Ocena przeżywalności bakterii w przygotowanych prototypach dodatków

Zróżnicowane i w większości niekorzystne warunki panujące w poszczególnych częściach układu pokarmowego wpływają na liczebność oraz rodzaj mikrobioty obecnej w danym środowisku. Skomponowane prototypy dodatków paszowych przeznaczone dla trzody chlewnej oraz drobiu zostały poddane pasażowaniu w przewodach pokarmowych w warunkach in vitro. Warunki doświadczeń zbliżone były do tych panujących w przewodach pokarmowych zwierząt monogastrycznych.

9.5.2.1. Ocena przeżywalności bakterii w prototypie dodatku paszowego dla trzody chlewnej w symulowanym układzie pokarmowym

Próbki paszy z dodatkiem liofilizowanego preparatu bakteryjnego oraz sam preparat skomponowany z odpowiednio dobranych szczepów bakterii poddawano działaniu kolejnych roztworów symulujących ślinę, sok żołądkowy i sok jelitowy. Wyniki doświadczenia przedstawiono na rysunku 5.

Próbka A Próbka B Etap transferu _{Liczebność populacji (jtk/cm3)}

0 h

Ślina, sok żołądkowy

Sok żołądkowy 120 min.

Sok jelitowy

Sok jelitowy 240 min.

*a- e średnie oznaczone różnymi literami w słupkach różnią się istotnie przy p <0,05

Rysunek 6. Liczba bakterii podczas pasażu paszy z dodatkiem preparatu (próbka A) i preparatu (próbka B) przez modelowy układ trawienia in vitro trzody chlewnej

Źródło: na podstawie badań własnych

Początkowa liczba bakterii różniła się o jedna jednostkę logarytmiczną, co wynikało z faktu, że próbka A byłą mieszanką paszy i liofilizowanego preparatu bakterii, podczas gdy próbkę B stanowił bezpośrednio preparat. Po kilkuminutowym działaniu śliny i dodaniu soku żołądkowego, liczebność bakterii spadała drastycznie. Spadek liczby żywych komórek był większy w próbce A, gdzie odnotowano ilość o 4 jednostki logarytmiczne niższą w stosunku do wartości początkowej. W próbce B spadek liczby bakterii wynosił 3 jednostki logarytmiczne. Po dwóch godzinach działania soku żołądkowego, obserwowano dalszy spadek liczebności populacji w obu próbkach, przy czym w próbce B liczba bakterii spadła aż o 3 jednostki logarytmiczne, a w próbce A, tylko o jedną. Po zmianie środowiska na sok jelitowy, liczba bakterii zrównała się w obu próbkach. Oznaczało to zarazem wzrost liczebności w próbce B, podczas gdy w próbce z paszą parametr ten utrzymywał się na porównywalnym poziomie. Po kolejnych 3 godzinach inkubacji w soku jelitowym odnotowano istotny wzrost liczby bakterii zarówno w preparacie, jak i paszy zmieszanej z preparatem. W obu przypadkach liczebność populacji kształtowała się na poziomie 104 jtk/cm3: w próbce A 3,3 x 104 jtk/cm3, w próbce B 7,0 x 104 jtk/cm3. 2,4 x 108 d 1,7 x 104 b 6,1 x 103 a 4,7 x 103 a 3,7 x 104 c 1,9 x 109 e 2,4 x 107 d 3,7 x 102 a 4,7 x 103 b 7,0 x 104 c

9.5.2.2. Ocena przeżywalności bakterii w prototypie dodatku paszowego dla kurcząt rzeźnych w symulowanym układzie pokarmowym

Próbki paszy z dodatkiem preparatu bakteryjnego oraz sam preparat skomponowany z odpowiednio dobranych szczepów bakterii poddawano trawieniu enzymatycznemu w warunkach in vitro: roztworem pepsyny imitującym trawienie w żołądku oraz roztworem pankreatyny, symulującym trawienie w jelicie cienkim. Wyniki doświadczenia przedstawiono na rysunku 7. Próbka A Próbka B Etap transferu Liczebność populacji (jtk/cm3) 0 h Bufor octanowy Bufor octanowy 30 min. Sok żołądkowy

Sok żołądkowy 45 min.

Sok jelitowy

Sok jelitowy 60 min

*a- e średnie oznaczone różnymi literami w słupkach różnią się istotnie przy p <0,05

Rysunek 7. Liczba bakterii podczas pasażu paszy z dodatkiem preparatu (próbka A) i preparatu (próbka B) przez modelowy układ trawienia in vitro drobiu

Źródło: na podstawie badań własnych

Początkowa liczba bakterii w próbkach A i B różniła się o jedną jednostkę logarytmiczną, podobnie jak w przypadku badań z preparatem dla trzody chlewnej. W ciągu 30 minut w buforze octanowym imitującym środowisko wola, liczebność populacji została istotnie

