Przygotowanie dodatków paszowych z wykorzystaniem wybranych izolatów bakterii

Do skomponowania dwóch dodatków paszowych przeznaczonych dla drobiu i trzody chlewnej wykorzystano 10 zróżnicowanych taksonomicznie izolatów wyselekcjonowanych spośród bakterii wybranych na podstawie wcześniej przeprowadzonych badań.

8.5.1. Dobór nośnika i składników projektowanych preparatów

Wybór podłoża, stanowiącego główny nośnik dodatków paszowych, wykonano, oceniając wzrost wybranych izolatów bakterii Lactobacillus paracasei KK 160, Lactobacillus

rhamnosus KK 270 na dwóch różnych pożywkach.

Hodowle wybranych izolatów bakterii fermentacji mlekowej prowadzono w kolbach Erlenmayera o objętości 300 cm3, zawierających 190 cm3 jałowej płynnej pożywki bazującej na mleku odtłuszczonym lub mące żytniej (pkt 7.4.4.), którą zaszczepiano 10 cm3 inokulum 24 godzinnej bakterii. Po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C, wykonywano posiew ilościowy z wykorzystaniem podłoża agarowego MRS.

8.5.2. Otrzymywanie liofilizowanych hodowli bakterii

Liofilizację hodowli wybranych izolatów bakterii przygotowanych na nośniku bazującym na mleku odtłuszczonym przeprowadzono na podłożu wzbogaconym o maltodekstrynę oraz trehalozę [Lyon, Sethi i Glatz 1993; Kimoto-Nira i in. 2010]. Prace doświadczalne

prowadzono przy użyciu liofilizatora półkowego serii Alpha 1 D. Próbki 24 hodowli każdego z izolatów osobno, w ilości 20 cm3, przenoszono do jałowych jednorazowych pojemników z polipropylenu o pojemności 60 cm3. Następnie badane próbki przetrzymywano w zamrażarce w temperaturze -20°C przez 72h, po czym przeprowadzano liofilizację. Proces próżniowego suszenia sublimacyjnego odbywał się w stałych parametrach: ciśnienie 63 Pa, czas 96 godzin, temperatura półek grzejnych liofilizatora 30°C.

8.5.3. Przygotowanie biopreparatów

Próbki 10 zliofilizowanych hodowli bakterii przygotowanych według pkt. 8.5.2. mielono i mieszano dokładnie w równych proporcjach. W ten sposób przygotowano dwa preparaty, jeden przeznaczony dla trzody chlewnej, a drugi dla drobiu. Każdy zawierał hodowle pięciu izolatów. Pochodzenie szczepów bakterii było tożsame z grupą zwierząt monogastrycznych dla których będą one przeznaczone.

8.5.4. Ocena stabilności liofilizowanych hodowli bakterii oraz preparatów podczas przechowywania

Po przeprowadzeniu liofilizacji określano stabilność 10 liofilizowanych hodowli bakterii oraz 2 skomponowanych preparatów zawierających wyselekcjonowane szczepy. Ocenę liczebności populacji na podstawie posiewów ilościowych przeprowadzano bezpośrednio po liofilizacji oraz po 30 dniach przechowywania w temperaturze 4°C oraz -22°C. Próbki do oceny stabilności podczas przechowywania trzymano w szczelnie zamkniętych, jałowych pojemnikach. Bezpośrednio przed badaniem próbki mielono i wykonywano posiewy ilościowe z wykorzystaniem podłoża MRS agar.

Stabilność podczas przechowywania badanych preparatów określano porównując zmiany liczebności bakterii między posiewami wykonanymi bezpośrednio po liofilizacji po 30 dniach przechowywania. Parametry testu przechowywania symulowały 30 dniowy okres przechowywania preparatu w warunkach chłodniczych (4°C) oraz mrożenia (-20°C).

8.5.5. Ocena przeżywalności bakterii obecnych w preparatach w symulowanym układzie pokarmowym

W celu określenia przeżywalności szczepów bakterii fermentacji mlekowej w symulowanym układzie pokarmowym, wykorzystano modele in vitro trzody chlewnej [Boisen i Fernández 1997; Minekus 1998; Avantaggiato, Havenaar i Visconti 2003;

Versantvoort i in. 2005] oraz drobiu [Versantvoort i in. 2005; Latorre i in. 2015; Menezes-Blackburn, Gabler i Greiner 2015]. Opracowane modele in vitro przewodów pokarmowych zwierząt monogastrycznych obejmowały warunki panujące w początkowych odcinkach tych przewodów. W przypadku świń zastosowane warunki odzwierciedlały: jamę gębową, żołądek, jelito cienkie, a w przypadku kur: wole, żołądek i jelito cienkie. W badaniach nie ujmowano doświadczeń związanych z symulacją jelita grubego.

8.5.5.1. Preparat przeznaczony dla trzody chlewnej

Przeżywalność bakterii obecnych w preparatach przygotowanych według pkt. 8.5.3. oceniano poddając je transferowi przez symulowany przewód pokarmowy. Próbki do badań stanowiły: liofilizowany preparat zmieszany z paszą oraz sam preparat, taki dobór miał na celu określenie zależności przeżywalności badanych bakterii w warunkach spożycia ich z pokarmem oraz bez.

