Ocena wrażliwości izolatów bakterii fermentacji mlekowej na wybrane antybiotyki

120 wyselekcjonowanych wcześniej izolatów na wybrane antybiotyki. Jako kryterium doboru antybiotyków oraz ich stężeń wykorzystane zostały dane z wytycznych EFSA [2008, 2012], literatury tematycznej [Pérez-Sánchez i in. 2011; Ripamonti i in. 2011], Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów (KORLD) [Żabicka i Hryniewicz 2010], a także konsultacji z producentami dodatków paszowych dla zwierząt hodowlanych oraz hodowcami. Zgodnie ze wskazaniami EFSA, badania profilów antybiotykooporności i mechanizmów transmisji są niezbędne w celu nadania statusu QPS szczepom probiotycznym przeznaczonym do stosowania przemysłowego [EFSA 2013].

W prezentowanej pracy doświadczenia wykonano w oparciu o zmodyfikowaną procedurę badania antybiotykooporności szczepów klinicznych Kirby-Bauer’a [1966], którą

uwzględniających badanie bakterii fermentacji mlekowej w tym kierunku. Antybiogramy obejmowały zarówno antybiotyki o działaniu bakteriobójczym, jak i bakteriostatycznym. Początkowo metodyka uwzględniała wykorzystanie podłoża agarowego Mueller-Hinton, jednak wyniki badań pilotażowych wykluczyły jej zastosowanie ze względu na brak możliwości odczytu wyników. Zasadniczym problemem był słaby wzrost badanych bakterii, bądź też strefy zahamowania wzrostu były nieregularne lub niemożliwe do odczytu. Podobne obserwacje odnotowali Ocaña, Silva i Nader-Macías [2006] podczas badań antybiotykooporności potencjalnie probiotycznych szczepów bakterii Lactobacillus pochodzących z układów płciowych kobiet.

Stosując metodę antybiogramu do oznaczenia lekooporności bakterii fermentacji mlekowej wyszczególniono następujące poziomy oddziaływania: wrażliwy izolat (S), średniowrażliwy izolat (I) lub oporny izolat (R). Analizę wyników wykonano w oparciu o wytyczne zawarte w tabeli 5 (pkt. 8.3.3. niniejszej rozprawy doktorskiej). Szczegółowe wyniki badań wykonanych antybiogramów zawarto w załączniku elektronicznym, w tabelach E. 7 - E. 9, natomiast w tabeli 16 przedstawiono zestawienie liczby izolatów wykazujących określonych stopień wrażliwości na dany antybiotyk.

Tabela 16. Wrażliwość wybranych bakterii fermentacji mlekowej pochodzących z kału prosiąt oraz jelit kurcząt na działanie antybiotyków

Antybiotyk ^Stężenie _[mcg]

Izolaty wykazujące wysoką wrażliwość (S)

Izolaty wykazujące średnią wrażliwość (I)

Izolaty wykazujące oporność (R) Liczba izolatów Procent izolatów Liczba izolatów Procent izolatów Liczba izolatów Procent izolatów Prosięta ssące ampicylina 10 33 72 12 26 1 2 wankomycyna 30 1 2 0 0 45 98 gentamycyna 10 25 54 9 20 12 26 kanamycyna 30 7 15 19 40 22 46 streptomycyna 300 26 57 16 35 4 9 erytromycyna 15 45 98 1 2 0 0 klindamycyna 2 46 100 0 0 0 0 tetracyklina 30 43 93 3 7 0 0 chloramfenikol 30 45 98 1 2 0 0 Prosięta odsadzone ampicylina 10 19 76 6 24 0 0 wankomycyna 30 1 4 0 0 24 96

Antybiotyk ^Stężenie _[mcg]

Izolaty wykazujące wysoką wrażliwość (S)

Izolaty wykazujące średnią wrażliwość (I)

Izolaty wykazujące oporność (R) Liczba izolatów Procent izolatów Liczba izolatów Procent izolatów Liczba izolatów Procent izolatów gentamycyna 10 14 56 3 12 8 32 kanamycyna 30 5 20 9 36 11 44 streptomycyna 300 23 92 2 8 0 0 erytromycyna 15 25 100 0 0 0 0 klindamycyna 2 25 100 0 0 0 0 tetracyklina 30 22 88 2 8 1 4 chloramfenikol 30 24 96 0 0 1 4 Kurczęta rzeźne ampicylina 10 32 65 15 31 2 4 wankomycyna 30 2 4 0 0 47 96 gentamycyna 10 22 45 8 16 19 39 kanamycyna 30 5 10 20 39 26 51 streptomycyna 300 32 65 13 27 4 8 erytromycyna 15 49 100 0 0 0 0 klindamycyna 2 49 100 0 0 0 0 tetracyklina 30 48 98 1 2 0 0 chloramfenikol 30 49 100 0 0 0 0

