Selekcja na podstawie wytycznych FAO/WHO oraz wybranych wyróżników

8.3.1. Opracowanie schematu postępowania dot. selekcji badanych bakterii

Schemat selekcji 565 izolatów bakterii fermentacji mlekowej opracowany został na podstawie wytycznych FAO/WHO oraz danych literaturowych i przedstawiony na rysunku 2 w rozdziale 4.2. „Zakres pracy”.

8.3.2. Określenie aktywności przeciwdrobnoustrojowej

Antagonistyczne oddziaływanie izolatów bakterii fermentacji mlekowej oznaczono metodą dyfuzji studzienkowej. Na etapie początkowej selekcji przebadano 565 izolatów bakterii wobec 10 mikroorganizmów wskaźnikowych, w dalszym etapie po 18 miesiącach 62 izolaty wobec 14 mikroorganizmów wskaźnikowych. Podczas oceny właściwości antybakteryjnej 62 izolatów, hodowle prowadzono tak, by po ich zakończeniu gęstość kształtowała się na porównywalnym poziomie, tj. 1010 jtk/cm3.

Oznaczenie aktywności antybakteryjnej

Z 24 godzinnych hodowli bakterii wskaźnikowych przygotowywano zawiesiny w soli fizjologicznej o gęstości optycznej ustalonej na poziomie 0,5 w skali McFarlanda. Posiewy wykonano metodą zalewową, po zestaleniu agaru jałowym korkoborem o średnicy 10 mm

fermentacji mlekowej w ilości 0,1 cm3. Gęstość optyczna hodowli została zbadana przy pomocy densytometru. Warunki inkubacji były zgodne z optimum temperaturowym wzrostu poszczególnych bakterii wskaźnikowych i wynosiły 30°C lub 37°C przez 24 godziny.

Próby zawierające mikroaerofilne bakterie Campylobacter jejuni i bezwzględnie beztlenowe bakterie Clostridium perfringens inkubowane były w eksykatorze, w którym powietrze atmosferyczne zastąpiono dwutlenkiem węgla. Badania przeprowadzono w 3 równoległych powtórzeniach. W celu otrzymania wyników mierzona była średnica zahamowania wzrostu z uwzględnieniem studzienki (10 mm). Kontrolę stanowił bulion MRS w ilości 0,1 cm3. Dla uzyskanych wyników obliczona została wartość odchylenia standardowego.

8.3.3. Oznaczanie wrażliwości bakterii fermentacji mlekowej na wybrane antybiotyki Wrażliwość 120 izolatów bakterii fermentacji mlekowej wybranych na podstawie wyników aktywności antybakteryjnej na antybiotyki określono za pomocą metody dyfuzji krążkowej z wykorzystaniem komercyjnych krążków antybiotykowych [Torshizi i in. 2008; Petsuriyawong i Khunajakr 2011; Pérez-Sánchez i in. 2011].

Z 24 godzinnej hodowli bakterii fermentacji mlekowej przygotowywano zawiesiny w soli fizjologicznej, ustalając gęstość optyczną na poziomie 1,0 w skali McFarlanda. Następnie, wykonano posiewy metodą zalewową, a po zestaleniu pożywki nanoszono na powierzchnię krążki antybiotykowe (tab. 5). W badaniach wykorzystano pożywki Mueller-Hinton i MRS. Próbki inkubowano w warunkach względnie beztlenowych w eksykatorze wysyconym CO2

w temperaturze 37°C przez 24 godziny. Oznaczenia wykonywane były w trzech równoległych powtórzeniach. Kontrolę stanowiły krążki bibułowe nasączone roztworem soli fizjologicznej.

Strefy zahamowania wzrostu odczytywano mierząc średnicę oddziaływania antybiotyków wobec izolatów bakterii fermentacji mlekowej, uwzględniając wielkość krążków antybiotykowych (6 mm). Kryteria analizy wyników wrażliwości mikroorganizmów na działanie antybiotyków określone zostały na postawie zmodyfikowanych wytycznych CLSI (ang. The Clinical and Laboratory Standards Institute) wykorzystanych przez Charteris i in. [1998; 1999], Vlková i in. [2006] i Han i in. [2015]. Podział mikroorganizmów uwzględniający stopień oddziaływania antybiotyków był uzależniony od wielkości stref zahamowania wzrostu. Wyszczególniono: mikroorganizmy oporne (R – ang. resistance), które wykazywały brak bądź znikomą wrażliwość na działanie antybiotyków, średnio

wrażliwe izolaty bakterii (I – ang. intermediate susceptibility) oraz wrażliwe izolaty bakterii fermentacji mlekowej (S – ang. susceptibility). Szczegółowe wytyczne do interpretacji zawiera tabela 5.

