości FSG i SMG
a) Wyznaczenie czasów retencji dla nasyconych monoacylogliceroli i wolnych glukozydów steroli
W celu prawidłowej identyfikacji nasyconych monoacylogliceroli: monopalmitynianu glicerolu i monostearynianu glicerolu oraz wolnych glukozydów steroli, sporządzono roztwory jakościowe każdej z badanych substancji, a także dla zastosowanego wzorca wewnętrznego monononadekanianu glicerolu. Wszystkie roztwory sporządzono na poziomie 0,1 mg/ml, z których pobrano po 50 µl materiału do fiolek o pojemności 1,5 ml oraz dodano po 100 µl MSTFA i 200 µl pirydyny. Po dokładnym wymieszaniu (3 minuty) roztwory pozostawiono na 15 minut i do każdego z nich dodano 200 µl n-heptanu po czym badano w warunkach chromatografii gazowej zamieszczonych w punkcie 3.5.1.2. Zidentyfikowano czasy retencji, a otrzymane wartości, w kolejności ich eluowania z kolumny GC, przedstawiono w tabeli 6 wraz z względnymi czasami retencji dla nasyconych monoacylogliceroli w odniesieniu do wzorca monononadekanianu glicerolu.
Tabela 6. Czasy retencji uzyskane dla nasyconych monoacylogliceroli, wolnych glukozydów steroli oraz dla wzorca wewnętrznego – monononadekanianu glicerolu
Lp. Badane substancje i wzorzec wewnętrzny SMG Wyznaczony czas retencji, minuty
Względny czas retencji
1 Monopalmitynian glicerolu 9,3 0,87
2 Monostearynian glicerolu 10,3 0,96
3 Monononadekanian glicerolu (wzorzec wewnętrzny
nasyconych monoacylogliceroli SMG) 10,7 1,00
4 Glukozyd Campesterolu 16,5 1,54
5 Glukozyd Stigmasterolu 16,6 1,55
6 Glukozyd Sitosterolu 16,8 1,57
b) Wyznaczenie krzywej wzorcowej oznaczania wolnych glukozydów steroli
Celem przygotowania roztworu podstawowego wolnych glukozydów steroli, do fiolki szklanej o pojemności 1,5 ml odważono 0,315 mg wolnych glukozydów steroli przy użyciu wagi o dokładności do 0,001 mg, a następnie dodano 1 ml pirydyny przy użyciu mikrostrzykawki pojemności 1 ml. Dodatek pirydyny zważono dodatkowo z dokładnością do 0,0001 g. Uzyskano w ten sposób roztwór wolnych glukozydów steroli o stężeniu 315 µg/ml.
Następnie przygotowano roztwory wzorcowe podstawowe wolnych glukozydów steroli. Do fiolek szklanych o pojemności 1,5 ml odmierzono kolejno 0,008, 0,020, 0,050 i 0,100 ml roztworu podstawowego wolnych glukozydów steroli. Następnie, do fiolek dodano pirydynę w ilości kolejno 0,192, 0,180, 0,150, 0,100 ml oraz po 0,100 ml czynnika silanującego MSTFA.
Fiolki zakapslowano, po czym wytrząsano przez 3 minuty, i pozostawiono na 15 minut. Po upływie tego czasu do roztworów dodano 0,200 ml n-heptanu. Uzyskano w ten sposób roztwory wzorcowe robocze, każdy w ilości po 0,500 ml, o stężeniach kolejno: 5,0, 12,6, 31,5 i 63,0 µg/ml. Wszystkie roztwory z uwagi na ograniczoną trwałość pochodnych silanowych poddano analizom chromatograficznym w dniu ich sporządzenia. Z tak sporządzonych wzorców w fiolkach GC pobierano każdorazowo po 1 µl i dozowano do chromatografu gazowego i analizowano zgodnie z warunkami podanymi powyżej.
c) Wyznaczenie krzywej wzorcowej dla wolnych glukozydów steroli
Celem wykreślenia krzywej wzorcowej zależności sygnału od stężenia wolnych glukozydów steroli, wyznaczono wartości średnie sumarycznej powierzchni pików wolnych glukozydów steroli dla sporządzonych roztworów wzorcowych. Dodatkowy punkt krzywej wzorcowej (1,0 µg/ml ) uzyskano dozując 0,2 µl roztworu wzorcowego o stężeniu 5,0 µg/ml. Otrzymane wartości przedstawiono w tabeli 7.
