Oczyszczanie za pomocą anionowych, kationowych i amfoterycznych środków

Patent [Abe H.,Ishikura Y.; 2012] opisuje usuwanie z FAAE glukozydów steroli

poprzez dodanie jednego lub więcej środka powierzchniowo czynnego (surfaktanta) wybranego spośród:

- anionowych środków powierzchniowo czynnych, - kationowych środków powierzchniowo czynnych - amfoterycznych środków powierzchniowo czynnych

oraz wody do estru alkilowego kwasu tłuszczowego, i wymieszaniu mieszaniny. W kolejnym etapie w procesie odwirowania następowało oddzielenie agregatów z mieszaniny tak, aby zoptymalizować szybkość usuwania glukozydów steroli. Zastosowana ilość dodawanego środka powierzchniowo czynnego do FAAE, w postaci stałej lub ciekłej, mieściła się w przedziale od 0,01 % (m/m) do 10 % (m/m). Dodawanie surfaktanta do FAAE było prowadzone w postaci roztworu środka powierzchniowo czynnego w rozpuszczalnikach takich jak: woda, metanol, etanol, izopropanol, aceton, heksan.

Szczególnie zalecany przez autorów patentu był roztwór wodny surfaktantów. Roztwór ten może być dodawany porcjami lub jednorazowo w sposób ciągły lub

z przerwami w ilości do 1 % (m/m) do 300 % (m/m) w przeliczeniu na surowy ester alkilowy kwasu tłuszczowego. Minimalna zawartość surfaktanta w roztworze wodnym wyniosła 5% (m/m). Wg autorów patentu produkowane surowe estry alkilowe kwasów tłuszczowych na ogół zawierają od 10 mg/kg do 150 mg/kg glukozydów steroli, a wg przedstawionego rozwiązania usuwanych jest co najmniej 60 % glukozydów steroli z FAAE. Surfaktant lub jego roztwór dodawano do surowego FAAE w temperaturze od 40 ºC do 90 ºC, mieszano przez okres od 15 minut do 10 godzin, w sposób periodyczny lub ciągły. Wprowadzenie surfaktanta i wody powoduje, że w surowym estrze alkilowym kwasu tłuszczowego powstają nierozpuszczalne agregaty, w których są obecne glukozydy steroli. Zastosowane środki powierzchniowo czynne posiadają właściwości powodujące dyspergowanie tych agregatów w wodzie, co umożliwia łatwe usunięcie tych agregatów z FAAE. Usunięcie agregatów następuje w procesie odwirowania, filtracji, dekantacji lub poprzez zastosowanie kombinacji tych procesów. Proces wirowania zastosowany do wydzielenia agregatów prowadzono w zakresie temperatur od 40 ºC do 90 ºC z szybkością wirowania od 400 obr/min do 40 000 obr/min, a najodpowiedniejsze szybkości wirowania wyniosły od 2000 obr/min do 20000 obr/min. Zastosowano następujące rodzaje surfaktantów:

 anionowe: alkilosiarczany, alkiloeterosiarczany, alkiloeterokarboksylaty, alkilobenzenosulfoniany

i podobne. Preferowanymi anionowymi surfaktantami były alkilosiarczany lub alkilobenzenosulfoniany.

 kationowe: chlorki alkilotrimetyloamoniowe, bromki alkilotrimetyloamoniowe, chlorki alkilodimetyloamoniowe, alkilobenzylowe chlorki dimetyloamoniowe. Preferowanymi kationowymi surfaktantami były chlorki alkilotrimetyloamoniowe.

 amfotryczne: alkiloamidosulfobetainy propylu, sulfobetainy alkilowe, alkilohydroksylosulfobetainy, alkiloamidokarbobetainy propylu, karbobetainy alkilowe, tlenki alkiloaminowe. Preferowanymi amfoterycznymi surfaktantami były karbobetainy lub sulfobetainy.

W strukturze chemicznej podanych powyżej surfaktantów każda grupa alkilowa posiadała od 8 do 18 atomów węgla. Autorzy patentu wskazali, że najkorzystniejsza ilość atomów węgla w grupie alkilowej wynosi od 12 do 14 atomów węgla.