Tabela 5. Wytyczne dotyczące podziału izolatów na podstawie wyników wrażliwości na wybrane antybiotyki

L.p. Antybiotyk ^Stężenie [mcg]

Średnica zahamowania wzrostu (mm)

Oporny izolat - R ^{Średnio wrażliwy}

izolat - I ^{Wrażliwy izolat - S}

1. ampicylina 10 ≤21,99 22,00-28,99 ≥29,00 2. wankomycyna 30 ≤9,99 10,00-11,99 ≥12,00 3. gentamycyna 10 ≤12,99 13,00-14,99 ≥15,00 4. kanamycyna 30 ≤13,99 14,00-17,99 ≥18,00 5. streptomycyna 300 ≤15,99 16,00-20,99 ≥21,00 6. erytromycyna 15 ≤13,99 14,00-17,99 ≥18,00 7. klindamycyna 2 ≤14,99 15,00-16,99 ≥17,00 8. tetracyklina 30 ≤11,99 12,00-14,99 ≥15,00 9. chloramfenikol 30 ≤16,99 17,00-19,99 ≥20,00

Źródło: opracowanie własne na podstawie Charteris i in. [1998; 1999], Vlková i in. [2006] i Han i in. [2015]

8.3.4. Oznaczanie zawartości wybranych kwasów organicznych w hodowlach badanych izolatów bakterii fermentacji mlekowej

Określenie zawartości kwasów: mlekowego, octowego, propionowego i bursztynowego w 24 godzinnych hodowlach bakterii na podłożu bulionowym MRS przeprowadzono metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Próbki hodowli o pojemności 2 cm3 odwirowywano w jałowych probówkach wirówkowych typu eppendorf (10 000 rpm/min, 10 minut) w wirówce Centifuge 5804R, Eppendorf AG. Supernatanty przesączano następnie przez filtry Millex®-LCR 0,22 µm (Millipore) do jałowych probówek wirówkowych typu eppendorf.

Badania wykonano na chromatografie cieczowym 2695 Waters sprzężonym z detektorem refraktometrycznym 2414 Refractive Index (RI) detector (Waters, Milford, MA, USA). Do oznaczeń używano kolumny Animex HPX-87H 300 x 7,8 mm (BIO-RAD). Eluent stanowił 0,004 M roztwór H2SO4, przy przepływie 0,75 cm3/min. Jako standardy stosowano roztwory kwasów: mlekowego, octowego, propionowego i bursztynowego o stężeniu 0,1 µg/µl. Oznaczenie prowadzono w temperaturze 65C. Identyfikacji dokonano metodą

standardu zewnętrznego z wykorzystaniem powierzchni pików. Oznaczenia wykonywane były w trzech równoległych powtórzeniach.

8.3.5. Oznaczanie wybranych właściwości enzymatycznych

Sześćdziesiąt dwa izolaty, które zostały wybrane na podstawie wyników antybakteryjnych właściwości oraz wrażliwości na antybiotyki poddano ocenie w zakresie wybranych właściwości biochemicznych, w tym proteolitycznych, amylolitycznych i lipolitycznych.

Oznaczenia mające na celu określenie wykrywania aktywności wybranych enzymów wykonano na podstawie metodyki według Taheri i in. [2009a], Guo i in. [2010] oraz Moslehishad i in. [2013] zmodyfikowanej w oparciu o przepisy na podłoża opisane przez Burbianka, Pliszka i Burzyńska [1983]. Do badań wykorzystywano 24 godzinne hodowle izolatów bakterii fermentacji mlekowej.