Tabela 7. Dane uzyskane podczas wyznaczania krzywej regresji wolnych glukozydów steroli FSG
Lp
Średnia sumaryczna powierzchnia pików
wolnych glukozydów steroli Zawartość wolnych glukozydów steroli, µg/ml
1 140858 1,0
2 460602 5,0
3 1168201 12,6
4 2940514 31,5
5 5947301 63,0
Przedstawione w powyższej tablicy 7 wartości reprezentują bardzo wysoką czułość metody, o czym świadczy duża sumaryczna powierzchnia pików wolnych glukozydów steroli już na poziomie 1,0 µg/ml (około 1 ppm) wynosząca 140 000 jednostek. Było to możliwe dzięki zastosowaniu odpowiedniego programu temperaturowego i przygotowaniu próbki z minimalną ilością rozpuszczalników. Stwierdzono na tym etapie, że wartość 1,0 ppm nie jest wartością graniczną oznaczalności niniejszej metody badania.
Wykreślono krzywą wzorcową zależności stężenia wolnych glukozydów steroli od ich średniej sumarycznej powierzchni pików. Otrzymaną krzywą wzorcową przedstawiono na rysunku 11.
Rys. 11. Krzywa wzorcowa oznaczania wolnych glukozydów steroli
w warunkach metody, stwierdzono wysoki współczynnik determinacji r2 równy 0,9998, co świadczy o liniowości odpowiedzi detektora FID w zastosowanym zakresie stężeń. Wartość współczynnika przesunięcia krzywej wzorcowej przyjmuje wartość bliską zera (-0,038), co wskazuje na możliwość zastosowania metody dla bardzo niskich poziomów stężeń (1,0 µg/ml i niższych). Wskazane było wykonanie testu istotności współczynnika przesunięcia krzywej wzorcowej, przy zaobserwowanej bardzo niskiej wartości tego współczynnika.
Celem sprawdzenia, czy jest konieczne stosowanie współczynnika przesunięcia krzywej wzorcowej wolnych glukozydów steroli, wykonano test istotności. Obliczono wartość statystyki tb,obl dla współczynnika przesunięcia b:
tb,obl = |sb/b| (3)
przy czym:
sb – wartość odchylenia standardowego współczynnika przesunięcia krzywej wzorcowej.
Otrzymaną wartość tb,obl porównano z wartością krytyczną tb,kryt odczytaną z tablicy t-studenta dla stopni swobody f = 4 oraz poziomu ufności P = 95 %.
tb,obl = |(0,2279/(-0,03765))|= 6,0535 tb,kryt(f=4,p=95%) = 2,776
Wartość uzyskana tb,obl jest wyższa od wartości krytycznej tb,kryt, a zatem współczynnik przesunięcia krzywej wzorcowej oznaczania wolnych glukozydów steroli nie wykazuje istotności i może być pominięty.
Przy użyciu sporządzonych roztworów wzorcowych wykazano liniowość odpowiedzi detektora FID dla oznaczania zawartości wolnych glukozydów steroli w zakresie od 1 µg/ml do 63,0 µg/ml.
d) Przygotowanie roztworu wzorca wewnętrznego monononadekanianu glicerolu do oznaczania nasyconych monoacylogliceroli SMG
Zastosowany sposób wzorcowania z wykorzystaniem metody wzorca wewnętrznego, zbliżonego pod względem charakteru chemicznego do nasyconych monoacylogliceroli SMG, daje możliwość prawidłowego i nieskomplikowanego
oznaczenia w warunkach metody. Podstawowym warunkiem zastosowania substancji jako wzorca wewnętrznego w chromatografii jest nie występowanie w badanej próbce oraz uzyskiwanie dla niego sygnału w warunkach badania - obecność piku substancji na chromatogramie. Monononadekanian glicerolu spełnia te warunki z uwagi na nieparzystą ilość atomów węgla w podstawnikach kwasów tłuszczowych (19 atomów węgla). Nasycone monoacyloglicerole SMG zawarte w estrach metylowych kwasów tłusczowych FAME, posiadają podstawniki kwasów tłuszczowych o parzystej ilości atomów węgla w cząsteczce (najczęściej 16 lub 18 atomów węgla). Zastosowany wzorzec wewnętrzny, dodany do próbki przed jej przygotowaniem, zabezpiecza przed stratami badanej substancji – nasyconych monoacylogliceroli SMG. Stąd, nie jest konieczne wyznaczanie współczynnika odzysku dla SMG. Z uwagi na stały stan skupienia wzorca wewnętrznego, sporządzono jego roztwór w pirydynie o wysokim stężeniu – 25,0 % (m/m). Do fiolki szklanej o pojemności 1,5 ml odważono 0,250 g monononadekanianu glicerolu przy użyciu wagi o dokładności do 0,0001 g, a następnie dodano 1 ml pirydyny przy użyciu mikrostrzykawki pojemności 1 ml. Fiolkę zakapslowano, a dodatek pirydyny zważono dodatkowo z dokładnością do 0,0001 g. Uzyskano
w ten sposób roztwór monononadekanianu glicerolu – wzorca wewnętrznego do oznaczania nasyconych monoacylogliceroli SMG o stężeniu 250 mg/ml.
e) Wyznaczenie współczynnika odzysku dla oznaczania zawartości wolnych glukozydów steroli FSG
Celem wyznaczenia współczynnika odzysku FSG dla FAME oraz mieszanin oleju napędowego z FAME, dodano roztwór wzorcowy wolnych glukozydów steroli do próbek 100 % FAME, oleju napędowego zawierających FAME oraz bez udziału FAME, w dolnym zakresie krzywej wzorcowej – 12 μg/ml oraz w górnym zakresie krzywej wzorcowej – 60 μg/ml. Wykonano wydzielania frakcji zawierającej FSG techniką chromatografii cieczowej oraz ich analizy techniką chromatografii gazowej wg warunków podanych powyżej dla przedmiotowych próbek w czasie przed i po dodaniu roztworu wzorcowego wolnych glukozydów
steroli. Uzyskano wartości odzysku wahające się w granicach 100 %, a średnia wartość odzysku wyniosła 101,0 %. Z uwagi na wysoką wartość odzysku, dla którego różnica od wartości 100 % jest mniejsza niż wartość powtarzalności metody, przyjęto, że wyznaczony odzysk nie będzie uwzględniany w obliczeniach, z uwagi na brak wpływu na wynik końcowy oznaczenia. Odzysk wzięto pod uwagę podczas szacowania niepewności złożonej metody.
f) Oznaczenie zawartości nasyconych monoacylogliceroli oraz wolnych glukozydów steroli w przedmiotowych próbkach FAME i oleju napędowego zawierającego FAME
Przed rozpoczęciem badań przedmiotową próbkę oleju napędowego z dodatkiem 5 % (V/V) FAME poddano rozpuszczeniu ewentualnego osadu. Następnie umieszczono ją w suszarce w temperaturze 40 ºC w czasie 30 minut, by następnie poddać ją procesowi wytrząsania przez 1 minutę i na koniec pozostawić w celu z zrównania z temperaturą otoczenia.
Następnie na wadze analitycznej z dokładnością do 0,0001 g odważono 20 g próbki (±0,5 g), by umieścić ją w hermetycznej butelce Simax o pojemności 50 ml z zapisem dokładnej masy (m1).
Dalej do próbki dodano 0,02 ml roztworu wzorcowego monononadekanianu glicerolu (wzorca wewnętrznego oznaczania nasyconych monoacylogliceroli SMG), przy użyciu mikrostrzykawki o pojemności 0,05 ml. Próbkę dokładnie wymieszano. Kolejne czynności to postępowanie zgodnie z procedurą wydzielania opisaną powyżej. Przedmiotową próbkę dozowano dwukrotnie do chromatografu gazowego TRACE GC Ultra w ilości 1 µl. Na rysunku 12 przedstawiono chromatogram z analizy nasyconych monoacylogliceroli oraz wolnych glukozydów steroli dla próbki oleju napędowego z dodatkiem estrów metylowych kwasów tłuszczowych FAME w ilości 5 % (V/V).
Rys 12. Chromatogram z analizy nasyconych monoacylogliceroli oraz wolnych glukozydów steroli dla próbki oleju napędowego z dodatkiem FAME.
Zawartość poszczególnych nasyconych monoacylogliceroli CSMG,
wyrażonych w %(m/m), obliczano każdorazowo wg poniższego wzoru:
CSMG = (ASMG/AIS)*(mIS/m1)*100 % (4)
przy czym:
ASMG sumaryczna powierzchnia pików nasyconych monoacylogliceroli, AIS powierzchnia piku wzorca wewnętrznego – monononadekanianu
glicerolu,
mIS masa wzorca wewnętrznego dodanego do próbki (0,005 g), m masa próbki (20 g).