4,2 x 108 e 6,1 x 107 d 2,2 x 107 c 9,1 x 106 b 2,1 x 106 a 1,3 x 106 a 3,3 x 108 e 1,4 x 109 e 3,6 x 108 d 9,6 x 107 c 7,2 x 107 c 8,5 x 106 b 7,0 x 106 b 1,2 x 106 a

odnotowano po zastosowaniu roztworu pepsyny, przy czym większe zmiany były widoczne w próbce A. Ostatecznie, w środowisku symulującym jelito cienkie, liczba bakterii spadła do 1,2 x 106 jtk/cm3, podczas gdy w paszy z dodatkiem preparatu obserwowano przyrost liczby bakterii do 3,3 x 108 jtk/cm3 wzrosła z poziomu 1,6 x 106 do 3,3 x 108 jtk/cm3. Warto zauważyć, że w próbce zawierającej paszę z dodatkiem preparatu liczba bakterii w jelitach wzrosła do poziomu porównywalnego z liczebnością populacji na początku transferu.

W celu wywarcia korzystnego wpływu na organizm gospodarza, przyjmuje się, że bakterie probiotyczne muszą być żywe w konsumowanej żywności czy paszach, jak również w wystarczająco dużej liczbie dotrzeć do jelita grubego w celu ułatwienia kolonizacji i proliferacji [Shah 2000]. Na przeżywalność w przewodzie pokarmowym może wpłynąć wiele czynników, w tym zmiany pH na poszczególnych odcinkach, obecność soli żółciowych czy enzymów trawiennych [Pitino i in. 2010]. Większość badań dotyczących przeżywalności bakterii fermentacji mlekowej w niskim pH lub w obecności soli żółciowych jest przeprowadzana w osobnych doświadczeniach. Jednak badanie możliwości przeżycia bakterii w modelu obejmującym warunki panujące w żołądku i jelitach pozwala na uzyskanie pełnej wiedzy w zakresie tolerancji czynników wpływających negatywnie na badane szczepy. Może się bowiem zdarzyć, że pomimo redukcji liczebności bakterii w soku żołądkowym, co jest najczęściej obserwowane, mogą one wystarczająco licznie przetrwać transfer przez sok jelitowy. Może też być tak, że redukcja liczebności populacji będzie następowała zarówno w warunkach symulujących żołądek jak i jelito cienkie, co wykluczyłoby taki mikroorganizm z dalszych badań. W niniejszej pracy, przeprowadzono osobne doświadczenia w zakresie tolerancji niskiego pH i soli żółciowych na etapie skriningu 62 izolatów bakterii fermentacji mlekowej, jednak opracowane preparaty dla trzody chlewnej i drobiu, poddano pasażowi przez symulowany przewód pokarmowy odpowiednio dobrany do rodzaju zwierząt. Uzyskane wyniki wykazały dobrą przeżywalność bakterii obecnych w preparatach. Pomimo spadku przeżywalności podczas pasażu przez symulowany sok żołądkowy, liczba bakterii wzrastała w kolejnych odcinkach przewodu pokarmowego. Podobne obserwacje opisywali inni autorzy. Przykładowo, Guerra i in. [2007] badali przeżywalność czterech potencjalnie probiotycznych szczepów, w tym

P. acidilactici, E. faecium, L. lactis i L. casei podczas transferu przez symulowany przewód

pokarmowy. We wszystkich przypadkach obserwowano zmniejszenie liczby żywych komórek podczas przejścia przez żołądek. Natomiast po 180 min transferu, zarówno przez

część żołądkową jak i jelitową, przeżywalność bakterii kształtowała się na poziomie przekraczającym 2 x 106 jtk /cm3.

Przeżywalność bakterii może również zależeć od postaci, w jakiej są podawane biorąc pod uwagę zarówno formę utrwalenia, jak i rodzaj matrycy, w której są spożywane [Klingberg i Budde 2006]. Stwierdzono, że przeżywalność bakterii fermentacji mlekowej w żołądku może wzrosnąć w obecności produktów żywnościowych, które mają wpływ na wartość pH i mogą chronić komórki przed wpływem pepsyny i kwasu w żołądku [Bergamini i in. 2005]. Pinto i in. [2006] podjęli się określenia przeżywalności bakterii

L. johnsonii oraz L. plantarum podczas pasażu przez roztwory śliny, soku żołądkowego

i soków jelitowych. Wyniki badań in vitro wykazały, że zastosowanie odtłuszczonego mleka jako nośnika komórek zwiększyło odporność badanych szczepów bakterii na działanie niekorzystnych warunków towarzyszących pasażowaniu przez przewód pokarmowy. Podobnie, Lo Curto i in. [2011] stwierdzili wyższą przeżywalność trzech probiotycznych szczepów Lactobacillus casei ssp. shirota, L. casei ssp. immunitas i L. acidophilus ssp. johnsonii w symulowanym przewodzie pokarmowym, kiedy były podawane pasażowaniu w mleku w porównaniu z wodą jako nośnikiem. W niniejszej pracy nie obserwowano jednak dużego wpływu matrycy, chociaż w niektórych odcinkach symulowanego przewodu pokarmowego, zarówno trzody chlewnej jak i drobiu, można było zauważyć większą stabilność populacji w obecności paszy.

10. Charakterystyka szczepów bakterii fermentacji mlekowej wykorzystanych