6. Metodyka badawcza
6.2. Ocena właściwości przeciwutleniających ekstraktów
Oznaczenie ogólnej zawartości związków fenolowych przeprowadzono metodą spektrofotometryczną z wykorzystaniem odczynnika Folina-Ciocalteu [Singleton i Rossi 1965]. Mechanizm reakcji opiera się na przeniesieniu elektronu (SET). W czasie trwania reakcji powstaje anion fenolowy redukujący odczynnik Folina-Ciocalteu i w efekcie zachodzi reakcja barwna.
Do kolb miarowych o pojemności 10 cm3
pobrano kolejno: 5 cm3 wody destylowanej, 0,5 cm3 odczynnika Folina-Ciocalteu, 0,1 cm3 ekstraktu. Stężenie dodanego ekstraktu zostało wyznaczone doświadczalnie i było uzależnione od zawartości związków fenolowych. Po 3 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej do kolb dodano 1,5 cm3 20% roztworu węglanu sodu i uzupełniono wodą destylowaną do kreski. Po upływie 2 godzin wykonano pomiar absorbancji przy długości fali λ=725 nm. Zastosowany odnośnik wykonano analogicznie dodając zamiast ekstraktu etanol.
Równolegle przygotowano krzywą wzorcową zależności absorbancji roztworu przygotowanego z użyciem kwasu galusowego (GAE) od jego stężenia w roztworze. W kolbie o pojemności 100 cm3
odważono 0,05 g kwasu galusowego i uzupełniono alkoholem etylowym do kreski. Z roztworu pobrano 10 cm3 do kolby o pojemności 50 cm3, a następnie uzupełniono alkoholem etylowym do kreski (roztwór roboczy kwasu galusowego). Dalszy sposób postępowania był identyczny z wcześniejszym opisem (zamiast ekstraktu stosowano odpowiednio rozcieńczony roztwór roboczy kwasu galusowego). Ogólną zawartość związków fenolowych w ekstraktach wyznaczono na podstawie krzywej wzorcowej (wykres 2).
Wykres 2. Krzywa wzorcowa do oznaczania ogólnej zawartości związków polifenolowych ekstraktach w przeliczeniu na kwas galusowy (GAE)
y = 0,1103x R² = 0,9975 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 2 4 6 8 10
stężenie kwasu galusowego [µg/cm3]
Abs
o
rba
ncj
82
6.2.2. Oznaczanie właściwości przeciwrodnikowych w teście z rodnikiem DPPH
Badanie aktywności przeciwrodnikowej ekstraktów prowadzono według metody Sanchez-Moreno, Larrauri i Saura-Calixto [1998], z modyfikacją polegającą na zastosowaniu roztworu rodnika DPPH o stężeniu 0,0025 g/100 cm3
rozpuszczonego w metanolu, etanolu lub octanie etylu (roztwory robocze) w zależności od rodzaju badanego ekstraktu. Rodnik DPPH (2,2-difenylo-1-pikrylhydrazyl) jest stabilny w warunkach normalnych. W obecności przeciwutleniacza ulega redukcji, której towarzyszy zmiana barwy roztworu z fioletowej na żółtą oraz spadek absorbancji mierzonej przy długości fali λ=515 nm. Stężenie dodawanego ekstraktu oraz częstotliwość wykonywania pomiarów (30 sekund) zostały ustalone w sposób doświadczalny.
Do kuwety pobrano 2,4 cm3 roztworu roboczego DPPH oraz 0,1 cm3 ekstraktu, po czym zawartość kuwety wymieszano. Jako próbkę kontrolną zastosowano odpowiednio metanol, etanol lub octan etylu. Na podstawie otrzymanych wyników wyznaczono kinetyki reakcji próbek z rodnikiem DPPH podczas 10 minut inkubacji. Wyliczano procentową pozostałość rodnika DPPH zgodnie ze wzorem:
w którym:
– stężenie rodnika DPPH w roztworze roboczym,
– stężenie rodnika po czasie t inkubacji próbki (roztworu roboczego z ekstraktem). Stężenie rodnika w próbce w trakcie inkubacji wyznaczono na podstawie zmiany absorbancji.
W celu ujednolicenia wyników i możliwości ich porównania z rezultatami badań innych autorów przygotowano krzywe wzorcowe dla mieszaniny roztworu roboczego DPPH (2,4 cm3) i 0,1 cm3 roztworu Troloxu (zakres stężeń Troloxu 0-0,04 µmol/cm3 mieszaniny reakcyjnej) po 10 minutach inkubacji (wykres 3-5). W przypadku DPPH rozpuszczonego w metanolu liniowość stwierdzono do stężenia 0,02 µmol/cm3
mieszaniny reakcyjnej, a dla DPPH rozpuszczonego w etanolu i octanie etylu do stężenia 0,032 µmol/cm3
mieszaniny reakcyjnej.