Źródło: na podstawie badań własnych

Wrażliwość badanych izolatów bakterii fermentacji mlekowej na testowane antybiotyki była zróżnicowana. Przykładowe wyniki przedstawiono na fotografiach 17-22. Wszystkie badane izolaty charakteryzowały się wrażliwością na działanie klindamycyny oraz erytromycyny (w badanych stężeniach), za wyjątkiem jednego izolatu pochodzącego z kału prosiąt ssących, który wykazywał średnią wrażliwość na działanie erytromycyny. Większość izolatów (99%) była również wrażliwa na tetracyklinę oraz chloramfenikol. Tylko jeden izolat wykazał średnią wrażliwość na chloramfenikol, natomiast sześć izolatów na tetracyklinę (5%). Inaczej kształtowała się wrażliwość izolatów bakterii fermentacji mlekowej na pozostałe testowane antybiotyki. Dużą wrażliwość na ampicylinę w stężeniu 10 mcg wykazały 84 izolaty (70%), natomiast średnią wrażliwość wykazały 33 izolaty (28%). Brak wrażliwości stwierdzono w przypadku 3 izolatów (3%). Liczba izolatów bakterii fermentacji mlekowej wykazujących dużą lub średnią wrażliwość na działanie streptomycyny w stężeniu 300 mcg wynosiła 112 (93%). W przypadku gentamycyny obserwowano duże zróżnicowanie izolatów pod względem ich wrażliwości na ten

antybiotyk. Wrażliwość wykazywało 76 izolatów (63%), w tym 20 w stopniu średnim (17%), podczas gdy 39 izolatów (33%) było niewrażliwych na gentamycynę w badanym stężeniu. W przypadku kanamycyny i wankomycyny w stężeniu 30 mcg stwierdzono największy odsetek izolatów opornych. Zaobserwowano 59 izolatów (49%) wykazujących oporność na kanamycynę oraz 116 izolatów (97%) na wankomycynę.

Fotografia 17. KK 320 Fotografia 18. KK 232 Fotografia 19. DG 069 Fotografia 20. KK 015 S 300 _{S 300} AMP 10 _{AMP 10} VA 30 ^{VA 30} CN 10 CN 10 K 30 _{K 30} DA 2 C 30 TE 30 E 15 _{DA 2} TE 30 C 30 E 15

Fotografia 21. DG 240 Fotografia 22. KK 079

Fotografie 17-22. Wrażliwość wybranych izolatów bakterii fermentacji mlekowej na działanie antybiotyków

Źródło: wykonanie własne

Bakterie fermentacji mlekowej stosowane w preparatach probiotycznych lub jako kultury starterowe, mogą wykazywać oporność na antybiotyki. Dlatego istotne dla bezpieczeństwa projektowanych suplementów jest określenie potencjalnej antybiotykooporności [FAO/WHO 2002]. Oporność drobnoustrojów na antybiotyk (chemioterapeutyk) jest zjawiskiem, w którym średnie stężenia substancji badanej, wykazujące hamowanie rozwoju populacji drobnoustrojów w warunkach in vitro, przewyższają stężenia tej samej substancji możliwe do uzyskania in vivo [Janiec i Krupińska 2002]. Podstawowym typem jest oporność naturalna, która jest cechą szczepu lub gatunku, związaną najczęściej z nieskuteczną penetracją antybiotyku przez ściany komórkowe. Co istotne, nie jest ona przenoszona na inne mikroorganizmy, dlatego nie stanowi zagrożenia [Mazur 2002; Janiec i Krupińska 2002]. Problemem jest natomiast oporność nabyta, powstająca, gdy mikroorganizmy, będące początkowo wrażliwe na antybiotyk, nabierają oporności w wyniku zmian w ich genomie. Dzieje się to na najczęściej na skutek mutacji spontanicznej lub poprzez nabycie genu lub zespołu genów determinujących oporność od innych bakterii [Mathur i Singh 2005]. Istnieją dwa główne mechanizmy nabywania antybiotykoodporności przez mikroorganizmy: mutacja oraz horyzontalny transfer genów [Mathur i Singh 2005; Ammor i in. 2007]. Ponadto geny kodujące oporność na antybiotyki mogą być przenoszone drogą horyzontalnego transferu genów również do komórek niespokrewnionych. S 300 AMP 10 VA 30 CN 10 K 30 S 300 AMP 10 VA 30 CN 10 K 30