2.8.6. Zastosowanie enzymów lipazy lub glukozydazy na nośniku

hydrofobowym

Zgłoszenie patentowe [Brask J., Nielsen P.M.; 2010] opisuje sposób

enzymatycznego zmniejszania zawartości glukozydów steroli w mieszaninach zawierających estry alkilowe kwasów tłuszczowych, w którym co najmniej 80 % (m/m) kwasów tłuszczowych jest w postaci estrów alkilowych kwasów tłuszczowych. Proces obejmował etap kontaktowania kompozycji z enzymem zdolnym do przeprowadzenia procesu tzw. acylowania, czyli estryfikowania wolnych glukozydów steroli.

Stężenie glukozydów sterolowych w kompozycji przed kontaktowaniem z enzymem wynosiło około 300 mg/kg, natomiast po procesie kontaktowania wyniosło poniżej 5 mg/kg.

W kompozycji co najmniej 80 % (m/m) kwasów tłuszczowych było w postaci estrów alkilowych kwasów tłuszczowych z grupy: ester metylowy kwasu tłuszczowego, ester etylowy kwasu tłuszczowego, ester propylowy kwasu tłuszczowego, ester butylowy kwasu tłuszczowego i ester pentylowy kwasu tłuszczowego.

Zastosowanym enzymem była lipaza klasyfikowana jako EC 3.1.1.3.. Enzym wybrano z grupy składającej się z: Aspergillus lipazy, Aspergillus niger lipazy Thermomyces lanuginosa lipazy, Lipazy Candida antarctica, Lipazy Candida antarctica B, Candida cylindracae lipazy, Candida deformans lipazy; Candida lipolytica lipazy; Candida parapsilosis lipazy; Candida rugosa lipazy, Acnes Coryne bacterium lipazy; Crypto coccusspp. S-2 lipazy; Fusarium culmorum lipazy; Fusarium heterosporum lipazy; Fusarium oxysporum lipazy; Mucorja vanicus lipazy, Rhizomucormiehei lipazy, Rhizomucordelemar lipazy; Burkholderia (Pseudomonas) cepacia lipazy, Pseudomonas camembertii lipazy, Pseudomonas

fluorescens lipazy, Rhizopus lipazy; Rhizopusarrhizus lipazy; Staphylococcusaureus lipazy; Geotpichzum candidum lipazy; Hyphozyma Sp. lipazy, Klebsiellaoxytoca lipazy i ortologów typu dzikiego, ich homologów oraz ich wariantów o sekwencji aminokwasowej co najmniej w 99 % identycznej z którymikolwiek z pośród wymienionych powyżej enzymów typu dzikiego.

Enzym był unieruchomiony, kowalencyjnie lub niekowalencyjnie, znajdował się na nośniku lub był unieruchomiony przez uwięzienie w naturalnych lub syntetycznych matrycach takich jak zol-żel, alginian i karagenina. Proces unieruchomienia enzymu zachodził metodą sieciowania identyczną jak w przypadku usieciowanych kryształów enzymów (CLEC), usieciowanych agregatach enzymów (Clea) lub przez wytrącanie z kryształami soli takimi jak w białkach powlekanych mikro kryształami (PCMC).

Enzym był unieruchomiony na hydrofilowym nośniku wybranym z grupy składającej się z: porowatych cząstek organicznych takich jak tlenek glinu, krzemionka i krzemiany takie jak porowate szkło, zeolity, ziemia okrzemkowa, bentonit, wermikulit, hydrotalkit i porowatych cząstek organicznych składających się z węglowodanowych polimerów takich jak agaroza lub celuloza. Enzym był unieruchomiony na nośniku hydrofobowym zawierającym co najmniej jeden materiał wybrany z grupy składającej się z: syntetycznych polimerów takich jak poliakrylany, polimetakrylany, nylon, polietylen, polipropylen lub polistyren, hydrofobowa krzemionka i węgiel aktywowany [Brask J., Nielsen P.M.; 2010].