Zawartość wolnych glukozydów steroli CFSG, wyrażonych w mg/kg, obliczano
każdorazowo wg poniższego wzoru:
CFSG = ((AFSG*kFSG)/(1000000*m1))*100 % (5)
przy czym:
AFSG sumaryczna powierzchnia pików wolnych glukozydów steroli, m masa próbki (20 g),
1000000 współczynnik przeliczeniowy jednostki μg na g.
g) Wyznaczenie powtarzalności metody oznaczania nasyconych
monoacylogliceroli SMG oraz wolnych glukozydów steroli FSG
W celu wyznaczenia powtarzalności metody badawczej należy wykonać, w zależności od kosztów związanych z wykonaniem pojedynczego oznaczenia, od trzech do pięciu oznaczeń dla dostępnych próbek przedmiotowych. Do prawidłowej oceny powtarzalności niniejszej metodyki wykonano po sześć oznaczeń dla sześciu dostępnych próbek olejów napędowych z udziałem biokomponentu FAME, wzbogaconych o nasycone monoacyloglicerole SMG oraz wolne glukozydy steroli FSG w wymaganym zakresie metody badania. Obliczono odchylenie standardowe dla wartości średniej. Powtarzalność metody obliczono na podstawie odchylenia standardowego serii pomiarów zgodnie z normą ASTM E 691 wg poniższego wzoru:
robl= s . 2,8 (6)
przy czym:
s – odchylenie standardowe.
Wartość 2,8 zastosowania z powyższym wzorze obliczeniowym stanowi wartość statystyki z tablicy t-studenta dla czterech stopni swobody i poziomu ufności 95 %. W metodzie autorskiej oznaczania wolnych glukozydów steroli FSG uzyskane wartości względnych odchyleń standardowych wyrażonych w %, wyniosły od 0,3 do 3,0 %, co świadczy o bardzo dobrej precyzji metody z uwagi na nie przekroczenie w żadnym przypadku wartości 5 % względnego odchylenia standardowego. Wartość powyższa stanowi zalecane maksymalne odchylenie względne wyników uzyskiwanych typowymi metodami, które wykorzystują techniki chromatograficzne [Chromatografia Gazowa, Politechnika Gdańska, 2002].
Wyznaczoną powtarzalność poddano analizie pod kątem zależności od stężenia wolnych glukozydów steroli FSG. Nie stwierdzono zależności liniowej wyznaczonej powtarzalności od stężenia wolnych glukozydów steroli FSG, a zatem wyznaczona powtarzalność dla całego zakresu pomiarowego wyniosła:
r = 0,082 * X, mg/kg, gdzie X stanowił średni wynik oznaczenia zawartości FSG, wyrażony w mg/kg.
W przypadku oznaczania nasyconych monoacylogliceroli SMG uzyskane wartości względnych odchyleń standardowych wyrażonych w %, przyjmowały wartości od 0,8 do 2,3 %, co świadczy o bardzo dobrej precyzji opracowanej metodyki oznaczania SMG. Nie stwierdzono zależności liniowej wyznaczonej powtarzalności od stężenia nasyconych monoacylogliceroli SMG, a wyznaczona powtarzalność dla całego zakresu pomiarowego wyniosła: r = 0,066 * X, %(m/m), gdzie X stanowił średni wynik oznaczenia zawartości SMG, wyrażony w %(m/m).
Wyznaczono liniowość detektora płomieniowo – jonizacyjnego dla oznaczania wolnych glukozydów steroli FSG w oleju napędowym z dodatkiem biokomponentu FAME, w zakresie od 0,1 mg/kg do 3,2 mg/kg w przypadku ilości próbki 20 g. Przy zastosowaniu mniejszej ilości próbki do badań, takiej jak 1 g, górna granica zakresu metody przyjęła wartość 63,3 mg/kg. Ostatecznie, zakres roboczy metody
oznaczania wolnych glukozydów steroli ustalono na przedział od 0,1 mg/kg do 63,3 mg/kg. Dolną granicę oznaczalności określono na 0,1 mg/kg. Zakres wyznaczenia powtarzalności wyniósł: od 0,6 mg/kg do 55,5 mg/kg.
W przypadku oznaczania nasyconych monoacylogliceroli SMG zakres metody ograniczony był ilością dodanego wzorca wewnętrznego do próbki oraz granicą oznaczalności metody. A zatem, zakres metody oznaczania nasyconych
monoacylogliceroli SMG w oleju napędowym z dodatkiem biokomponentu FAME, przyjął wartości: od 0,0017 %(m/m) do 0,0250 %(m/m) w przypadku ilości próbki 20 g. Dolną granicę oznaczalności określono na 0,0017 %(m/m).
Powtarzalność wyznaczono dla przedmiotowych próbek olejów napędowych z dodatkiem biokomponentu FAME z zaobserwowanymi sygnałami pochodzącymi od nasyconych monoacylogliceroli SMG. Zakres wyznaczenia powtarzalności
h) Sprawdzenie odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej dla metody oznaczania SMG oraz FSG
Odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjną wdrażanej metody zweryfikowano poprzez powtórzenie badań próbek pod kątem zawartości nasyconych monoacylogliceroli SMG oraz wolnych glukozydów steroli FSG w zakresie dolnym