Ze względu na możliwość do przenoszenia cech lekooporności na inne mikroorganizmy, w tym również na bakterie patogenne, problem antybiotykooporności wśród bakterii fermentacji mlekowej może stanowić zagrożenie dla zdrowia ludzi i zwierząt. Jest to zjawisko szczególnie niepożądane w odniesieniu do szczepów probiotycznych, które ze względu na sposób ich zastosowania, mogą mieć styczność z mikroorganizmami bytującymi w przewodzie pokarmowym gospodarza. Tym samym istnieje prawdopodobieństwo przekazania genów oporności innym bakteriom, w tym patogennym. Największe zagrożenie związane jest z możliwością transmisji genów na elementach ruchomych, jak transpozony, do komórek mikroorganizmów patogennych czy potencjalnie patogennych. Wrodzona oporność raczej nie stanowi takiego problemu, a nawet może być postrzegana jako zjawisko pozytywne np. u osób poddawanych kuracjom z zastosowaniem leków przeciwdrobnoustrojowych, ponieważ może zapobiegać wyjałowieniu przewodu pokarmowego.

Bakterie fermentacji mlekowej posiadają dość szeroki zakres wrodzonej oporności na antybiotyki. Jednym z najlepiej scharakteryzowanych fenotypów jest oporność na wankomycynę. Wiele danych literaturowych wskazuje na występowanie tej cechy u bakterii z rodzajów Lactobacillus, Pediococcus i Leuconostoc [Coppola i in. 2005; Pérez-Sánchez i in. 2011]. Podobnie, w niniejszej pracy, większość badanych izolatów bakterii fermentacji mlekowej (97%) nie wykazywała wrażliwości na wankomycynę w zastosowanym stężeniu. Jedynie cztery spośród badanych izolatów bakterii były wrażliwe na ten chemioterapeutyk. Oporność na wankomycynę wynika z braku docelowych receptorów dla tego antybiotyku w ścianie komórkowej wspomnianych rodzajów bakterii. Działanie wankomycyny na komórki bakterii zachodzi na drodze interakcji z prekursorami peptydoglikanu w ścianie komórkowej i tworzenie kompleksu z D–alanylo–D–alaniną fragmentu prekursora peptydu w miejscu wiązania podjednostek peptydoglikanu. Tym samym blokuje polimeryzację peptydoglikanu i transpeptydację. W przypadku bakterii fermentacji mlekowej D-alanina jest zastąpiona D-mleczanem lub D-seryną w muramylo-pentapeptydzie, nie umożliwiając przyłączenie wankomycyny. Jest to cecha kodowana chromosomalnie i nie ulegająca transmisji [Delcour i in. 1999; Ammor i in. 2008; Gueimonde i in. 2013]. Również oporność bakterii z rodzaju Lactobacillus na działanie antybiotyków aminoglikozydowych (np. gentamycyna, kanamycyna, streptomycyna), uważana jest za wrodzoną. Jest to związane z brakiem transportu elektronowego za pośrednictwem cytochromu, który odpowiedzialny jest za wchłanianie antybiotyku

[Monteagudo-Mera i in. 2012]. Również inni autorzy opisują występowanie wśród bakterii fermentacji mlekowej szczepów opornych na aminoglikozydy. Liu i in. [2009] stwierdzili oporność na gentamycynę i streptomycynę w przypadku, odpowiednio, 16 i 2 szczepów bakterii z rodzajów Lactobacillus i Enterococcus spośród 41 badanych. D’Aimmo i in. [2007], badając zjawisko antybiotykoodporności wśród bakterii izolowanych z fermentowanych produktów mlecznych i preparatów farmaceutycznych, obserwowali oporność

S. thermophilus na kanamycynę i streptomycynę oraz Bifidobacterium sp. na wszystkie

aminoglikozydy. Oporność na aminoglikozydy w przypadku bakterii z rodzaju

Bifidobacterium opisali również inni autorzy [Temmerman i in. 2003; Moubareck i in. 2005].

Według Żabicka i Hryniewicz [2010] oporność bakterii na gentamycynę oznacza również oporność na wszystkie antybiotyki z grupy aminoglikozydów w tym kanamycynę, niezależnie od wyników uzyskanych in vitro, za wyjątkiem streptomycyny. W prezentowanej pracy zaobserwowano taką zależność w przypadku 30 izolatów, które wykazywały oporność zarówno na gentamycynę jak i kanamycynę, przy jednoczesnej wrażliwości na streptomycynę. Jeden z badanych izolatów bakterii był niewrażliwy zarówno na kanamycynę jak i streptomycynę.