83
Wykres 3. Krzywa wzorcowa do oznaczenia aktywności przeciwrodnikowej (DPPH rozpuszczony w metanolu)
Wykres 4. Krzywa wzorcowa do oznaczenia aktywności przeciwrodnikowej (DPPH rozpuszczony w etanolu)
Wykres 5. Krzywa wzorcowa do oznaczenia aktywności przeciwrodnikowej (DPPH rozpuszczony w octanie etylu)
y = 4009,4x R² = 0,9945 0 20 40 60 80 100 0,000 0,010 0,020 0,030 0,040
stężenie Troloxu [µmol/cm3]
% ub y tek ro dn ik a y = 2918,5x R² = 0,9904 0 20 40 60 80 100 0,000 0,010 0,020 0,030 0,040
stężenie Troloxu [µmol/cm3]
% ub y tek ro dn ik a y = 2714,4x R² = 0,9941 0 20 40 60 80 100 0,000 0,010 0,020 0,030 0,040
stężenie Troloxu [µmol/cm3]
% ub y tek ro dn ik a
84
6.2.3. Oznaczanie siły redukującej testem FRAP
Właściwości redukujące badanych ekstraktów oceniono na podstawie testu FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power), który opiera się na ocenie zdolności redukcji kompleksu żelaza Fe3+ - TPTZ (kompleks żelazowo-2,4,6-tripirydylo-s-triazyny) do kompleksu Fe2+ - TPTZ przez badaną substancję. Redukcji tej towarzyszy spadek absorbancji układu reakcyjnego, co mierzy się spektrofotometrycznie przy długości fali λ=593 nm.
Do oceny siły redukującej FRAP ekstraktów z oleju wykorzystano metodykę Benzie i Strain [1996] z modyfikacjami zaproponowanymi przez Szydłowska-Czerniak i in. [2008]. Do oznaczenia siły redukującej FRAP sporządzono mieszaninę reakcyjną zawierającą 10 mmol/dm3 roztworu TPTZ w 40 mmol/dm3 HCl, 20 mmol/dm3 FeCl3, 0,1 mol/dm3 buforu octanowego (pH=3,6) w proporcji 1:1:10. Do analizy pobrano 0,3 cm3 ekstraktu z próbek olejów, 2 cm3
mieszaniny reakcyjnej i uzupełniano wodą destylowaną do 10 cm3. Próbki mieszano, po czym pozostawiono na 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie próbki wirowano przez 10 minut i dokonywano pomiaru absorbancji wobec próbki kontrolnej (do kolby miarowej o pojemności 10 cm3 pobrano 2 cm3 mieszaniny reakcyjnej i uzupełniono wodą destylowaną do kreski).
Wartość FRAP (w mmol Troloxu/L oleju) poszczególnych próbek wyznaczono na podstawie krzywej wzorcowej (wykres 6), sporządzonej przy użyciu roztworu Troloxu, przygotowanego w zakresie stężeń 0-0,02 µmol/cm3
mieszaniny reakcyjnej.
Wykres 6. Krzywa wzorcowa do oznaczenia siły redukującej testem FRAP
y = 43,629x R² = 0,9984 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0,00 0,00 0,01 0,02 0,02
stężenie Troloxu [µmol/cm3]
Abs
o
rba
ncj
85
6.2.4. Pomiar fotochemiluminescencji (PCL)2
Metoda fotochemiluminescencji opiera się na połączeniu zjawiska fotochemicznego wytworzenia wolnych rodników oraz detekcji przy użyciu chemiluminescencji [Papadopoulos i in. 2003; Zielińska, Wiczkowski i Piskuła 2008]. W oznaczeniu luminol odgrywa podwójną rolę jako sensybilizator oraz czynnik reagujący z rodnikami. Fotochemicznie generowane aniony ponadtlenkowe (poprzez luminol ) są wychwytywane przez przeciwutleniacze obecne w próbce. Pozostała część niewygaszonych rodników w reakcji z luminolem wywołuje efekt chemiluminescencji [Navas i Jimenez 2007].
Pomiar fotochemiluminescencji (PCL) wykonano z wykorzystaniem aparatu Photochem®, zestawu ACL (zestaw odczynników do oznaczania pojemności przeciwutleniającej związków rozpuszczalnych w tłuszczach) oraz oprogramowania PCLsoft® (Analityk Jena AG, Niemcy). Oznaczenie przeprowadzono zgodnie z metodyką Popov i Lewin [1996] i instrukcją producenta aparatu [Analytik Jena AG manual 2005]. Próbki rozpuszczono w n-heksanie w stosunku 1:1 (V/V). W zależności od aktywności przeciwutleniającej próbki rozcieńczono n-heksanem.
Aktywność przeciwutleniającą próbek wyrażono w mmol Troloxu/L oleju dla poszczególnych próbek na podstawie krzywej wzorcowej (wykres 7), sporządzonej przy użyciu roztworu Troloxu przygotowanego w zakresie stężeń 0,5-3 nmol.
Wykres 7. Krzywa wzorcowa do oznaczenia aktywności przeciwutleniającej metodą fotochemiluminescencji
2
badania wykonano w Katedrze Technologii Żywienia Człowieka Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu
y = -0,0502x2 + 0,3913x - 0,0605 R² = 1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 0 1 2 3
stężenie Troloxu [nmol]
Inh
ibi
cj
86
6.3. Ocena zasięgu zmian jakościowych w próbkach oleju