8.3.5.1. Oznaczanie właściwości proteolitycznych

W celu oznaczenia właściwości proteolitycznych, na powierzchnię pożywki agarowej z mlekiem (opisaną w pkt. 7.4.3.) nanoszono 10 µl hodowli izolatów, a następnie płytki Petriego inkubowano w warunkach względnie beztlenowych przez 24 godzin w temperaturze 37°C. Po inkubacji obserwowano występowanie strefy przejaśnienia otaczającej kolonię. Oznaczenia wykonywane były w trzech równoległych powtórzeniach.

8.3.5.2. Oznaczanie właściwości amylolitycznych

W celu wykrycia właściwości amylolitycznych, doświadczenia poprzedzała hodowla izolatów na podłożu płynnym zawierającym 2% dodatek skrobii (patrz pkt. 7.4.3.). Badania wykonywano poprzez naniesienie 10 µl hodowli izolatów na powierzchnię pożywki agarowej zawierającej skrobię. Płytki Petriego inkubowano w warunkach względnie beztlenowych przez 24 godziny w temperaturze 37°C. Po inkubacji, w celu wykrycia czystych stref wokół kolonii, płytki Petriego zalewano 3 cm3 płynu Lugola. Obserwowano zabarwienie podłoża na ciemny granatowy kolor i występowanie stref przejaśnienia otaczających kolonie. Oznaczenia wykonywane były w trzech równoległych powtórzeniach.

8.3.5.3. Oznaczanie właściwości lipolitycznych

Określenie właściwości proteolitycznych, wykonano nanosząc na powierzchnię pożywki agarowej z dodatkiem polisorbatu - Tween 80 oraz chlorku wapnia (opisaną w pkt. 7.4.3)

nanoszono 10 µl hodowli izolatów, a następnie płytki Petriego inkubowano w warunkach względnie beztlenowych przez 24 godziny w temperaturze 37°C. Po inkubacji obserwowano występowanie strefy zmętnienia otaczającej kolonię. Była ona wynikiem reakcji uwolnionych przez lipazy kwasów tłuszczowych z obecnymi w pożywce jonami wapnia, które powodują powstanie nierozpuszczalnych mydeł wapniowych. Oznaczenia wykonywane były w trzech równoległych powtórzeniach.

8.3.6. Ocena przeżywalności bakterii fermentacji mlekowej w warunkach panujących w przewodzie pokarmowym

Oceniając wpływ warunków panujących w przewodzie pokarmowym zwierząt na przeżywalność badanych izolatów uwzględniono zróżnicowane stężenie kwasu solnego oraz soli żółciowych.

8.3.6.1. Przygotowanie bakterii do oceny przeżywalności w obecności kwasu solnego i soli żółciowych

Próbki hodowli bakterii o gęstości na poziomie 1010 jtk/cm3, w ilości 1 cm3 odwirowywano przez 5 minut przy obrotach 7500 rpm/min w wirówce Centifuge 5804R, Eppendorf AG. Supernatanty zlewano, a pozostały osad zawieszano w 1 cm3 buforu fosforanowego. Próby ponownie odwirowywano (7500 rpm/min, 5 min), a następnie osad zawieszano w 1 cm3

pożywki bulionowej MRS [Torshizi i in. 2008; Taheri i in. 2009a]. Tak przygotowane zawiesiny baterii wykorzystywano następnie w doświadczeniach określających wpływ niskiego pH i soli żółciowych na ich przeżywalność.

8.3.6.2. Określenie tolerancji niskiego pH panującego w soku żołądkowym

Ocenę wpływu pH środowiska na przeżywalność badanych izolatów bakterii fermentacji mlekowej badano z wykorzystaniem mikropłytek inkubując bakterie w pożywce MRS, której pH ustalono na poziomie 2 i 3. Odpowiednią wartość pH uzyskano mieszając w odpowiednich proporcjach zawiesinę bakterii z bulionem MRS o pH 1,0, ustalonym przy pomocy 1 M kwasu solnego. Inokulat przygotowano zgodnie z opisem w punkcie 8.1. Inkubację prowadzono w warunkach względnie beztlenowych w eksykatorze wysyconym CO2 w temperaturze 37C przez 24 godziny. Pomiary spektrofotometryczne wykonywano używając czytnika mikropłytek firmy BioTek Instruments. Absorbancję mierzono przy

godzinach inkubacji. Kontrolę negatywną stanowiła pożywka bez inokulatu. Kontrolę pozytywną stanowiła hodowla bakterii prowadzona w pożywce MRS o pH 6,5. Oznaczenia wykonywane były w trzech równoległych powtórzeniach.