W doświadczeniach wykorzystano komercyjną paszę - uniwersalny koncentrat białkowy do stosowania w żywieniu tuczników w okresie tuczu. Mieszanka ta sporządzona jest na bazie m.in. zbóż, wysokobiałkowych śrutów poekstrakcyjnych, premiksu witaminowo-mineralnego, dodatków mineralnych jak również związków biologicznie czynnych i innych komponentów. Próbkę A stanowiło 5 g koncentratu białkowego z 5% dodatkiem liofilizatu preparatu bakteryjnego, próbkę B stanowiło 5 g 100% preparatu.

Tabela 7. Model trawienia in vitro trzody chlewnej Odcinek przewodu

pokarmowego

Roztwór symulujący środowisko danego odcinka przewodu pokarmowego

Zastosowana ilość Czas zalegania pokarmu

Jama gębowa symulowany r-r śliny 7,50 cm3 5 minut

woda destylowana 12,50 cm3

Żołądek 0,1 M bufor fosforanowy 250,00 cm3 120 minut

0,2 M r-r HCl 100,00 cm3

r-r wodny pepsyny 25 mg/ cm3 10,00 cm3

Jelito cienkie r-r wodny pankreatyny 100 mg/ cm3 10,00 cm3 240 minut

0,6 M r-r NaOH 50,00 cm3

0,2 M bufor fosforanowy 100,00 cm3

pH matrycy na poszczególnych etapach badań ustalano roztworami 1M wodorotlenku sodu oraz 1M kwasu solnego.

Źródło: opracowanie własne na podstawie badań Boisen i Fernández [1997]; Minekus [1998]; Avantaggiato, Havenaar i Visconti [2003]; Versantvoort i in. [2005]

Wykorzystany model trawienia in vitro trzody chlewnej obejmował trzystopniowy proces trawienia zachodzący w jamie gębowej, żołądku oraz jelicie cienkim (tab. 7). Preparaty A i B poddano wstępnemu trawieniu w 39°C w roztworze śliny przez 5 minut, następnie w symulowanym soku żołądkowym przez 2h oraz jelitowym przez 4h. W każdym etapie badana mieszanina była inkubowana w temperaturze 39°C w warunkach ciągłego mieszania z szybkością 150 obrotów na minutę na wytrząsarce obrotowej w celu zapewnienia jednorodnego rozkładu wszystkich składników. Na początku każdego z odcinków przewodu pokarmowego oraz po upływie czasu zalegania pobierano próbki, z których wykonywano posiewy ilościowe w celu oznaczenia przeżywalności badanych bakterii.

8.5.5.2. Ocena przeżywalności bakterii obecnych w preparacie przeznaczonym dla drobiu w symulowanym przewodzie pokarmowym

Liofilizowany preparat przygotowanych według pkt. 8.5.3. zmieszany z paszą, jak również sam preparat, poddano transferowi przez symulowany przewód pokarmowy drobiu w celu określenia przeżywalności bakterii w trakcie procesu trawienia. Dobór próbek miał na celu określenie zależności przeżywalności badanych bakterii w warunkach w przypadku spożycia ich z pokarmem oraz bez. Do badań wykorzystano komercyjną paszę kruszoną na bazie pszenicy przeznaczoną do żywienia brojlerów w okresie od 10 do 20 dnia tuczu. Próbkę A stanowiła pasza z 5% dodatkiem liofilizowanego preparatu bakteryjnego, próbkę B stanowił sam preparat.

Schemat modelu trawienia drobiu in vitro obejmował trzystopniowy proces trawienia, w tym: wole, żołądek (gruczołowy i mięśniowy) oraz jelito cienkie (tab. 8).

Tabela 8. Schemat zastosowanego modelu trawienia in vitro drobiu Odcinek przewodu

pokarmowego

Roztwór symulujący środowisko danego odcinka przewodu pokarmowego

Zastosowana ilość Czas zalegania pokarmu

Wole 50 mM bufor octanowy 15,00 cm3 30 minut

Żołądek 1M r-r kwasu solnego - HCl 1,40 cm3 45 minut r-r pepsyny w buforze octanowym 2,60 cm3

Jelito cienkie r-r wodny pankreatyny 3,25 cm3 60 minut 1 M r-r wodorowęglanu sodu -

NaHCO3

3,25 cm3

pH matrycy na poszczególnych etapach badań ustalano roztworami 1M wodorotlenku sodu oraz 1M kwasu solnego

Menezes-Trawienie treści pokarmowej inicjowane było przez mieszanie badanych próbek A i B w ilości 5 g z buforem octanowym w czasie 30 min. Następnie, dodawano kolejno soki żołądkowe i jelitowe w celu symulowania procesów trawienia odpowiednio w żołądku (45 min) i jelicie cienkim (60 min). W każdym etapie badana mieszanina była inkubowana w temperaturze 40°C w warunkach ciągłego mieszania z szybkością 150 obrotów na minutę na wytrząsarce obrotowej w celu zapewnienia jednorodnego rozkładu wszystkich składników. Na początku każdego z odcinków przewodu pokarmowego oraz po upływie czasu zalegania pobierano próbki, z których wykonywano posiewy ilościowe w celu oznaczenia przeżywalności badanych bakterii.