Bakterie z rodzaju Lactobacillus sp. wykazują oporność na chinolony (ciprofloksacynę, norfloksacynę, kwas nalidyksowy), chociaż mechanizm nie został zdefiniowany [Hummel i in. 2007], a także wrodzoną oporność na bacytracynę, cefoksytynę, metronidazol, nitrofurantoinę i sulfadiazynę [Tynkkynen i in. 1998; Danielsen i Wind 2003; Zhou i in. 2005; Bernardeau i in. 2008].

Mikroorganizmy te są natomiast wrażliwe na inhibitory syntezy ściany komórkowej jak penicyliny i ampicyliny [Danielsen i Wind 2003] oraz inhibitory syntezy białek, w tym na chloramfenikol, erytromycynę, linkomycynę, klindamycynę czy tetracykliny [Aymerich i in. 2006; Hummel i in. 2007; Comunian i in. 2010; Landeta i in. 2013; Federici i in. 2014]. Potwierdzają to również badania przedstawione w niniejszej pracy. Tylko nieliczne izolaty wykazywały oporność na antybiotyki z wymienionych powyżej grup. Podobnie, Aymerich i in. [2006] stwierdzili niewielki odsetek szczepów wykazujących oporność m.in. na ampicylinę i tetracyklinę badając izolaty pochodzące z fermentowanych, podsuszanych kiełbas. Liu i in. [2009] odnotowali oporność na erytromycynę tylko w przypadku dwóch szczepów z rodzaju Enterococcus spośród 41 badanych izolatów bakterii fermentacji mlekowej.

Najczęściej, autorzy podkreślają, że wrażliwość na antybiotyki jest cechą szczepozależną. Poza tym antybiotykooporność może pojawić się w wyniku mutacji. Przykładem jest oporność na erytromycynę stwierdzona w przypadku komercyjnego szczepu B. bifidum Yakult YIT 400, która powstała na skutek mutacji w regionie 23S rRNA zlokalizowanym na chromosomie, dzięki czemu ryzyko transferu jest minimalne [Sato i Iino 2010]. Jak wskazują dane literaturowe, bakterie fermentacji mlekowej mogą wykształcić więcej niż jeden mechanizm oporności na dany antybiotyk, co tylko potwierdza, że badanie w tym kierunku bakterii fermentacji mlekowej o potencjalnym zastosowaniu przemysłowym jest niezbędne.

Pomimo podkreślanej konieczności badania antybiotykooporności bakterii fermentacji mlekowej, nie ma jak dotąd jednolitych standardów dla tej grupy mikroorganizmów. Wymagania i dostępne metodyki badań wykorzystujących antybiogramy dostarczone przez instytucje międzynarodowe takie, jak EFSA, NCCLS, czy polskie, w tym KORLD, dotyczą jedynie wybranych, zagrażających zdrowiu publicznemu, klinicznych szczepów tlenowych i beztlenowych bakterii lub drożdży. Bakterie fermentacji mlekowej zostały zaliczone przez Instytut Standardów Klinicznych i Laboratoryjnych CLSI w tym kontekście do rzadko izolowanych i wymagających pałeczek. Jako zalecaną metodę badania wrażliwości na antybiotyki zasugerowano określenie metody MIC na podłożu Mueller-Hinton z krwią końską [Jorgensen and Hindler 2007]. Wielu autorów stosuje jednak nadal metodę krążkowo-dyfuzyjną, szczególnie w celach skriningowych [Saeed i in. 2014; El Jeni i in. 2015; Morandi i in. 2015]. W prezentowanej pracy również wykorzystano tą metodę, przede wszystkim ze względu na dużą liczbę badanych izolatów.

Podsumowując, w prezentowanej pracy wybrane do badań antybiotyki hamowały wzrost izolatów bakterii fermentacji mlekowej w stopniu silnym i umiarkowanym. Na podstawie otrzymanych wyników wybrano 62, które cechował brak lub niska dopuszczalna antybiotykooporność. Zostały one tym samym wyselekcjonowane do kolejnych etapów badań. Pośród wybranych na tym etapie bakterii, 29 izolatów pochodziło z przewodów pokarmowych prosiąt ssących, 12 izolatów z przewodów prosiąt odsadzonych oraz 21 izolatów z przewodów pokarmowych kurcząt rzeźnych.

9.3.3. Określenie zawartości najważniejszych kwasów organicznych w hodowli badanych