Stopień tolerancji kwasu solnego wyrażono procentowo:

Procent tolerancji = ^{OD600 eksperymentalne}

OD₆₀₀ kontroli pozytywnej× 100

Gdzie:

OD600 kontroli pozytywnej – absorbancja hodowli bakterii fermentacji mlekowej w pH 6,5; OD600 eksperymentalne – absorbancja hodowli bakterii fermentacji mlekowej w pH 2,0 lub 3,0.

8.3.6.3. Określenie tolerancji soli żółciowych przez bakterie fermentacji mlekowej Ocenę wpływu soli żółciowych na przeżywalność badanych izolatów bakterii fermentacji mlekowej wykonano zmodyfikowaną metodą według Lin i in. [2007] z wykorzystaniem mikropłytek. Do badań przygotowano roztwór 2% żółci w bulionie MRS, oraz inokulat bakterii fermentacji mlekowej przygotowany według punktu 8.1.. W płaskodennych sterylnych 96-dołkowych mikropłytkach przygotowano dwukrotne rozcieńczenia 2% roztworu żółci bawolej stosując bulion MRS jako rozcieńczalnik, a następnie dodawano 100 µl zawiesiny bakterii. Ostatecznie stężenie żółci bawolej w hodowlach wynosiło 1,00%, 0,50% i 0,25%. Inkubację prowadzono w warunkach względnie beztlenowych w eksykatorze wysyconym CO2, w temperaturze 37ºC przez 24 godziny. Pomiary spektrofotometryczne wykonywano używając czytnika mikropłytek firmy BioTek Instruments. Absorbancję mierzono przy długości fali 600 nm (OD600) bezpośrednio po wykonaniu próbek oraz po 1,5; 3; 4,5; 6; 20 oraz 24 godzinach inkubacji. Kontrolę negatywną stanowiła pożywka bez inokulatu. Kontrolę pozytywną stanowiła hodowla bakterii prowadzona w pożywce MRS niezawierającej soli żółciowej. Oznaczenia wykonywane były w trzech równoległych powtórzeniach.

Stopień tolerancji soli żółciowych wyrażono procentowo:

Procent tolerancji = ^{OD600 eksprymentalne}

Gdzie:

OD600 kontroli pozytywnej – absorbancja hodowli bakterii fermentacji mlekowej bez obecności soli żółciowej; OD600 eksperymentalne – absorbancja hodowli bakterii fermentacji mlekowej z dodatkiem soli żółciowej.

8.3.7. Oznaczenie hydrofobowości komórek

Hydrofobowość powierzchni komórkowej określano na podstawie metodyki opisanej przez Taheri i in. [2009a] oraz Pérez-Sánchez i in. [2011]. 24 godzinne hodowle bakterii fermentacji mlekowej odwirowywano przez 5 minut przy obrotach 7500 rpm/min w wirówce Centifuge 5804R, Eppendorf AG. Następnie supernatant usuwano, komórki bakteryjne przemywano dwukrotnie buforem fosforanowym i zawieszono w roztworze soli fizjologicznej do otrzymania gęstości optycznej 0,5 przy 600 nm (OD600). Zawiesinę komórek bakterii przenoszono w ilości 3 cm3 do sterylnych probówek i dodawano 1 cm3 toluenu. Próbki wytrząsano przy użyciu wytrząsarki Vortex przez 90 sekund. Następnie probówki odstawiono na 15 minut w celu oddzielenia się faz. Próbkę badaną stanowiła pobrana faza wodna, której absorbancję mierzono przy długości fali 600 nm.

Hydrofobowość komórek została obliczona jako średni procentowy spadek gęstości zawiesiny izolatów bakterii fermentacji mlekowej (OD600) spowodowany adhezją mikroorganizmów do zastosowanego węglowodoru.

Procent hydrofobowości =^{OD600 przed zmieszaniem − OD600 po zmieszaniu}

OD₆₀₀ przed zmieszaniem × 100

Oznaczenia hydrofobowości komórek wykonywane były w trzech równoległych powtórzeniach.