Z kolei zgłoszenie patentowe [Menzella H., Peiru S.,Vetcher L., 2013]

przedstawia sposób zmniejszania zawartości glukozydów steroli w zawierającej od 0,1 % do 30 % wody próbce. Jako surowiec zastosowano mieszaniny olejów, tłuszczy i biopaliw zawierających biodiesel. Proces obejmował mieszanie termostabilnego enzymu glukozydazy z próbką zawierającą glukozydy steroli w dobranych dla enzymu warunkach przez ustalony okres czasu. W procesie zachodziło zniszczenie części glukozydów steroli, co powodowało zmniejszenie o co najmniej 80 % ich zawartości w wymienionej próbce, do poziomu poniżej 20 mg/kg glukozydów steroli. Rozpuszczalność glukozydów steroli w próbce była

większa niż 100 mg/kg. Enzym hydrolizował wiązanie glikozydowe w glukozydzie sterolowym lub w acylowanym glukozydzie sterolowym. Zawierał on sekwencję aminokwasową wybraną spośród sekwencji przedstawionych przez autorów patentu. Etap kontaktowania prowadzono przez okres od 30 minut do 24 godzin w temperaturze między 85 °C a 110 °C. Wspomniana mieszanina reakcyjna zawierała składnik wybrany z grupy obejmującej enzym beta-glukozydazy, sterolowe esterazy, amyloglukozydazy i pektynazy. Enzym posiadał aktywność hydrolityczną co najmniej 5 g glukozydu sterolowego na gram enzymu w ciągu godziny, w temperaturze pomiędzy od 75 do 99 °C.

W zgłoszeniu patentowym opisano również sposób wytwarzania genu kodującego wariant sterolowej glikozydazy i obejmowało:

- hodowanie w pożywce kulturowej wiele komórek gospodarzy transformowanych z pierwszą biblioteką wariantu genów sterolowej glikozydazy, w którym ekspresja każdego wariantu genów sterolowej glikozydazy jest pod kontrolą promotora liniowo reagującego na stężenie induktora dodawanego do pożywki kulturowej, przy czym te komórki gospodarza wymagają do wzrostu sterolu i nie są w stanie syntetyzować ergosterol. Wspomniana pożywka kulturowa zawiera glukozydy steroli i pierwsze stężenie wspomnianego induktora tak aby umożliwić tylko komórce gospodarza ekspresję wariantu sterolowej glikozydazy z wystarczającą aktywnością do wytworzenia kolonii;

- odzyskiwanie z wymienionej kolonii wariantu genu sterolowej glikozydazy.

Ponadto iteracyjnie powtarza się etapy hodowli i odzyskiwania, w którym kolejny wariant biblioteki genów sterolowej glukozydazy jest generowany w każdej nowej iteracji wymienionych etapów z poprzedniego wariantu genu sterolowej glikozydazy odzyskiwanego z poprzedniej iteracji wymienionych etapy, przy czym niższe stężenia wspomnianego induktora dodaje się do wspomnianej pożywki kulturowej w każdej kolejnej iteracji etapów. Pierwsza biblioteka jest generowana za pomocą podatnego na błędy PCR lub ukierunkowanej mutagenezy oligonukleotydowej. Wektor ekspresyjny zawiera wektor ekspresji drożdży użyty do transformowania wspomnianych komórek oraz jest indukowany przez Cu2+

i beta-estradiol. Wspomniana komórka gospodarza zawiera zmutowaną komórkę drożdży. Patent obejmuje ponadto projektowanie i syntezę zoptymalizowanej sekwencji kodonu kodującą wspomniany wariant sterolowej glukozydazy. Wytwarzanie rekombinantu sterolowej glukozydazy obejmuje: ekspresję wspomnianej zoptymalizowanej sekwencji kodonu, w odpowiedniej heterologicznej komórce gospodarzu w celu wytworzenia i izolowania wspomnianego rekombinantu sterolowej glukozydazy. Wzrost odbywa się w temperaturze powyżej 85 °C.

3. CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA